专利名称：荧光量或吸光量的测定方法及测定装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定由试样产生的荧光的量及被试样吸收的光的量的荧光量或 吸光量的测定方法及测定装置。更详细地说，涉及下述的荧光量测定方法以及荧光量测定装置，S卩，将为了荧光测 定而向试样照射的激励光，标准化为“可溯源至国家标准且每单位面积上为指定光量”的 值，由此，作为“可溯源至国家标准的每单位面积的光量”，定量地测定由试样产生的荧光 量，而不是如现有技术那样的比(比例值)。相同地，涉及下述的吸光量测定方法以及吸光量测定装置，S卩，将吸光测定中向试 样照射的照射光，标准化为“可溯源至国家标准且每单位面积上为指定光量”的值，由此，作 为“可溯源至国家标准的每单位面积的光量”，定量地测定由试样吸收的吸收光量，而不是 如现有技术那样的比(比例值)。
背景技术：
作为读取DNA微矩阵的装置，已知微矩阵扫描仪。使用微矩阵扫描仪，向DNA微矩 阵照射激光，通过一边扫描DNA微矩阵的图像一边读入，从而可以将目标分子的荧光量分 布作为二维图像而测定。专利文献1 日本特开2004-333333号公报专利文献2 日本特开2004-191232号公报
发明内容
但是，在上述微矩阵扫描仪中，由于向DNA微矩阵照射激光，一边利用PMT (光电倍 增管fhotomultiplier)进行电流放大，一边测定从试样(目标分子)产生的荧光，所以在 受光单元的线性及放大率的稳定性上存在极限，难以得到与向试样照射的激励光量精度高 的相干系数。因此，测定的荧光量通常以任意单位表示。以下，将利用该PMT等受光器进行 受光并测定的荧光量称为读取值。另外，由于对于激光等激励光的测定条件没有校正手段，所以对于读取荧光量分 布而得到的二维图像，即使可以进行1个画面内的相对测定，也无法对多次测定或对不同 机体间的读取值进行直接比较。另外，通常对于微矩阵扫描仪的测定装置，没有测定精度及再现性的规定，即使是 相同制造商的同一机型，也无法保证测定相同试样时的读取值为相同的值。即，存在本质上 的机器差异。当然，在不同的制造商之间，无法保证以相同的方式测定相同试样时的读取值相 同。SP，难以实现跨越制造商的测定标准化。SP，没有像电气·机械系统中采用电压[V]或 长度[m]等单位系统那样使用可溯源至国家标准的绝对的单位系统。因此，在现有技术中，采用相对测定法，即，将作为比较对象的标准物质(控制物 质)和试样同时进行测定，检测该标准物质和试样的测定值的比。
但是，在使用该标准物质的相对测定法中，存在下述课题。la)由于标准物质的流通而限制测定标准化。lb)作业时间及作业成本升高，以及由于标准物质的不稳定性而导致测定品质降 低。另一方面，激励光等光量一样的光，可利用光电二极管等以可溯源至国家标准的 方式测定，但只能得到非图像的0维的点数据。与此相对，在日本特开2004-191232号公报中，公开了将照相机的亮度值校正为 国家标准的光能量[W]的方法。由此，可以针对拍摄的图像的每个像素而得到可溯源至国 家标准的光能量的光量值(以下，称为“图像能量测量仪”)。即，可以测定试样的空间分布。但是，在这里公开的仅是受光侧的结构，对于激励光的具体的校正方法没有记载。 另外，与测定系统相关的计算式没有公开。本发明的目的在于，将为了荧光测定向试样照射的激励光，标准化为“可溯源至国 家标准且每单位面积上为指定光量”的值，由此，作为“可溯源至国家标准的每单位面积的 光量”，定量地测定由试样产生的荧光量，而不是现有技术那样的比(比例值)。相同地，将吸光测定中向试样照射的照射光，标准化为“可溯源至国家标准且每单 位面积上为指定光量”的值，由此，作为“可溯源至国家标准的每单位面积的光量”，定量地 测定由试样吸收的吸收光量，而不是现有技术那样的比(比例值)。对此，更具体地说，可以达到以下的作用效果。(1)利用具有可溯源至国家标准的光量单位的绝对值，进行此前只能相对地进行 比较的荧光量及吸光量的评价，从而可以实现对多次测定及对不同测定器机体间的读取值 进行直接比较。由此，可以实现标准化。(2)作为装置，只要一次确定试样的物质量与读取值之间的关系，就可以进 行试样的测定，不需要“为了校正装置而在每次测定时都利用标准物质生成标定曲线 (calibration curve)^0(3)通过使用照相机作为受光元件，不仅可以得到0维的点信息，还可以从二维的 照相机图像本身中得到每个像素的光量，相同地，通过以具有可溯源至国家标准的光量单 位的绝对值对图像的每个像素进行表示，可以定量地测定试样的空间分布。在本发明的荧光量测定方法中，向试样(荧光分子)照射激励光，经由受光光学系 统，利用受光元件测定从该试样产生的荧光，其特征在于，具有下述步骤向所述试样照射 激励光的步骤，该激励光具有可溯源至国家标准且在试样表面的每单位面积上为预先指定 的光量值；经由所述受光光学系统，利用所述受光元件测定从所述试样产生的荧光的步骤； 以及基于所述每单位面积上的指定激励光量、所述受光光学系统的光学系数以及所述受光 元件的受光系数，对由所述受光元件测定的荧光量进行运算，从而作为可溯源至国家标准 的每单位面积上的光量值而进行计算的步骤。根据该荧光量测定方法，可以将从试样产生的荧光量，作为“可溯源至国家标准的 每单位面积的光量”例如由[W/m2]构成的单位系统的输出值而定量地导出，而不是如现有 技术那样的激励光量和荧光量的比即比例值。另外，本发明的吸光量测定方法，向试样(吸光分子)照射照射光，经由受光光学 系统，利用受光元件测定由该试样吸收后的透过光，其特征在于，具有下述步骤经由所述受光光学系统，利用所述受光元件测定照射光的步骤，该照射光具有可溯源至国家标准且 在试样表面的每单位面积上为预先指定的光量值；将所述照射光向所述试样照射的步骤； 经由所述受光光学系统，利用所述受光元件测定由所述试样吸收后的透过光的步骤；以及 基于所述每单位面积上的指定照射光量(吸收前的光量值)、所述受光光学系统的光学系 数以及所述受光元件的受光系数，对由所述受光元件测定的透过光量进行运算，从而作为 可溯源至国家标准的每单位面积上的吸光量值而进行计算的步骤。根据该吸光量测定方法，可以将由试样吸收的光量，作为“可溯源至国家标准的每 单位面积的光量”例如由[W/m2]构成的单位系统的输出值而定量地导出，而不是如现有技 术那样的激励光量和荧光量的比即比例值。此时，激励光或者照射光作为“每单位面积上为预先指定的光量值”而事先设定。 例如，设定为l[W/m2]。另外，受光光学系统的光学系数以及上述受光元件的受光系数是装 置固有的装置系数。另一方面，在荧光测定中，荧光物质的量由激励光量和荧光量的比表示，在吸光测 定中，吸光物质的量由照射光量和吸光量的比表示。因此，在荧光测定中，通过将激励光量标准化，由此仅通过测定荧光量，就可以进 行与物质的量对应的测定。另外，在吸光测定中，测定透过光量，然后从预先存储的吸收前的照射光量值中减 去该透过光量，就可以计算本次测定的分子的吸光量。因此，在吸光测定中，通过将照射光量标准化，由此仅通过测定透过光量，并使用 预先存储的吸收前的照射光量值进行运算，就可以进行与物质的量对应的测定。在现有的荧光测定中，由于荧光物质的量为激励光量和荧光量的比，在吸光测定 中，吸光物质的量为照射光量和吸光量的比，为无量纲参数，所以无法实现“可溯源至国家 标准”的赋值。但是，通过将其分割为激励系统和受光系统，可以分别进行l[W/m2]、X[W/m2]等 “可溯源至国家标准”的校正。在本发明中，这是可以进行跨越设备差异或制造商的标准化的第一要点。S卩，激励光量或者照射光量，可以如后述所示分别作为“可溯源至国家标准的每单 位面积的光量”，而利用光能量测量仪等保证精度。另外，受光元件也相同地，可以利用光能量测量仪等保证精度。在此情况下，即使在测定的激励光量不是真正为1 [W/m2]的情况下，只要在不引起 荧光的退色或饱和问题的范围内，也可以将受光的荧光量的读取值换算为“标准激励光量” 而进行校正、输出。例如，在荧光的激励光强5%的情况下，一边将零点准确地校正，一边将读取值减 小5%而进行输出。在此情况下，由于保持激励/荧光比的“比例”，读取值成为与真正的“标 准激励光量”的情况下的“物质的量”相等的值，所以在读取值的“标准化”中，只要在精度 内就不产生问题。如上述所示，通过将“标准激励光量”或者“标准照射光量”预先作为规则而设定， 由此，仅利用与受光光量相当的读取值，就可以作为与物质的量对应的测定值而进行标准 化处理。这里是本发明的第2要点。
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此外，在此情况下，是否将标准化的读取值直接赋值为实际的物质的量即分子数 或摩尔数，即，是否进行准确的物质的量的校正，根据用途的不同而分开使用即可。并不限于微矩阵扫描仪，通常为了根据荧光量或吸光量而测定物质的量(重量)， 要事先使用标准物质，测定校准曲线，通过使从实际的试样中得到的光量与其校准曲线吻 合，从而进行物质的量的测定。此时，在荧光测定的情况下，“激励光量和荧光量的比”与“荧光物质的量”对应，在 吸光测定的情况下，“照射光量和吸光量的比”与“吸光物质的量”对应。另外，通常在理学设备中，大多情况下是在每次测定时利用标准物质对装置或试 样的处理等的状态进行校正。例如，在测定血液试样内的A成分的情况下，利用始终稳定且可测定的B成分，判 定该血液是否贫血或是否不适合利用药剂进行测定。以下，在如上述所示利用内部标准物 质校正试样的波动的情况下，将标准物质称为内部控制。另外，在对试样进行放大或过滤处理的情况下，在放大前，向试样中混合C物质， 通过将处理后的C物质的量与试样同时测定，从而可以确认中途的处理是否准确地进行。 以下，在如上述所示利用外部标准物质校正试样处理的波动的情况下，将标准物质称为外 部控制。另外，在测定装置中存在不稳定性的情况下，准备荧光量的基准物质，在测定试样 前或者之后，测定该荧光量基准物质的光量，对测定装置的光量进行校正。以下，在如上述 所示利用荧光量基准物质校正测定装置的波动的情况下，将标准物质称为参考物质。如果将以上内容进行总结，则可知标准物质大致存在两个方面的作用。1)在荧光测定的情况下，计算由“激励光量和荧光量的比”和“荧光物质的量”表 示的“光量比(比例值)”和“物质的量”的对应系数，在吸光测定的情况下，计算由“照射 光量和吸光量的比”和“吸光物质的量”表示的“光量比(比例值)”和“物质的量”的对应 系数。2)对试样、试样处理、或者测定装置的波动进行校正。另外，可以考虑将2)项进一步分为3个种类。2a)利用内部标准物质校正试样的波动(内部控制物质)。2b)利用外部标准物质校正试样处理的波动(外部控制物质)。2c)利用参考物质校正测定装置的不稳定性。其中，2c)所示的“利用参考物质校正测定装置的不稳定性”是本发明的课题之一。 在当前的电气·机械系统的测量器中，不是在每次测定时利用参考物质进行校正。使用参 考物质，则作业时间或作业成本升高，由参考物质的不稳定性引起品质降低，另外，难以实 现测定标准化。因此，期望可以在没有参考物质的状态下准确地测定。另外，即使在由于试样中存在波动，或试样处理中存在波动，而必须使用内部控制 或外部控制的情况下，如果测定器自身不稳定，则也无法测定该试样的波动及试样处理的 波动。在此情况下，无法得到用于作为前工序的试样品质管理、试样处理品质管理、或者 进行试样处理的工序改善的数据。S卩，如果可以使测定装置稳定，不需要参考物质，则可以期待下述效果
3a)可以使用内部标准物质，测定试样的波动。由此，在下一个阶段中，可以将该测 定数据用于试样的品质管理中。3b)可以使用外部标准物质，测定试样处理的波动。由此，在下一个阶段中，可以将 该测定数据用于试样处理工序的品质管理·工序改善中。3c)不需要在测定试样前或者之后进行的、通过荧光量基准物质进行的测定装置 的光量校正作业。在本发明中，由于研究出不需要参考物质的校正方法，所以可以确认测定装置是 否稳定。由此，可以开发稳定的测定装置，通过该稳定的测定装置和校正方法，可以期待上 述3a 3c的效果。这意味着可以实现·减少由上述2c)的参考物质进行的校正 通过减少上述2a)的试样波动，而减少由内部标准物质进行的校正次数 校正量·通过减少上述2b)的试样处理的波动，而减少由外部标准物质进行的校正次
数·校正量。另外，对于1)的计算“光量比(比例值)”和“物质的量”的对应系数，可以按照后 述方式，通过将照射光和吸光量值等变换为可溯源至国家标准的Sl单位系统的值，从而利 用吸光量和吸光系数以及装置的各种常数等，在理论上计算“光量比(比例值)”和“物质 的量”的对应系数。即，如果在测定前已知各种条件下的物质的吸光系数及装置的各种常数 等，则不需要在每次测定时求“光量比(比例值)”和“物质的量”的对应系数。通常，物质的吸光系数由于温度及PH等而容易变化。本来，在此情况下，只要利 用该新的条件进行一次测定，则以后不需要再次测定。在现有技术中，由于“装置的各种常 数”不稳定而变化，所以结果是，需要在每次测定时进行标准物质的再校正。但是，如果是本 发明的装置，则激励光和受光侧分别独立，可以以可溯源至国家标准的方式，稳定地进行校 正。因此，由于装置的各种常数稳定，所以只要利用新的条件进行一次测定，则在精度内不 需要再次测定。这意味着可以实现·减少用于上述1)的计算“光量比(比例值)”和“物质的量”的对应系数的测定 的次数。
图1是表示使用本发明的荧光量测定方法，通过荧光光量进行荧光分子数分布测 定的试样测定装置的光学配置等的结构的图。图2是表示照相机的校正流程的图。图3是对利用照相机读取的图像进行例示的图。图4是表示关于激励光的测定的概念的图。图5是表示Cy5_dUTP的实际测量分子数的图。图6是激励波长效率的说明图。
具体实施例方式下面，参照图1 图6，说明本发明的荧光量测定方法的实施方式。〔实施例1〕在本实施例中，说明将本发明的荧光量测定方法应用于“通过荧光光量进行荧光 分子数分布的测定”中的例子。图1是表示用于进行荧光测定的试样测定装置的光学配置等的结构的图。如图1所示，来自光源1的激励光2，利用分色镜3进行反射，照射试样4的整个区 域。来自试样4的荧光5，透过分色镜3而向受光光学系统6入射，在照相机7的拍摄面上形 成试样4的像。另外，在照相机7上，连接有执行后述的一系列处理的运算装置8。运算装置 8作为理论光量计算单元、光量测量单元、物质量计算单元、以及分子数计算单元起作用。在将本发明的荧光量测定方法应用于通过荧光进行荧光分子数分布测定(荧光 测定)中的情况下，例如通过依次执行以下的4个步骤，可以测定试样上的荧光量和荧光 分子数的空间分布。此外，以下的所谓“测定面积”，如后述所示，表示照相机的1个像素或 1 μ m2等、作为与光轴呈直角方向的空间测定面积的1个单位。a)照相机系数和试样的激励光量[W/m2]的测定测定试样测定装置中使用的照相机系数[W -s/mVLSB]、和实际向试样照射的激励 光的每单位面积的激励光量[W/m2]，准备试样测定装置。b)单分子的理论荧光量[W]的推定利用测定对象荧光分子的摩尔吸光系数ε、量子效率、激励波长效率、以及激励光 量[W/m2]，推定(计算)“单分子的理论荧光量[W]”。c)试样的每个测定面积的荧光量[W]的测定根据实际拍摄试样的照相机的像素的读取灰度等级值[LSB]、读取的累积时间 [s]、以及照相机系数[W· s/m2/LSB]，测定指定像素中的“试样的每个测定面积的荧光量 [W]”。该荧光量是可溯源至国家标准的值。d)每个测定面积的试样分子数的测定用由上述步骤C)测定的“试样的每个测定面积的荧光量[W]”除以由步骤b)得到 的“单分子的理论荧光量[W]”，可以测定(推定)“每个测定面积的试样分子数”。下面，示出荧光测定的情况下的具体的运算内容。a)照相机系数和试样的激励光量[W/m2]的测定测定试样测定装置中使用的照相机系数[W -s/mVLSB]、和实际向试样照射的激励 光的每单位面积的激励光量[W/m2]，准备试样测定装置。al)通过照相机的校正而确定照相机系数Kc照相机系数Kc是日本特开2004-191232号公报所示的照相机固有的校正值，是 随着测定波长的不同而不同的值，但具体的内容在日本特开2004-191232号公报中没有公 开。照相机系数Kc通过以下的方法求出。图2是表示照相机的校正顺序的图。al. 1)基准发光源的校正光量通过专用的光量测定装置(光能量测量仪)测定。如图2(a)所示，首先，准备LED或者光能量及波长稳定的激光源等基准发光源11， 通过受光光学系统6，使基准发光源的全部光量入射至可溯源至国家标准的光能量测量仪
812，测定该全部光量Isl [W = J/s]。al. 2)照相机的校正然后，仅将光能量测量仪12更换为照相机7，相同地，经由受光光学系统6，使 基准发光源11的全部光量向照相机7入射。照相机7的读取值(灰度等级值)D[LSB]， 与入射的光量[W = J/s]和积分时间t[s]成正比。在这里，灰度等级值D由LSB(Least Significant Bit ;A/D变换时的最下位比特值)的整数倍表示，在这里，作为灰度等级值的 单位使用‘LSB，。例如，16bit的全部灰度等级值由0 65535LSB表示。此外，作为灰度等 级的单位，有时也使用‘digit’。如上述所示，由于照相机7的读取值(灰度等级值)D[LSB]与入射的光量[W = J/ s]和积分时间t[s]成正比，所以如果灰度等级不饱和，则用对应的受光像素全体的合计值 D1[LSB]除以照相机7的积分时间t[s]而得到的值，与上述光量Isl [W]成正比。将该变换 系数设为Kl。由于照相机7以取得图像为目的，所以所有像素具有大致相同的从入射光量向灰 度等级变换的变换系数。该变换系数Ki大致是它们的平均值。因此，在向照相机7入射基准发光源像的全部光量的情况下，如果进行校正作业 以使光向照相机7的入射面整体平均地入射，则即使存在光量的不均勻，只要灰度等级没 有饱和，也可以得到来自基准发光源的整体的光量。此时，对于光没有照射到的像素，可以应用该校正方法自身使用图像这一点，从该 图像中将灰度等级值为零的像素除去。例如如图2(c)所示，在向照相机7的芯片面照射光 束A时，B的部分没有被照射光束而灰度等级值为零的情况下，将该B的像素群除去而进行 校正。另外，即使在中央较强而周边接近零灰度等级的情况下，由于只要不饱和，就具有 线性特性，所以系数几乎不变化。通常照相机7具有在相当于8 16Bit的分辨率下使用的性能，可以确保各像素 的均等性。因此，虽然依赖于最终的测定精度，但如果可以对几十至几百万像素的照相机的 例如超过半数的像素确认上述K1，则可以认为其余的像素也具有相同的照相机系数。此外， 利用该光所照射的像素，计算后述的“向照相机7入射的基准发光源像的面积” Sl [m2]。另外，如图2(b)及(c)所示，即使在照相机7的像素71 (受光部a)之间存在非受 光部g的情况下，同样也可以通过使光向照相机7的入射面整体平均地入射，从而将非受光 部g的损失作为变换系数Kl的一部分而进行校正。S卩，在照相机7的受光面上，将用于分隔像素71的非受光部(间隙)g设置在像素 之间。校正用的光束也向这里照射。存在下述担心，即，例如在图2(b)中，实质上受光部的 面积为90%的情况下，产生光损，从而在相对于最初的光能量测量仪的值的校正中产生错误。但是，通常像素的大小为几ym 几十μ m，与此相对，光束直径具有接近芯片面 积整个区域的几mm的大小。即，在该校正方法的情况下，校正时的光束向像素的受光部、非 受光部大致均勻地照射。这接近实际上照相机测定被摄体的条件。即，如果由受光部a和非受光部g确定的受光效率为90%，则效率是通过将该受 光效率与像素所具有的光电变换效率相乘而得到的，所以在上述校正的同时已经得到了校正。即，由像素之间的间隙等非受光部产生的光损失，不会造成校正误差。Isl = KlXDl/tl [W = J/s]另外，如果将基准发光源11的大小(向照相机7入射的基准发光源像的面积)定 义为Sl [m2]，则每单位面积的光量Pl可以按照下述方式进行定义。Pl = Isl/Sl [ff/m2]= KlXDl/tl/Sl [LSB/s/m2]在这里，照相机系数Kc由以下的式子定义。Kc = K1/S1 [W · s/m2/LSB]因此，如果使用该Kc，则上述式为Pl = KcXDl/tl [ff/m2]通用化后为Px = KcXD/t[ff/m2] (1)在这里，Kc 照相机系数[W · s/m2/LSB]t 测定时的累积时间[s]D 灰度等级值[LSB]。使用该式(1)，根据照相机7的读取值，可以得到可溯源至国家标准的光量值。此 时，重要的不是通常的光能量测量仪这种单纯的[W]的值，而是作为[W/m2]而得到的值。图3中例示由照相机读取的图像。在得到如图3所示的图像的情况下，根据一个 像素中每单位时间进来几个光子，而确定作为入射能量的[W]。此时，一个像素的长度x[m] 也成为确定光量值的重要要素。S卩，照相机系数Kc中，[1/m2]表示本测定不仅应用照相机所具有的光量测定功能， 而且还应用像素的“长度”的测定功能。此外，在按照后述方式，进行“光量分布的测定”的情况下，必须引入“每个测定面 积(像素等)的光量值[W]”的概念。在此情况下，通过将根据该照相机系数Kc得到的、对 应于[W/m2]这一“照度”的值，与“测定面积”(像素面积等)相乘，从而可以计算实际向1 个像素中入射的能量[W]。a2)激励光的测定激励光通过专用的光量测定装置(光能量测量仪)测定。图4是表示关于激励光的测定的概念的图。该光能量测量仪的受光部，可溯源至 国家标准，以[W]为单位测定向其入射部的光圈内入射的全部光量。因此，测定光量、如 以下所示。Itl=(ScZSa)XIa [W](2)在这里，Ia:光圈入射光量[W]Sa 光圈面积[cm2]。为了进行准确的测定，可以使该激励光的测定区域尽可能与所测定的区域一致。b)单分子的每个测定面积的理论荧光量[W]的推定通过测定对象的荧光分子的摩尔吸光系数ε、量子效率、激励波长效率、以及激励
10光量[W/m2]，推定(计算)“每个测定面积的单分子的理论荧光量[W]。由于在通常的荧光测定中使用充分稀薄的溶液，所以该情况下的条件为eCL << 1。在这里，ε 摩尔吸光系数，C:处于基底状态的荧光分子的摩尔浓度，L 试样中的 光路长度。bl)吸光量的推定根据朗伯-比尔(Lambert-Beer)法则，吸光量如下所示。Δ 1 = 2. 303 X IO3X ε X (I0/S0) Xn0/NA [W] (3)在这里，Δ1:吸光量[W]ε 摩尔吸光系数[M-1CnT1 = L/mol/cm]…使用常用对数用的系数Ici 激励光量[W] OStlS。激励面积[cm2]n0 激励面积内的荧光分子数Na 阿伏伽德罗常数 6. 0221415X IO23在这里引入“测定面积”。所谓测定面积，表示照相机的像素面积或IP m2单位面 积等希望评价分子数的区域的面积。在本测定中，作为单位以[m2]表示，但也可以是其他 单位。Sm:测定面积[m2]本测定中的“荧光分子数nm”，是每个该“测定面积S/内的分子数。nffl 测定面积内的荧光分子数另一方面，每个单分子的吸光系数na[cm2]如下所示。na = 2. 303X IO3X ε/Na [cm2]如果将其代入式(3)，则如下所示。Δ1 = naX (I0/S0) Xn0[W]“ 个荧光分子的每个测定面积的吸光量Δ Pa [W/m2] ”，可以通过由nm置换该式 (3)中的IV并除以测定面积Sm而得到。APa = naX (I0/S0) X (nm/Sm) [ff/m2]这表示即使激励光的照度(IcZStl) [ff/cm2]相同，每个测定面积的吸光量APa[W/ m2]或荧光量也随着与光轴呈直角方向的荧光分子的密度(nm/Sm)，即是1[μπι2]中存在一个 荧光分子还是l[m2]中存在一个荧光分子等条件，而变化。如果没有该Sm，则在nm = 1的情况下，只能假定在照射激励光的整个区域中存在1 个分子。在此情况下，无法保证在进行拍摄的照相机的哪个像素中拍摄到该1个分子。因 此，必须利用进入1个像素的分子数，定义理论上的分子数。如式(1)所示，由于以[W/m2] 表示使用照相机系数Kc计算出的光量Px，所以通过以[W/m2]表示该吸光量APa，从而最 后使nm的运算变得容易。b2)荧光量的推定通过在上述的吸光量中加入荧光分子的量子效率等，可以利用以下的式子表示理 论荧光量Pf [w/m2]。
Pf= APaX nqX neX nt [ff/m2]在这里，η,荧光分子的量子效率ne 荧光分子的激励波长下的激励效率(激励波长效率)…参照图6nt 受光光学系统的荧光波长透过效率测定面积中的单分子的理论荧光量Is如下。Is = (Δ /π0) χ nqx nex nt[ff]= nax nqx nex ntx (i0/s0) [W](4)c)试样的每个测定面积的荧光量[W]的测定根据实际拍摄试样的照相机的像素的读取灰度等级值[LSB]、读取的累积时间 [s]、以及照相机系数[W· s/m2/LSB]，测定指定的像素中的“试样的每个测定面积的荧光量 [W] ”。来自试样的每单位面积的荧光实际测量值Pm[W/m2]，根据式(4)，应用照相机常数 而如下所示。Pm = KcXD/t[ff/m2]在这里，[Ι/m2]表示通过使用照相机的像素的二维空间中的距离测定而得到的 “每单位面积的荧光量”。为了将其换算为“每个测定面积的荧光实际测量值Im[W] ”，只要乘以测定面积Sm 即可。Im = KcXD/tXSm[ff](5)在这里，Kc 照相机系数[W · s/m2/LSB]t 测定时的累积时间[s]D:灰度等级值[LSB]d)每个测定面积的试样分子数的测定用由上述的C)测定的“试样的每个测定面积的荧光量[W]”除以由b)得到的“单 分子的理论荧光量[W]”，可以测定(推定)“每个测定面积的试样分子数”。“每个测定面积的单分子的理论荧光量”由式(4)表示，Is = nax nqx nex ntx (i0/s0) [w]实际测量的荧光量，根据式(5)为Im = KcXD/tXSm[ff]因此，推定的荧光分子数nm如下述所示。 _1]nm=Im/Is= (KcXD/t)/(nax nqx nex ntx (i0/s0)/sm)= (KcXDXS0xsm)/(tx naxi0x nqx nex nt)另外，对于激励光IJW]的测定值，如果考虑式(2)I0= (S0/Sa)XIa[ff]则如下所示。nm= (KcXDXSaxsm)/(tx naxiax nqx nex nt)(6)
此外，由于测定器的照相机系数Kc、透过效率nt是装置固有的，所以可以统一为 装置常数Ki。Ki = Kc/η t而且，包含作为对象的荧光试剂已经确定的情况下的系数群、以及激励光测定用 的光圈面积Sa在内，可以统一为荧光受光系数Ka。Ka = (KiXSa)/(naX nqx ne)在此情况下，将推定的荧光分子数nm如下述所示简便地表示。nm = KaXDX Sm/(IaXt)图5是表示荧光试剂Cy5_dUTP(GE > 力* r社)的实际测量分子数的图。示出 在玻璃基板上将各种浓度的Cy5附加UTP点滴为圆形，并按照上述的流程进行荧光测定的 例子。该曲线图中，将利用CCD照相机测定点滴部分的荧光量并通过上述的换算式计算 出的分子数，作为实际测量分子数而标注在纵轴上，另外，横轴是根据基板上点滴的溶液浓 度和点滴量、点滴直径计算出的点滴的荧光分子数。该点滴的荧光分子数与实际测量分子 数为相同值的理论值由虚线表示。根据图5，通过使用本发明的分子数测定方法，可知理论值与实际测量值一致性非 �：�。在现有技术中，荧光量等只能在任意单位系统中进行相对评价，但根据本发明，通 过将其统一为以下的2个试样测定装置固有的常数、和1个激励(照射)光量测定装置系 数，由此可以通过以光量[W]为单位的可溯源至国家标准的绝对值进行光量测定。由此，可 以对相同装置在不同时间的多次测定、或对不同的测定器机体间的测定进行比较。试样测定装置固有的2个常数为，Kc 照相机系数，以及nt 受光光学系统的荧光波长透过效率，激励(照射)光量测定装置的1个系数为，Sa:光圈面积(激励光量测定用)。另外，根据来自试样的光量(荧光、发光、吸光)和激励光量，以及分子的常数，可 以针对每个测定面积，测定(推定)试样中存在的分子数。即，每个单分子的理论荧光量表示为，Is = nax nqx nex ntx (i0/s0) [W],实际测量的每单位面积的荧光量Pm表示为，Pm = KcXD/t[ff/m2]或者，每个测定面积的荧光量、表示为，Im = KcXD/tXSm[ff],测定面积(Sm)内的荧光分子数 表示为，nm = (KcXDXSaXSm)/(tX HaXIaX nqX neX nt)。在这里，计算所需要的与荧光分子(荧光试剂)相关的常数为以下3个。ε 摩尔吸光系数，η,荧光分子的量子效率，η e 荧光分子的激励波长下的激励 波长效率另外，通过将本发明应用于二维图像，不仅可以得到0维的点信息，而且，还可以从二维的照相机图像本身，得到各像素的光量，所以可以测定试样上的荧光分子数的二维 空间分布。通过在例如日本特开2004-191232号公报所公开的方法中应用本发明，可以测 定试样上的荧光分子数的二维空间分布。另外，通过取代通常的显微镜或照相机的光学结构，而将本发明与共焦点光学系 统组合，由此，不仅可以测定二维分布，而且，还可以测定三维的荧光分子的空间分布。另外，作为与荧光相关的应用例，可以举出以下的例子。(1)利用在基板上将核酸固化的DNA微矩阵，可以计算杂化的核酸的荧光分子数。 另外，对于杂化目标的一个核酸分子，如果结合1个荧光分子，则可知杂化的目标核酸的分子数。(2)通过将DNA微矩阵的杂化后的参量换算为光量[W]，由此可以比较不同的平台 之间的杂化结果。(3)通过在基板上另外固定与向测定基板上点滴的探测核酸相同数量的荧光分 子，或者预先已知每个分子的荧光分子数的核酸分子，从而作为参考可知杂化效率。这一点 特别地作为荧光的退色成为问题时的校正起作用。(4)在培养细胞的受体和配体的结合，或细胞内的纤丝上的蛋白移动等的反应中， 通过导入已知的荧光分子，对其分子数进行计数，由此可以定量地测定细胞内的反应。〔实施例2〕在实施例1中，对荧光进行了处理，但也可以在吸光量测定中应用本发明。在本发明的吸光量测定方法中，向吸光分子照射照射光，经由受光光学系统，利用 受光元件测定由上述吸光分子吸收的光，从而测定试样的吸光量，其特征在于，具有下述步 骤，即向试样照射照射光的步骤，该照射光具有可溯源至国家标准且在试样表面的每特 定单位面积上为预先指定的光量值；由试样的吸光分子吸收照射光的步骤；经由上述受光光学系统，利用上述受光元件，测定由上述试样吸收后的透过光的 步骤；基于上述每单位面积上的指定照射光量、以及上述受光光学系统的光学系数、以 及上述受光元件的受光系数，根据由上述受光元件测定的透过光量和预先存储的吸收前的 光量值，计算可溯源至国家标准的每单位面积的吸光量值的步骤。根据该吸光量测定方法，可以将由试样吸收的光量，作为“可溯源至国家标准的每 单位面积的光量”例如[W/m2]等定量地导出，而不是照射光量和吸光量的比即比例值。此时，照射光作为“每个特定单位面积上为预先指定的光量值”而事先设定。例如， 作为“标准照射光量”而设定为l[W/m2]等。另外，受光光学系统的光学系数以及上述受光 元件的受光系数是装置固有的装置系数。另一方面，在吸光测定中，吸光物质的量由照射光量和吸光量的比表示。因此，在吸光测定中，测定透过光量，从预先存储的吸收前的光量值中减去该透过 光量，就可以计算本次测定的分子的吸光量。因此，在吸光测定中，通过将照射光量标准化，由此仅测定透过光量，并使用预先 存储的吸收前的光量值进行计算，就可以进行与物质的量对应的测定。
以下是本发明的要点。在现有的吸光测定中，吸光物质的量为照射光和透过光的比，是无量纲参数 (dimensionless parameter)，无法实现“可溯源至国家标准”的赋值。但是，通过将其分割为照射系统和受光系统，可以分别进行l[W/m2]、X[W/m2]等 “可溯源至国家标准”的校正。在本发明中，这是可以进行跨越设备差异或制造商的标准化的要点。S卩，照射光量，可以如后述所示分别作为“可溯源至国家标准的每单位面积的光 量”，利用光能量测量仪等保证精度。另外，受光元件也相同地，可以利用光能量测量仪等保证精度。如以上说明所示，根据本发明的荧光量或者吸光量测定方法，可以基于测量的试 样的光量和计算出的理论光量的比，根据测量分子数的试样的光量，直接导出试样的发光 系数ε或投入能量效率ne。本发明的应用范围并不限定于上述实施方式。本发明对于基于与分子数相关的光 量，定量地测定试样的分子数的分子数测定方法以及分子数测定方法，可以广泛地进行应用。
1权利要求
1.一种荧光量测定方法，其向试样照射激励光，经由受光光学系统，利用受光元件测定 从该试样产生的荧光，其特征在于，具有下述步骤向所述试样照射激励光的步骤，该激励光具有可溯源至国家标准且在试样表面的每单 位面积上为预先指定的光量值；经由所述受光光学系统，利用所述受光元件测定从所述试样产生的荧光的步骤；以及 基于所述每单位面积上的指定激励光量、所述受光光学系统的光学系数以及所述受光 元件的受光系数，对由所述受光元件测定的荧光量进行运算，从而作为可溯源至国家标准 的每单位面积上的光量值而进行计算的步骤。
2.一种吸收光量测定方法，其向试样照射照射光，经由受光光学系统，利用受光元件测 定由该试样吸收后的透过光，其特征在于，具有下述步骤经由所述受光光学系统，利用所述受光元件测定照射光的步骤，该照射光具有可溯源 至国家标准且在试样表面的每单位面积上为预先指定的光量值； 将所述照射光向所述试样照射的步骤；经由所述受光光学系统，利用所述受光元件测定由所述试样吸收后的透过光的步骤；以及 基于所述每单位面积上的指定照射光量、所述受光光学系统的光学系数以及所述受光 元件的受光系数，对由所述受光元件测定的透过光量进行运算，从而作为可溯源至国家标 准的每单位面积上的吸光量值而进行计算的步骤。
3.一种荧光量测定装置，其向试样照射激励光，经由受光光学系统，利用受光元件测定 从该试样产生的荧光，其特征在于，具有光源单元，其向所述试样照射激励光，该激励光具有可溯源至国家标准且在试样表面 的每单位面积上为预先指定的光量值；光量测量单元，其经由所述受光光学系统，利用所述受光元件测定从所述试样产生的 荧光；以及荧光量计算单元，其基于所述每单位面积上的指定激励光量、所述受光光学系统的光 学系数以及所述受光元件的受光系数，对由所述受光元件测定的荧光量进行运算，从而作 为可溯源至国家标准的每单位面积上的光量值而进行计算。
4.一种吸收光量测定装置，其向试样照射照射光，经由受光光学系统，利用受光元件测 定由该试样吸收后的透过光，其特征在于，具有光源单元，其向所述试样照射照射光，该照射光具有可溯源至国家标准且在试样表面 的每单位面积上为预先指定的光量值；光量测量单元，其经由所述受光光学系统，利用所述受光元件测定从所述光源单元射 出的照射光以及由所述试样吸收后的透过光；以及吸光量计算单元，其基于所述每单位面积上的指定照射光量、所述受光光学系统的光 学系数以及所述受光元件的受光系数，对由所述受光元件测定的透过光量进行运算，从而 作为可溯源至国家标准的每单位面积上的吸光量值而进行计算。
全文摘要
本发明得到一种荧光量或吸光量的测定方法及测定装置，其将从试样产生的荧光量，作为“可溯源至国家标准的每单位面积的光量”而定量地测定。在荧光量测定方法中，向试样照射激励光，经由受光光学系统，利用受光元件测定从该试样产生的荧光，并具有下述步骤向试样照射激励光的步骤，该激励光具有可溯源至国家标准且在试样表面的每单位面积上为预先指定的光量值；经由受光光学系统，利用受光元件测定从试样产生的荧光的步骤；以及基于每单位面积上的指定激励光量、受光光学系统的光学系数以及受光元件的受光系数，对由受光元件测定的荧光量进行运算，从而作为可溯源至国家标准的每单位面积的光量值而进行计算的步骤。
文档编号G01N21/64GK101995291SQ20101025035
公开日2011年3月30日 申请日期2010年8月6日 优先权日2009年8月6日
发明者下田聪一郎, 兰宗树, 杉山由美子, 田名网健雄, 青木秀年 申请人:横河电机株式会社
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