专利名称：一种快速定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件和制备方法
技术领域：
本发明属于医学检验领域，具体涉及一种快速定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条及其制备方法与应用。
背景技术：
肌红蛋白(Myoglobin，MY0)是一种氧结合血红素蛋白，分子量17. 8kD,主要分布于心肌和骨骼肌组织，心肌中含量特别丰富。MYO由一条多肽链和一个辅基组成。多肽链由153个氨基酸残基组成；辅基为血红素；在肌肉中有运输氧和储氧功能。肌红蛋白三级结构的形状呈紧密球形，多肽链中氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部，疏水侧链多位于分子表面，因此其水溶性较好。三级结构有8段a -螺旋区，每个a -螺旋区含7 24个氨基酸残基，分别称为A、B、C…G及H肽段。有I 8个螺旋间区，肽链拐角处为非螺旋区 (亦称螺旋间区)，包括N端有2个氨基酸残基，C端有5个氨基酸残基的非螺旋区。内部存在一口袋形空穴，血红素居于此空穴中。血红素是铁卟啉化合物，它由4个吡咯通过4个甲炔基相连成一个大环，Fe2+居于环中。铁与卟啉环及多肽链氨基酸残基的连接铁卟啉上的两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中的两个碱性氨基酸侧链上的正电荷相连。血红素的Fe2+与4个吡咯环的氮原子形成配位键，另2个配位键I个与F8组氨酸结合，I个与02结合，故血红素在此空穴中保持稳定位置。这种构象非常有利于运氧和储氧功能，同时也使血红素在多妝链中保持稳定。肌红蛋白在心肌损伤后，能快速释放入血。它占细胞浆蛋白的5% 10%以上。就骨骼肌而言，肌红蛋白主要见于慢开关的“红”纤维(慢纤维)；心肌有多种肌红蛋白的同型，有无心脏特异性肌红蛋白同型尚未证实。目前检测到的肌红蛋白不能区分源于骨骼肌或心�。虼怂担『斓鞍资欠切脑嗵匾煨缘�。尽管如此，肌红蛋白在胸痛发作后头几个小时，比CK和CKMB活性敏感性更高，它常于胸痛发作后2 4h开始升高，急性心肌梗塞(AMI)发作后6 10h，仍可检测到。肌红蛋白对于因胸痛入院需除外AMI的患者是一种非�：玫谋曛疚铩Ｈ绻赝捶⒆骱�8h肌红蛋白仍在正常范嗣，则可排除AMI之诊断。在非创伤性胸痛患者，肌红蛋白诊断特异性与CKMB相当。肌红蛋白检测不应当用于复苏后或肾功能衰竭并怀疑AMI患者。在无并发症的患者，肌红蛋白的快速清除特性可用于再梗死的诊断。目前认为，肌红蛋白是判断AMI患者有无再灌注的最好的无创指标之一。在溶栓治疗开始后90min，如肌红蛋白升高近4倍则可比较准确地判定梗死相关冠脉已完全再通，因此，可用于评估溶栓治疗后梗死相关血管再通情况。肌红蛋白也是外科冠状动脉旁路术后判断围手术期AMI的早期指标，当主动脉松开钳夹后3h肌红蛋白浓度明显变化即可判断AMI。因为肌红蛋白在循环中的半衰期短，用于极早发现梗死比其他指标更敏感。若与cTnl联合应用可提高其特异性，披认为是当前早期诊断急性心肌梗死的最佳搭配之一MYO的测定多采用双抗体竞争放射免疫法和竞争性ELISA测定法。有研究者将金标记或硒标记单克隆抗体与免疫层析技术相结合，用纸条法半定量床边检测MYO浓度，最低检测值为20 u g/L。目前cTnT的检测多采用化学发光法，用化学发光物质标记后作为检测抗体，大大提高了测定的精确性和敏感性，但需要昂贵的检测设备。目前的床旁检测方法(胶体金试纸法)，不能满足临床诊断准确定量的要求，无法对AMI的病程起到很好的疗效监测作用。因此，建立一种检测时间尽量缩短，并且检测除了能在实验室进行外，还要求能够进行床旁检测，同时能定量测定cTnT的检测方法，从而为临床提供准确的诊断依据，是十分必要的
发明内容
为克服现有肌红蛋白(MYO)检测技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种快速检测MYO的试纸条及其制备方法与应用。本发明根据免疫荧光技术特点和MYO抗原抗体系统特点，设计新的原材料、试剂和工艺流程，应用本发明提供的试纸条检测MYO水平，具有简单、快速、灵敏和特异性好等特点，本发明可同时定量检测高值和低值样品，并且性价比高，适用于临床快速检测。本发明的又一目的在于提供种快速定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条，本发明采用免疫荧光快速检测技术，利用荧光的高灵敏特点，且样品与荧光标记抗体在试剂瓶内反应后再加入检测卡。由于样品与荧光标记抗体在液相中全面接触，反应充分，因此可大幅度提高反应灵敏度，同时增加了样品的稀释倍数，去除了样品的基质效应，使定量结果有很好的可重复性，而且此方法省略了直接加样步骤，提高了定量结果的精密度和准确度，可满足同时检测高值和低值的临床诊断要求。本发明采用的技术方案为一种快速定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件，包括试纸条和与试纸条配合使用且独立包装的钼卟啉标记特异抗体，试纸条包括底衬、依次接合在底衬上的吸水垫、包被分析膜及样品垫，该包被分析膜上设有检测线和质控线，检测线包被的特异抗体为抗肌红蛋白单克隆抗体，质控线包被的特异抗体为兔IgG抗体；钼卟啉标记特异抗体为抗肌红蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体。优选地，所述底衬一面涂覆黏胶或双面胶，用于固定所述的吸水垫、包被分析膜及样品垫，其中，包被分析膜粘附在所述底衬的中间，两侧分别与所述吸水垫和样品垫连接。优选地，所述吸水垫为一种滤纸，为吸水纸或滤油纸；所述吸水垫粘附在所述底衬上，同时吸水垫与包被分析膜重叠l-2mm连接。优选地，所述包被分析膜为硝酸纤维膜，且在包被分析膜上喷涂抗肌红蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体。所述样品垫为玻璃纤维膜，用含0. 01% -0. 5% PEGU % -5%牛血清白蛋白、0. 01% -0. 05%表面活性剂的0. 02M磷酸盐缓冲液缓冲液浸泡，缓冲液PH为7. 2，浸泡处理后，37°C干燥过夜；样品垫(6)位于所述包被分析膜上。优选地,所述钼卟啉标记特异抗体为抗肌红蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体,并分别用含有如下组分的0. OlM磷酸盐缓冲液稀释后用塑料瓶密封而得0. 01%-0. 5%聚乙二醇、1% -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油、0. 01% -0. 05%表面活性剂。优选地，所述独立包装的钼卟啉标记的激发光波长范围为390-420nm，发射光波长范围为 600nm-700nm。
一种制备上述的定量检测检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，包括以下步骤第一步，抗体的制备，选用纯化的基因工程表达的抗肌红蛋白单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG ；第二步，包被分析膜的制备，采用喷膜机分别在一硝酸纤维膜上划检测线和质控线，划线细致均匀，检测线与质控线间隔5mm ；用检测线包被缓冲液稀释抗肌红蛋白单克隆抗体至浓度为10-20ug/ml，采用喷膜机将抗肌红蛋白单克隆抗体喷印在硝酸纤维膜的检测线上；
用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG至浓度为10_20ug/ml，采用喷膜机将纯化的兔IgG喷印在硝酸纤维膜的质控线上；将喷膜后的硝酸纤维膜放入30_50°C的真空干燥箱内，干燥后取出密封备用；第三步，样品垫的制备，将玻璃纤维膜用含0. 01% -0. 5% PEGU% -5%牛血清白蛋白、0. 01% -0. 05%表面活性剂的0. 02M磷酸盐缓冲液浸泡，放入30-50°C的真空干燥箱内，干燥后取出密封备用；第四步，钼卟啉标记特异抗体的制备将抗肌红蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0. IM碳酸氢钠溶液稀释至Img/ml，分别加入30-50mg的荧光素溶解液，搅匀，室温孵育I小时，每隔15分钟混匀一次，最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的荧光素标记抗体，用0. OlM磷酸盐缓冲液稀释混匀后于4°C保存；第五步，形成免疫荧光试纸条，先将包被分析膜粘附在底衬中间位置上，在包被分析膜一端粘附吸水垫，二者重叠l_2mm ;在包被分析膜另一端粘附样品垫，二者重叠l_2mm ;再将黏贴好包被分析膜、吸水垫和样品垫的底衬裁切成细条，即成一种快速定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸。优选地，所述检测线包被缓冲液为含有0. 8-1 %的甲醇、0. 8-1 %的蔗糖、0. 2% -0. 6%的牛血清白蛋白、抗肌红蛋白单克隆抗体lmg/ml的20mM pH值为7. 2的磷酸盐缓冲液。或，所述检测线包被缓冲液为含有0. 8-1 %的甲醇、0. 8-1 %的海藻糖蔗糖、0. 2% -0. 6%的牛血清白蛋白、抗肌红蛋白单克隆抗体lmg/ml的20mM pH值为7.6的轻乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液。 优选地，所述质控线包被缓冲液为含0. 7-1 %的甲醇、0. 5-0. 8%的牛血清白蛋白、兔IgG抗体0. 5mg/ml的50mM pH值为7. 6磷酸盐缓冲液。一种应用上述定量检测检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件的检测卡组件，包括试纸条组件和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的盖板和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的背板组成的卡盒，所述背板包括放置所述试纸条的卡槽和用于与所述盖板结合的卡齿，所述盖板包括可观测检测结果的检测窗、可滴加样品的加样孔和用于与所述背板的卡齿结合的固定孔，所述试纸条通过所述卡齿与所述固定孔结合而嵌合在所述背板和所述盖板之间，其中，所述包被分析膜正对所述检测窗，所述样品垫正对所述加样孔；另外，独立包装的钼卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。一种制备上述定量检测检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件的检测卡组件的方法，包括以下步骤I)制成背板和盖板用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材质制成背板和盖板，所述背板包括放置上述试纸条的卡槽和用于与所述盖板结合的卡齿，所述盖板包括可测结果的检测窗、可滴加样品的加样孔以及用于与所述背板的卡齿结合的固定孔；2)组装
将试纸条放在所述背板的所述卡槽内，通过所述背板的卡齿与所述盖板的固定孔(10)结合，将试纸条嵌合在背板和盖板之间，其中，包被分析膜正对所述检测窗，样品垫(6)正对所述加样孔；另外，独立包装的钼卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。3)包装将I人份的检测卡组件与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备I瓶独立包装的钼卟啉标记特异抗体，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的钼卟啉标记特异抗体装入一个包装盒，在2 °C -8 °C环境下避光不冻存的进行保存。本发明的有益效果应用本发明提供的试纸条检测人体内MYO水平，成本低廉，操作简单、快速、灵敏，且特异性好，只需要配套专用荧光检测仪，因此可广泛应用于各级医疗检验场所，尤其是基层医疗机构，包括乡镇卫生院等均可开展。本发明可定量测定MY0，其对于心脑血管事件发生的预防有极为重要的意义。
图I为本发明的试纸条的结构示意图；图2为本发明的检测卡结构示意图；图3是钼卟啉发光材料的发射光谱曲线；图4为本发明的反应方式示意图；图5为本发明的检测结果示意图；图6为本发明的肌红蛋白检测标准工作曲线。附图标记1 :底衬；2 :吸水塾；3 :包被分析I吴；4 :检测线；5 :质控线；6 :样品塾；7 :加样孔；8:检测窗；9:项目名称；10:固定孔；11:盖板；12:卡槽；13:背板；14:卡齿；15 :钼n卜啉标记抗体；16 :肌红蛋白；17 :检测线抗肌红蛋白单克隆抗体；18 :质控线兔IgG抗体。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。如附图I所示，一种快速定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件，包括试纸条和与试纸条配合使用且独立包装的钼卟啉标记特异抗体，试纸条包括底衬I、依次接合在底衬I上的吸水垫2、包被分析膜3及样品垫6，该包被分析膜上3设有检测线4和质控线5，检测线4包被的特异抗体为抗肌红蛋白单克隆抗体，质控线5包被的特异抗体为兔IgG抗体；钼卟啉标记特异抗体为抗肌红蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体。底衬I 一面涂覆黏胶或双面胶，用于固定所述的吸水垫2、包被分析膜3及样品垫6，其中，包被分析膜3粘附在所述底衬I的中间，两侧分别与吸水垫2和样品垫6连接。吸水垫2为一种滤纸，为吸水纸或滤油纸；吸水垫2粘附在所述底衬I上，同时吸水垫2与包被分析膜3重叠l-2mm连接。包被分析膜3为硝酸纤维膜，且在包被分析膜3上喷涂抗肌红蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体。样品垫6为玻璃纤维膜，用含0. 01 % -0. 5 % PEG、1% -5%牛血清白蛋白、0. 01%-0. 05%表面活性剂的0. 02M磷酸盐缓冲液缓冲液浸泡，缓冲液PH为7. 2，浸泡处理后，37°C干燥过夜；样品垫6位于所述包被分析膜3上。钼卟啉标记特异抗体为抗肌红蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，并分别用含有如下组分的0. OlM磷酸盐缓冲液稀释后用塑料瓶密封而得0. 01%-0.5%聚乙二醇、I %-5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油、0. 01% -0. 05%表面活性剂。制备上述定量检测检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，包括以下步骤第一步，抗体的制备，选用纯化的基因工程表达的抗肌红蛋白单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG0第二步，包被分析膜3的制备，用检测线包被缓冲液稀释抗肌红蛋白单克隆抗体至浓度为10-20ug/ml，采用BIO-DOT喷膜机将抗肌红蛋白单克隆抗体喷印在硝酸纤维膜的检测线上；用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG至浓度为10_20ug/ml，采用BIO-DOT喷膜机将纯化的兔IgG喷印在硝酸纤维膜的质控线上；将喷膜后的硝酸纤维膜放入30_50°C的真空干燥箱内，干燥后取出密封备用；其中，检测线包被缓冲液的制备20mM pH7. 2磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)，含甲醇
I%、鹿糖0. 8 %、牛血清白蛋白0.2*%、4E2抗体lmg/ml。质控线包被缓冲液的制备50mM pH7. 6磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)，含甲醇I %、牛血清白蛋白0. 8*%、兔IgGO. 5mg/ml。第三步，样品垫6的制备， 用含0. 2 %聚乙二醇、2. 5 %牛血清白蛋白、0. 03 %表面活性剂的0. 02M磷酸盐缓冲液，采用BIO-DOT喷膜机分别喷印在样品垫上，将喷印后的样品垫放入30-50°C的真空干燥箱内，干燥3小时后取出密封备用。第四步,钼P卜啉标记特异抗体的制备将抗肌红蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0. IM碳酸氢钠溶液稀释至Img/ml,分别加入30-50mg的钼卩卜啉溶解液,搅勻，室温孵育I小时，每隔15分钟混勻一次,最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的荧光素标记抗体，用0. OlM磷酸盐缓冲液稀释混匀后于4°C保存；第五步，形成免疫荧光试纸条，
先将包被分析膜粘附在底衬I中间位置上，在包被分析膜3 —端粘附吸水垫2，二者重叠l-2mm ;在包被分析膜3另一端粘附样品垫6，二者重叠l_2mm ;再将黏贴好包被分析膜(3)、吸水垫2和样品垫6的底衬I裁切成细条；即成一种快速定量检测肌红蛋白的免疫突光试纸。如附图2所示，一种应用上述定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件的检测卡组件，包括试纸条组件和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的盖板11和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的背板13组成的卡盒，背板13包括放置所述试纸条的卡槽12和用于与盖板11结合 的卡齿14，盖板11包括可观测检测结果的检测窗8、可滴加样品的加样孔7和用于与背板的卡齿14结合的固定孔10,试纸条通过卡齿14与所述固定孔10结合而嵌合在背板13和盖板11之间，其中，包被分析膜3正对检测窗8，样品垫6正对加样孔7 ;另外，独立包装的钼卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。一种制备上述定量检测检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件的检测卡组件的方法，其特征在于，包括以下步骤I)制成背板13和盖板11 用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材质制成背板13和盖板11，背板13包括放置试纸条的卡槽12和用于与盖板11结合的卡齿14，盖板11包括可测结果的检测窗8、可滴加样品的加样孔7以及用于与背板的卡齿14结合的固定孔10 ；2)组装将试纸条放在背板13的卡槽12内，通过背板13的卡齿14与盖板11的固定孔10结合，将试纸条嵌合在背板13和盖板11之间，其中，包被分析膜3正对所述检测窗8，样品垫6正对所述加样孔7 ;另外，独立包装的钼卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。3)包装将I人份的检测卡组件与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备I瓶独立包装的钼卟啉标记特异抗体，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的钼卟啉标记特异抗体装入一个包装盒，在2 °C -8 °C环境下避光不冻存的进行保存。本发明的检测原理参照附图3，对钼卟啉发光材料的发射光谱曲线进行分析，发现钼卟啉所具有的特征光谱的激发光光源范围为390_420nm,发射光波长范围为600_700nm。由于钼B卜啉发光标记物的特点，使得以其作为标记物的免疫荧光试纸条可与仪器结合，使得基于钼卟啉发光技术的免疫层析试纸条可进行灵敏度极高的多重分析、且对目标被检测物进行灵敏度极高的精确定量检测。另外，本发明的快速定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条及检测卡，利用荧光的高灵敏特点，使待测样品与钼卟啉标记先在试剂瓶内反应，由于待测样品与钼卟啉标记在液相中全面接触，反应充分，因此可大幅度提高反应灵敏度，同时增加了待测样品的稀释倍数，去除了待测样品的基质效应，使定量结果有很好的可重复性；而且钼卟啉标记上的特异抗体与待测样品充分结合形成一复合物，然后将复合物转加到检测卡的加样孔7的样品垫6上，实现钼卟啉发光材料与免疫层析技术相结合从而检测人体内肌红蛋白水平。如图4所示，当复合物加到检测卡的加样孔7的样品垫6上后，在吸水垫2的吸力下钼卟啉标记抗体15流经到检测卡中的包被分析膜3上，如果该复合物具有肌红蛋白，其能被检测线4上的肌红蛋白单克隆抗体17捕获，在绿色光照射下以红外光光信号的形式表现出来，所发出的荧光可用专用仪器定量测定，荧光强度与样品中肌红蛋白的浓度成正比。如果复合物中肌红蛋白低于最低检测标准，则检测线4不会发出荧光。另外，参阅图5的a、b、c所示，试纸条有效的情况下，检测线4上的抗肌红蛋白单克隆抗体17与质控线5上的兔IgG抗体18均会与复合物反应发出荧光，即检测线4与质控线5均发光，试纸条检测结果呈阳性；只有质控线5发光，试纸条检测结果呈阴性；两条线均未发光，试纸条检测结果无效。 本发明的标准工作曲线的绘制
首先，将提纯的肌红蛋白标准品用I : 10稀释的正常人血清(采用pH7. 20. 02MPB缓冲液稀释)作为稀释液配制系列浓度标准品，浓度为Ong/ml、I Ong/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的6份样品。其次,每个样品分别用10个肌红蛋白试纸条检测10次，10次检测仪器判读的样品检测T值和对照C值分别取平均值，最终根据二者的比值得出每个浓度对应的T/C结果,列于表I。表I、不同浓度下的T/C值
权利要求
1.一种快速定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于包括试纸条和与试纸条配合使用且独立包装的钼卟啉标记特异抗体，试纸条包括底衬(I)、依次接合在底衬(1)上的吸水垫(2)、包被分析膜(3)及样品垫￠)，该包被分析膜上(3)设有检测线(4)和质控线(5)，检测线⑷包被的特异抗体为抗肌红蛋白单克隆抗体，质控线(5)包被的特异抗体为兔IgG抗体；钼卟啉标记特异抗体为抗肌红蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体。
2.根据权利要求I所述的一种快速定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于所述底衬(I) 一面涂覆黏胶或双面胶，用于固定所述的吸水垫(2)、包被分析膜(3)及样品垫￠)，其中，包被分析膜(3)粘附在所述底衬(I)的中间，两侧分别与所述吸水垫(2)和样品垫(6)连接。
3.根据权利要求I或2所述的一种快速定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于所述吸水垫(2)为一种滤纸，为吸水纸或滤油纸；所述吸水垫(2)粘附在所述底衬(I)上，同时吸水垫(2)与包被分析膜(3)重叠1-2_连接。
4.根据权利要求I或2所述的一种快速定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条，其特征在于包被分析膜(3)为硝酸纤维膜，且在包被分析膜(3)上喷涂抗肌红蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体。
5.根据权利要求I或2所述的一种快速定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于所述样品垫(6)为玻璃纤维膜，用含0.01% -0.5% PEGU% -5%牛血清白蛋白、0. 01%-0. 05%表面活性剂的0. 02M磷酸盐缓冲液浸泡，缓冲液PH为7. 2，浸泡处理后，37°C干燥；样品垫(6)位于所述包被分析膜(3)上。
6.根据权利要求I所述的快速定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于所述钼卟啉标记特异抗体为抗肌红蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，并分别用含有如下组分的0. OlM磷酸盐缓冲液稀释后用塑料瓶密封而得0. 01% -0. 5%聚乙二醇、I % -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油、0. 01% -0. 05%表面活性剂。
7.根据权利要求I所述的定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于所述独立包装的钼卟啉标记的激发光波长范围为390-420nm，发射光波长范围为600nm-700nmo
8.一种制备权利要求I所述的定量检测检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于，包括以下步骤 第一步，抗体的制备， 选用纯化的基因工程表达的抗肌红蛋白单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG ； 第二步，包被分析膜(3)的制备， 采用喷膜机分别在一硝酸纤维膜上划检测线和质控线，划线细致均匀，检测线与质控线间隔5mm ； 用检测线包被缓冲液稀释抗肌红蛋白单克隆抗体至浓度为10-20ug/ml，采用喷膜机将抗肌红蛋白单克隆抗体喷印在硝酸纤维膜的检测线上； 用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG至浓度为10-20ug/ml，采用喷膜机将纯化的兔IgG喷印在硝酸纤维膜的质控线上； 将喷膜后的硝酸纤维膜放入30-50°C的真空干燥箱内，干燥后取出密封备用； 第三步，样品垫的制备，将玻璃纤维膜用含0.01% -0.5%聚乙二醇、1% -5%牛血清白蛋白、0.01% -0. 05%表面活性剂的0. 02M磷酸盐缓冲液浸泡，放入30-50°C的真空干燥箱内，干燥后取出密封备用； 第四步，钼卟啉标记特异抗体的制备 将抗肌红蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0. IM碳酸氢钠溶液稀释至lmg/ml，分别加入30-50mg钼卟啉标记溶解液，搅匀，室温孵育I小时，每隔15分钟混匀一次，最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的荧光素标记抗体，用0. OlM磷酸盐缓冲液稀释混匀后于4°C保存； 第五步，形成免疫荧光试纸条， 先将包被分析膜粘附在底衬(I)中间位置上，在包被分析膜(3) —端粘附吸水垫(2)，二者重叠l_2mm ;在包被分析膜(3)另一端粘附样品垫￠)，二者重叠l_2mm ;再将黏贴好包被分析膜(3)、吸水垫(2)和样品垫(6)的底衬(I)裁切成细条。
9.根据权利要求8所述的一种制备权利要求I所述的定定量检测检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于，所述检测线包被缓冲液为含有0. 8-1 %的甲醇、0. 8-1%的鹿糖、0. 2%-0. 6%的牛血清白蛋白、抗肌红蛋白单克隆抗体lmg/ml的2OmM pH值为7. 2的磷酸盐缓冲液。
10.根据权利要求8所述的一种制备权利要求I所述的定量检测检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于，所述检测线包被缓冲液为含有0. 8-1 %的甲醇、0. 8-1 %的海藻糖鹿糖、0. 2% -0. 6%的牛血清白蛋白、抗肌红蛋白单克隆抗体lmg/ml的20mM pH值为7. 6的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液。
11.根据权利要求8所述的一种制备权利要求I所述的定量检测检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于，所述质控线包被缓冲液为含0. 7-1 %的甲醇、0. 5-0. 8%的牛血清白蛋白、兔IgG抗体0. 5mg/ml的50mM pH值为7. 6磷酸盐缓冲液。
12.—种应用权利要求I所述的定量检测检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件的检测卡组件，其特征在于所述检测卡组件包括试纸条组件和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的盖板(11)和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的背板(13)组成的卡盒，所述背板(13)包括放置所述试纸条的卡槽(12)和用于与所述盖板(11)结合的卡齿(14)，所述盖板(11)包括可观测检测结果的检测窗(8)、可滴加样品的加样孔(7)和用于与所述背板的卡齿(14)结合的固定孔(10)，所述试纸条通过所述卡齿(14)与所述固定孔(10)结合而嵌合在所述背板(13)和所述盖板(11)之间，其中，所述包被分析膜(3)正对所述检测窗(8)，所述样品垫(6)正对所述加样孔(7);另外，独立包装的钼卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶至Jhl o
13.一种制备权利要求12所述的定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件的检测卡组件的方法，其特征在于，包括以下步骤 I)制成背板(13)和盖板(11) 用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材质制成背板(13)和盖板(11)，所述背板(13)包括放置所述试纸条的卡槽(12)和用于与所述盖板(11)结合的卡齿(14)，所述盖板(11)包括可测结果的检测窗(8)、可滴加样品的加样孔(7)以及用于与所述背板的卡齿(14)结合的固定孔(10)；2)组装 将试纸条放在所述背板(13)的所述卡槽(12)内，通过所述背板(13)的卡齿(14)与所述盖板(11)的固定孔(10)结合，将试纸条嵌合在背板(13)和盖板(11)之间，其中，包被分析膜(3)正对所述检测窗(8)，样品垫(6)正对所述加样孔(7);另外，独立包装的钼卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。
3)包装 将I人份的检测卡组件与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备I瓶独立包装的钼卟啉标记特异抗体，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的钼卟啉标记特异抗体装入一个包装盒，在2°C _8°C环境下避光不冻存的进行保存。
全文摘要
本发明公开了一种快速定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件和制备方法，该免疫荧光试纸条组件包括了试纸条和独立包装的铂卟啉标记特异抗体，试纸条包括了由底衬上依次接合的吸水垫、包被分析膜及样品垫而组成的条形物，包被分析膜上设置有检测线和质控线，所述包被分析膜上的检测线包被特异抗体为抗肌红蛋白单克隆抗体，质控线包被兔IgG抗体，独立包装的荧光素标记特异抗体为抗肌红蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，检测卡则将一卡盒和试纸条组件结合即可，应用本发明所提供的试纸条检测人血液、血清或血浆中肌红蛋白，操作简单、快速、灵敏和特异性好等特点，具有良好的临床应用前景。
文档编号G01N33/68GK102680703SQ201210133570
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者李必松, 梁万兴, 罗琪, 谢爱武 申请人:广州鸿琪光学仪器科技有限公司
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