专利名称：一种用碘标记检测肿瘤的方法
技术领域：
本发明述及人类医学卫生，特别是一种用碘标记物检验样品血清来检测肿瘤的方法。
肿瘤是�：θ颂褰】档闹饕膊≈唬岩鹗澜绺鞴闹厥印Ｄ壳耙汛幼橹翁�、免疫学、放射学以及生物化学等方面对肿瘤的诊断、治疗进行了广泛的研究。对于肿瘤的检测诊断已取得了可喜的进展。据文献报道有效的肿瘤标记物有80多种，但特异性强、较满意的少。特别是缺少对各类肿瘤广谱适用的标记物。故进行肿瘤普查时，往往要进行多项指标的检测，还只能检查有限几种肿瘤，尚远远不能适应普查的需要。
本发明的目的在于提供一种对各类肿瘤广谱适用的用125碘标记物测定血清脱氧核糖核酸聚合酶活性来检测肿瘤的方法，适合于肿瘤的辅助诊断、临床予后观察和肿瘤普查。
本发明基于这样的基本原理，人的血清即脱氧核糖核酸聚合酶(DNA-P)加入脱氧腺嘌呤核苷三磷酸(dATP)、脱氧胞嘧啶核苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟嘌呤核苷三磷酸(dGTP)、含125碘脱氧尿嘧啶标记物(125Ⅰ-UdR)后，在摄氏37度下温育3小时，生成含125碘脱氧核糖核酸(125Ⅰ-DNA)，可在分离纯化后测其放射性，即
当反应条件严格控制一定时，测得的125Ⅰ-DNA放射性与DNA-P活性成线性关系，所以放射性即可代表DNA-P活性。
具体操作方法如下1、配底物按每个样品dATP、dCTP、dGTP、Mg++溶液(0.32M MgCL2-0.96MNH4CL)各10微升，三羟甲基氨甲烷(Tris)缓冲液60微升，125Ⅰ-UdR1微升的用量混合，使0.1毫升底物放射性为40-50万脉冲/分。
2、取0.1毫升样品血清，加20微升乙基苯基聚乙二醇(NP-40)溶液和0.1毫升底物，37℃水溶中温育3小时。
3、取出试管，加2毫升5%三氯醋酸(TCA)溶液，沉淀125Ⅰ-DNA，4000转/分、离心5分钟，弃清液。
4、每管加入一颗玻璃珠(直径4-6毫米)和0.2毫升5%TCA溶液，将试管置于涡旋混匀器上混匀一分钟。
5、加2毫升5%TCA溶液洗沉淀，4000转/分离心5分钟，弃清液。
6、重复本操作方法步骤4、5，洗涤沉淀3次，共洗涤沉淀4次。
7、测沉淀的放射性，凡放射性等于或超过诊断限度者为阳性，低于则为阴性。
下面介绍诊断限的决定取5份正常血清，按样品同样的方法与样品同时操作，测定放射平均值X，计算标准差SD，取X+2SD为诊断限。
下面介绍125Ⅰ-UdR标记物的制备1、称取5毫克生化纯的脱氧尿嘧啶核苷(UdR)，加0.5毫升2克当量浓度的HNO3溶液溶解。
2、取100微升碘放射性(125Ⅰ，2-3毫居里)溶液及100微升的本步骤1所述的溶液置于安瓿瓶中，封口，于摄氏80-120度在水浴中反应1小时。
3、打开安瓿瓶，加浓氨水调至酸度值PH9，加入季胺型Dowex1阴离子交换树脂柱(1×20厘米)，分别用80毫升0.5M NH4AC-0.05M NH4OH缓冲液，50毫升0.5M NH4AC-0.05M NH4OH缓冲液和120毫升水进行流洗，以0.2N HAC解吸，解吸液转入活性炭柱(1×2厘米)，然后用60毫升70%乙醇-氨水解吸活性炭柱，赶尽解吸液中氨，即得高比度(接近无载体)的125Ⅰ-UdR标记物。
本发明有如下优点及积极效果1、本方法由125Ⅰ-UdR参与合成DNA，由NP-40克服血清蛋白对DNA-P活性的抑制作用，并成功地研究了制备高比度(接近无载体)125Ⅰ-UdR标记物的步骤。经实验研究表明，对肝癌、肺癌、胃癌等16种肿瘤诊断符合率为73.6%，临床应用符合率为80.9-86.6%，并对各类肿瘤广谱适用。
2、初步肿瘤普查研究表明，比甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)更敏感，具有早期诊断价值。
3、本发明的发明人设计了125I标记物检测肿瘤药盒组成如下(1)125标记物(20微居里)冻干品1瓶(2)dATP冻干品1瓶(3)dCTP冻干品1瓶(4)dGTP冻干品1瓶(5)Mg++溶液1瓶(6)Tris缓冲液1瓶(7)NP-40溶液1瓶利用该药盒对31例AFP阴性病例(其中原发性肝癌9例)进行测定，本药盒测定14例阳性，其中原发性肝癌8例，肝血管瘤4例，肝脓肿1例，胆结石1例。表明本药盒对AFP阴性的原发性肝癌检出率高(8/9)，对提高肝癌的检出率具有重要意义。本方法和本药盒很适用于肿瘤的辅助诊断、临床予后观察和肿瘤的普查。
权利要求
1.一种用碘标记物检验样品血清来检测肿瘤的方法，其中包括(1，1)按下列配方配制底物，每0.1毫升底物的放射性为40-50万脉冲/分(1，1，1)脱氧腺嘌呤核苷三磷酸(dATP)10微升。(1，1，2)脱氧胞嘧啶核苷三磷酸(dCTP)10微升。(1，1，3)脱氧鸟嘌呤核苷三磷酸(dGTP)10微升。(1，1，4)Mg++溶液(0.32M MgCL2-0.96M NH4CL)10微升。(1，1，5)三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液60微升。其特征在于(1，1，6)含125碘-脱氧尿嘧啶核苷(125I-UdR)标记物1微升。(1，2)取0.1毫升血清(含DNA-P)样品，加入乙基苯基聚乙二醇(NP-40)溶液20微升和(1，1)中所述底物0.1毫升，置于试管中在摄氏37度水浴中温育3小时。(1，3)取出试管，加2毫升5%三氯醋酸(TCA)溶液，沉淀含123碘脱氧核糖核酸(23I-DNA)，在4000转/分离心操作5分钟，弃清液。(1，4)每管加入一颗玻璃珠(直径4-6毫米)，0.2毫升5%TCA溶液，将试管置于涡旋混匀器上进行1分钟混匀。(1，5)加入2毫升5%TCA溶液洗沉淀，4000转/分离心操作5分钟，弃清液。(1，6)重复本方法步骤(1，4)、(1，5)，洗涤沉淀3次，共洗涤沉淀4次。(1，7)测定沉淀物放射性，凡放射性等于或超过诊断限者为阳性，低于则为阴性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的(1，1，6)项中含125碘脱氧尿嘧啶核苷标记物(125Ⅰ-UdR)的制备方法是(2，1)称取5毫克生化纯的脱氧尿嘧啶核苷(UdR)，加入5毫升2克当量浓度的硝酸(HNO3)溶解，(2，2)取100微升碘放射性溶液(125Ⅰ，2-3毫居里)及100微升(2，1)项中所述溶液置于安瓿瓶中，封口，于摄氏80-120度水浴反应1小时，(2，3)打开安瓿瓶，加浓氨水调至酸度PH9，加入季胺型阴离子交换树脂柱(1×20厘米)，分别用80毫升0.25M NH4AC-0.05M NH4OH缓冲液，50毫升0.5M NH4AC-0.05M NH4OH缓冲液和120毫升水进行流洗，以0.2克当量浓度的HAC解吸，解吸液转入活性炭柱(1×2厘米)，然后用60毫升70%乙醇-氨水解吸活性炭柱，赶尽解吸液中氨，即得高比度(接近无载体)的125Ⅰ-UdR标记物。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的(1，7)项中的诊断限是这样决定的取5份正常血清，按权利要求1所述的样品血清同样的步骤与样品同时操作，测定放射性平均值X，计算标准差SD，取X+2SD为诊断限。
全文摘要
本发明提供了一种对各类肿瘤广谱适用的用
文档编号G01N33/574GK1039899SQ8810555
公开日1990年2月21日 申请日期1988年7月23日 优先权日1988年7月23日
发明者路德元, 王瑾瑛, 叶仲贤 申请人:中国人民解放军海军医学研究所
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