专利名称：新城疫病毒抗体诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鸡新城疫病毒抗体的诊断试剂盒，属于动物传染病的诊断技术领 域。
背景技术：
鸡新城疫(Newcastle Disease, ND)是由副粘病毒科(paramyxovirus)副粘病毒 属鸡新城疫病毒引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，常呈败血性经过。主要特征是呼 吸困难、下痢、神经紊乱、粘膜和浆膜出血。本病传播快、死亡率高，被列为第一类严重的传 染病。回顾历史，新城疫在世界上曾造成过巨大的经济损失。一般认为鸡新城疫于1926 年首次暴发于印度尼西亚的爪哇和英国的纽卡斯尔艾佛顿1935年我国河南首次报道鸡新 城疫，20世纪50年代本病在全国各地广泛流行，本病为高度接触性传染性疫�。⒉〖保� 染率和死亡率均高，有时可高达100%，给养禽业特别是养鸡业造成了不可估量的经济损失， 因此被国际兽医局定为A类烈性传染病。新城疫实验室检测技术包括常规的分离鉴定是目前诊断新城疫最确切的方法， 并且可以给感染的毒株定性。血清学方法有血凝(HA)和血凝抑制实验(HI)、琼脂扩散实 验(AGP)、荧光抗体技术(FA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、中和试验(NT)、乳胶凝集试验 (LAT)、神经氨酸酶试验(NIT)、放射免疫试验(RIA)等。其中HA和HI是目前最常用的方 法。分子生物学方法RNA指纹图谱巷国、核酸探针技术、RT-PCR技术以及抗多肤抗体技术 等大量报道用于NDV检测，分子生物学方法因为灵敏度高、性好、能够区分强弱毒株，在NDv 的诊断和流行病学的普查方面颇具潜力。而HI效价水平的监测对认识鸡群新城疫的免疫水平和确定免疫时机有重要的指 导作用，但还必须正确对待抗体效价监测的诊断学意义。赵虎等研究发现HI效价在6以 上的个体仍能感染并排出强毒，究其原因可能是HI抗体水平与ND保护力两者之间的不一 致，应该看到，HI抗体滴度只是衡量鸡抵抗力强弱的一个比较容易检测到的、具有参考价值 的指标，但它只能检测到循环抗体水平(IgG)，而不能检测到呼吸道的抗体水平(IgA)，所 以它不是一个绝对安全的指标。在生产中，HI抗体水平的监测结果只能是作为参考，千万 不能认为HI抗体水平高，ND就不会发生。选用ND抗体检测的常规血清技术对于了解免疫 效果，制定免疫程序和诊断，防治该病具有十分重要的意义。虽然HI法用于检测ND抗体至 今仍被广泛使用，但是由于ELISA具有快速、准确、简便的优点，加之酶标读数仪一体化技 术在ELISA中的应用，使其更加完善，ELISA已越来越多的被实验室采用。鉴于新城疫对 养禽业的�：Γ刂菩鲁且呔哂兄卮蟮木靡庖濉Ｃ庖呓又忠殉晌刂菩鲁且咦钪饕氖� 段，但免疫鸡群却依然经常发生新城疫，其中最主要原因是免疫程序不合理、缺乏免疫抗体 监测条件，不能根据疫情和疫区发病特点适时调整免疫程序。合理的免疫程序的制定、良好 的抗体监测是目前预防和控制鸡新城疫最关键的环节，这有赖于敏感、特异、快速的抗体检 测技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新城疫病毒抗体诊断试剂盒。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了 一种鸡新城疫病毒抗体诊断试剂 盒，包括10倍浓缩洗涤液，血清稀释液，标准血清，抗鸡IgG酶标抗体，酶标抗体稀释液，显 色剂A，显色剂B和终止液。所述的浓缩洗涤液为PBST，其含0. 05%Tween-20的PBS溶液。所述的血清稀释液为1 %的BSA溶液。所述的标准阳性血清为用LaSota疫苗株免疫后得到完全保护的鸡血清，标准阴 性血清为从未用过疫苗且抗体水平接近阴性血清平均值的鸡血清。所述的酶标抗体稀释液为PBS缓冲液。所述的显色剂A组成为底物0PD —片、底物缓冲液。所述的显色剂B为H202。所述的终止液2M的H2S04。本发明的试剂盒是将检测血清样品进行预处理后，与包被好的抗原相结合，利用 酶标记的抗体与待检血清样品中的抗原或抗体特异性结合后，在底物溶液参与下显色进行 检测，其中，抗原包被液为纯化的鸡新城疫病毒。本发明在于提供一种灵敏的、特异的用于鸡新城疫病毒抗体临床诊断及疫苗免疫 后的监测工作服务的试剂盒。本发明的试剂盒设计的方法由包被抗原酶标板和ELISA工 作条件的确定组成，包括运用醛化的鸡红细胞经吸附释放方法纯化病毒和方阵法滴定选择 包被抗原、酶标抗体等反应物的最佳工作浓度。采用本发明可以对鸡新城疫病毒抗体检测 的ELISA方法试剂盒，所建立的方法具有特异性、灵敏度及可操作性。在敏感度试验方面， 与免疫荧光技术方法符合率为86%，且比免疫荧光技术方法更敏感，在其他病原的检出率为 零，该方法较HI更具有快速、成本低廉，结果易于判定的优点，可用于鸡新城疫病毒的诊断 和监测。
具体实施例方式本发明的试剂盒具体组成如下 1材料
1. 1参考血清标准阳性血清为用LaSota疫苗株免疫6周龄的小鸡，2周后采血分离血 清，用HI实验测定HI效价为1:1024 1:2048，分装后_80°C保存。阴性血清为从未用过 疫苗且抗体水平接近阴性血清平均值的鸡血清。1.2 ELISA反应板为丹麦Nunc公司产品，兔抗鸡的酶标抗体、底物0PD为Sigma公
司广品。1.3实验动物SPF鸡及鸡胚，均为梅里亚公司产品。2抗原的制备
2.1病毒的复壮与增殖将Lasota疫苗株进行100倍稀释，接种于9-11日龄SPF鸡胚 复壮，每胚0. 1ml，38°C孵育，每日照蛋两次连续5日，弃去24小时内死亡的鸡胚，收获死亡 的鸡胚，无菌收获尿囊液，连续传代3代测定HA值，-20°C保存作为提纯病毒用。
2. 2病毒纯化应用醛化的鸡红细胞经吸附释放方法获得纯化的病毒将SPF鸡 新鲜抗凝红细胞用PBS液洗涤3次，配制成25%的红细胞悬液200 mL,置于锥形瓶中 ，然后将含有50mL 38%甲醛溶液(pH 5. 5 6. 0)的透析袋放入锥形瓶，室温下缓慢搅 拌2 h;刺穿透析袋使甲醛溶液混入细胞悬液，继续搅拌12 h;细胞悬液用100目铜网 过滤，滤液用PBS洗涤3次，加入0.2 mol /L的Tris -甘氨酸缓冲液悬浮沉淀细胞 ，再加入硼氢化钠溶液至1 mmol /L;用PBS洗涤3次，配成25%的细胞悬液，加入0 .01%硫柳汞防腐，并与8 000 Xg离心10 min,病毒上清液配成终浓度5%，4 °C磁 力搅拌1 h，l 000 Xg离心10 min后，分别收集上清和沉淀①沉淀中加入5%NaCl 溶液(pH 6. 8)作用30 min,离心后收集上清；②上清用HA检测血凝价，如果病毒吸 附量低于90%，可进行再次吸附，按步骤①重复1次。将两次所得上清合并，加入1% Triton X 100作用30min，透析除盐即为ELISA抗原。测定蛋白含量为3. 01mg/ml。3 ELISA工作条件的确定
3. 1抗原最佳稀释度的测定将不同稀释倍数的抗原包被酶标板，将标准阴、阳性血 清各一份梯度稀释后进行ELISA实验，测得不同条件下的P / N值。结果表明，当抗原做40 倍稀释，血清作1倍、5倍、10倍稀释时P / N值均较大(P / N值分别为5. 1、5.32、5.53)， 因此选择40倍稀释做为抗原的最佳稀释度。3.2血清与酶标二抗稀释倍数的选择将标准阴阳性血清分别作1倍、5倍、10倍 及20倍梯度稀释，将酶标二抗从2500倍开始做倍比稀释进行方阵实验，当酶标二抗稀释倍 数为1 :2500 1 :5000时。阳性血清的0D值为1. 0左右，阴性血清的0D值在0. 2左右，因 此选择酶标二抗的工作浓度定为1 :2500，血清做5倍稀释。3.. 3封闭剂的选择用不同浓度的明胶、BSA及脱脂奶粉的PBS溶液作为封闭液 的检测结果表明BSA溶液的封闭效果好于不同浓度的脱脂奶粉溶液和明胶溶液。随着所 试BSA溶液浓度的提高，阴阳性血清的0D值均下降，但P / N值不断升高。当以1%BSA溶 液封闭时P / N最高(P / N*7.76)；明胶溶液作为封闭剂时阴阳性血清0D值均较高，存 在非特异性反，故确定BSA溶液作为封闭剂。3.4血清稀释液的选择实验比较了 5%脱脂奶粉溶液、10%脱脂奶粉溶液以及 浓度分别为0. 5% BSA溶液、BSA溶液作为血清稀释液的作用效果，结果表明.BSA溶液 做为血清稀释液效果好于脱脂奶粉溶液，随脱BSA液浓度的提高P / N值升高.当BSA溶 液浓度为时P / N值为8. 27，实验确定以1%BSA溶液作为血清稀释液。3. 5阴阳性血清临界值的确定用间接ELISA对120份阴性血清进行检测，用 SPSS软件统计分析，阴性血清的0D490值呈正态分布，平均值(X)为0. 126，标准差(SD)为 0. 037，最小值为0. 057，最大值为0. 19。X+3XSD=0. 237即为阴阳性血清的临界值，为了降低假阳性或假阴性结果，在此基 础上再加上和减去一个标准差作为可疑值区间，得到ELISA的可疑值范围为0. 2 0. 274。3.6抗原包被板的保存期确定将抗原包被板分别在4°C保存0月、1个月、2个 月、3个月、4个月、5个月，取不同保存时间的抗原板，对16份不同0D值的血清样品进行 ELISA检测，比较判定结果的变化来确定保存时间对试剂盒稳定性的影响。结果显示，阴阳 性血清的0D值虽略有变化，但样本血清的阴阳性判定结果变化不明显。4试剂盒的组成的制备4. 1 10倍浓缩洗涤液PBST (含0. 05%Tween-20的PBS溶液) 4.2 血清稀释液BSA溶液 4. 3 标准血清自制的标准阴阳性血清 4. 4 抗鸡IgG酶标抗体购置Sigma公司产品 4. 5 酶标抗体稀释液PBS缓冲液 4.6 显色剂A 底物0PD—片、底物缓冲液 4. 7 显色剂B :H202 4. 8 终止液2M的H2S04 5操作步骤 从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。
加标准品和待测样本分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位 置，在标准品孔中加入标准阴阳性血清各50 y L ；待测样本孔中先加入待测血清lOy L，再 加血清稀释液40yL (即稀释5倍)；空白对照孔不加。
温育37 °C水浴锅或恒温箱温育60min。洗板将孔中的液体用力甩净，在吸水纸上拍干，每孔加洗涤液200 Ul，静置 lmin，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。加酶标工作液每孔加入酶标工作液50 U L，空白对照孔不加。温育37 °C水浴锅或恒温箱温育30min。洗板同上洗板步骤。显色每孔先加入显色剂A液50 u L，再加入显色剂B液50 u L，平板混勻器混勻 30s (或用手轻轻震荡混勻30s)，37°C避光显色15min。终止取出酶标板，每孔加终止液50 u L，终止反应(颜色由蓝色立转黄色)。测定以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值(0D 值)。6结果判定
根据0D49(I值计算P/N值。P/N = (P为阳性对照血清及待检血清的0D值，N为阴性对 照血清的0D值)当P/N值≥4时实验成立。然后，根据S/N值对待检血清进行判定(S为待 检血清的0D49Q值)。结果阴性S/N≤ 1.3 ；可疑1.3 < S/N ≤ 1.9 ；阳性S/N> 1.9。
权利要求
一种鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于包括10倍浓缩洗涤液，血清稀释液，标准血清，抗鸡IgG酶标抗体，酶标抗体稀释液，显色剂A ，显色剂B和终止液。
2.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于所述的浓缩洗 涤液为PBST，其含0. 05%Tween-20的PBS溶液。
3.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于所述的血清稀 释液为的BSA溶液。
4.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于所述的标准阳 性血清为用LaSota疫苗株免疫后得到完全保护的鸡血清，标准阴性血清为从未用过疫苗 且抗体水平接近阴性血清平均值的鸡血清。
5.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于所述的酶标抗 体稀释液为PBS缓冲液。
6.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于所述的显色剂A 组成为底物OPD —片、底物缓冲液。
7.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于所述的显色剂B 为 H2O2O
8.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于所述的终止液 2M 的 H2S04。
9.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于试剂盒为将检 测血清样品进行预处理后，与包被好的抗原相结合，利用酶标记的抗体与待检血清样品中 的抗原或抗体特异性结合后，在底物溶液参与下显色进行检测，其中，抗原包被液为纯化的 鸡新城疫病毒。
全文摘要
本发明涉及一种鸡新城疫病毒抗体诊断试剂盒，包括10倍浓缩洗涤液，血清稀释液，标准血清，抗鸡IgG酶标抗体，酶标抗体稀释液，显色剂A，显色剂B和终止液。采用本发明可以对鸡新城疫病毒抗体检测的ELISA方法试剂盒，所建立的方法具有特异性、灵敏度及可操作性。在敏感度试验方面，与免疫荧光技术方法符合率为86%，且比免疫荧光技术方法更敏感，在其他病原的检出率为零，该方法较HI更具有快速、成本低廉，结果易于判定的优点，可用于鸡新城疫病毒的诊断和监测。
文档编号G01N33/558GK101995466SQ20101051342
公开日2011年3月30日 申请日期2010年10月21日 优先权日2010年10月21日
发明者吴红云, 李建正, 范金红 申请人:郑州后羿制药有限公司
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