专利名称：一种多肿瘤标志物并行检测的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及体外检测技术领域，具体地涉及一种多肿瘤标志物并行检测的方法及试剂盒。
背景技术：
肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾�。劳雎矢摺Ｖ琢霰曛疚锏某鱿质谷嗣嵌灾琢龅脑缙谡锒霞挠枇撕艽笙Ｍ灾琢霰曛疚锛觳饨峁奈榷ㄐ院妥既沸杂氩∪说睦婷芮邢喙亍�
本发明基于的Luminex xMAP是一个非常灵活的多功能技术平台。其原理是把微小的乳胶颗粒分别染成不同的荧光色，即荧光编码微球(Beads)，然后再把针对不同检测物的核酸(互补链)或蛋白(如抗原抗体)以共价方式结合到特定颜色的微球上。应用时，先把针对不同检测物的、用不同颜色编码的微球混合，再加入被检测物(被测物可以是血清中的抗原、抗体、或酶等，也可以是PCR产物)。在悬液中的微球与被检测物特异性地结合，并加上荧光标记。然后，微球成单列通过两束激光，一束判定微球的颜色从而决定被测物的特异性(定性)；另一束测定微球上的荧光标记强度从而决定被测物的量(定量)，所得到的数据经电脑处理后可以直接用来判断结果。
现有技术中已有多肿瘤标志物并行检测的方法，基于的反应原理都是本领域技术人员熟知的双抗夹心法，但现有方法中在每一步结合反应完成后都须洗涤以便去除游离的、未结合的抗原或抗体，因此操作极为繁锁，且灵敏度和精密度较差。
因此，本领域迫切需要开发新的操作简便，且能够同时检测多种肿瘤标志物的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种操作简便(无须洗涤)，并且具有灵敏度高、特异性好、检测结果稳定等优点、从而能够从反应到输出结果一步完成的多肿瘤标志物并行检测的方法及试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种多肿瘤标志物并行检测的方法，包括以下步骤(a)将待测样品与第一抗体溶液混合，其中所述的第一抗体溶液含有2-50种不同的第一抗体，所述的每一种第一抗体分别抗一种肿瘤标志物并且偶联于不同的微球而形成式I所示的第一抗体-微球的二元复合物，anti1X-bead(I)式中，X表示肿瘤标志物，anti1X表示抗肿瘤标志物X的第一抗体，bead表示微球，-表示第一抗体与微球之间的共价键；从而使待测样品中的肿瘤标志物与第一抗体形成“肿瘤标志物-第一抗体-微球”三元复合物；(b)将步骤(a)形成的溶液与第二抗体溶液混合，其中所述的第二抗体溶液含有2-50种不同的带有可检测信号的第二抗体，所述的每一种第二抗体分别抗一种肿瘤标志物且对应于第一抗体溶液中相应的第一抗体，而且对应的第二抗体与第一抗体可同时结合于该肿瘤标志物且第一抗体与第二抗体的摩尔比为1∶0.1-1∶2，从而形成“第二抗体-肿瘤标志物-第一抗体-微球”四元复合物；(c)检测四元复合物中不同微球的可检测信号，从而确定待检测样品中各肿瘤标志物的存在与否，附加条件是待测样品与第一抗体溶液和第二抗体溶液的混合，可依次进行，也可同时进行。
在另一优选例中，该方法还包括步骤(d)将测定的可检测信号与质控或标准曲线进行比较，从而确定待检测样品中各肿瘤标志物的存在与否，和/或数量。
在另一优选例中，所述的可检测信号是荧光信号。
在另一优选例中，所述的微球是平均粒径为2-10μm、且染上不同荧光的聚苯烯微球。
在另一优选例中，所述的第一抗体溶液和第二抗体溶液含有针对以下各组肿瘤标志物的第一抗体和第二抗体(i)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、糖链抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)；(ii)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、糖抗原72-4(CA72-4)、糖抗原50(CA50)；(iii)胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)、糖抗原50(CA50)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)、CYFRA21-1；(iv)癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、癌抗原(CA15-3)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)；(v)总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)。
在另一优选例中，所述的第一抗体溶液中，各第一抗体的浓度为1-100ug/ml，在所述的第二抗体溶液中，各第二抗体的浓度为0.1-200ug/ml。
在另一优选例中，步骤(c)中用Luminex xMAP法进行检测。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测多肿瘤标志物的试剂盒，它包括以下组分(a’)第一容器以及装于该容器中的第一抗体溶液，其中所述的第一抗体溶液含有2-50种不同的第一抗体，所述的每一种第一抗体分别抗一种肿瘤标志物并且偶联于不同的微球而形成式I所示的第一抗体-微球的二元复合物，anti1X-bead(I)式中，X表示肿瘤标志物，anti1X表示抗肿瘤标志物X的第一抗体，bead表示微球，-表示第一抗体与微球之间的共价键；(b’)第二容器以及装于该容器中的第二抗体溶液，其中所述的第二抗体溶液含有2-50种不同的带有可检测信号的第二抗体，所述的每一种第二抗体分别抗一种肿瘤标志物且对应于第一抗体溶液中相应的第一抗体，而且对应的第二抗体与第一抗体可同时结合于该肿瘤标志物且第一抗体与第二抗体的摩尔比为1∶0.1-1∶2。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括(c’)用作质控的标准液、或质控液(或对照液)。
在另一优选例中，所述的第一抗体溶液和第二抗体溶液含有针对以下各组肿瘤标志物的第一抗体和第二抗体(i)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、糖链抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)；(ii)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、糖抗原72-4(CA72-4)、糖抗原50(CA50)；(iii)胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)、糖抗原50(CA50)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)、CYFRA21-1；(iv)癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、癌抗原(CA15-3)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)；(v)总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)。
在本发明的第三方面，提供了所述试剂盒的用途，它被用于检测体外样品中是否存在肿瘤标志物。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究发现，通过控制一抗和二抗的浓度，可以在直接混合而不经洗涤的情况下就获得对多个肿瘤标志物的准确检测结果，从而使多肿瘤标志物并行检测方法的操作实现了简便、快速和有效。
如本文所用，术语“第一抗体”、“一抗”可互换使用，指可特异性结合于肿瘤标志物的一种抗体。
如本文所用，术语“第二抗体”、“二抗”可互换使用，指可特异性结合于肿瘤标志物的另一种抗体。对于同一种肿瘤标志物而言，相应的第一抗体和第二抗体是不同的，并且可同时结合于所述的肿瘤标志物的不同表位。
如本文所用，术语“肿瘤标志物”是指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的，反映肿瘤存在和生长的一类物质。代表性的肿瘤标志物包括(但并不限于)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、糖链抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)。
基本原理本发明的基本原理是本领域技术人员所熟知的双抗夹心法。常规的做法是将一抗固定于固相载体，然后一抗与抗原反应，洗涤后再与标有酶的二抗反应，洗涤，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。
本发明方法中，充分利用了一抗固定在不同流动微球(Beads)的特点，同时优化藻红蛋白(PE)标记的二抗的浓度，将交联了一抗的微球溶液与血清样本或抗原标准质控品液、PE标记的二抗溶液依次或同时一并加入反应容器中，从而发生以下反应①微球上的一抗与血清或标准质控品液中相应的抗原(即肿瘤标志物抗原)结合，形成“肿瘤标志物-第一抗体-微球”三元复合物，②二抗与血清或标准质控品液中相应的抗原(即肿瘤标志物抗原)结合，最终形成“第二抗体-肿瘤标志物-第一抗体-微球”四元复合物(包括微球交联的一抗-血清相应抗原-PE标记的复合物或微球交联的一抗-标准质控品液的抗原-PE标记的复合物)，反应过程中不须离心洗涤，在液相中即可通过LuminexxMAP检测复合物的荧光，达到从反应到定性定量分析一步完成的效果，即一步法。
在Luminex检测仪上，这些微球被微量液体传送系统排成单列，通过两束激光，一束判定微球的编码从而决定被测肿瘤标志物的种类；另一束测定微球上PE的荧光强度，经数据处理得出被测肿瘤标志物的含量。
关于Luminex xMAP的技术平台详细资料，请参见产品说明书或文献，(1)Cancer Chemotherapy and Pharmacology，51321-327，(2)Journal of/mmunological Methods.22741-52。
第一抗体-微球的二元复合物本发明的第一抗体-微球的二元复合物具有式(I)结构anti1X-bead(I)式中，X表示肿瘤标志物，anti1X表示抗肿瘤标志物X的第一抗体，bead表示微球，-表示第一抗体与微球之间的共价键；一抗与微球的偶连针对不同肿瘤标志物抗原的一抗(anti1X，X代表肿瘤标志物抗原)与微球共价交联的详细操作程序可用常规方法，例如按照Luminex公司的产品说明书或网站www.luminexcorp.com中所述的方法进行偶连，从而得到不同微球与相应一抗形成偶连物anti1X-Beads。
分别取针对不同肿瘤标志物的anti1X-Beads，按一定比例混合就可得到第一抗体溶液(简称为A液)。
二抗的标记虽然二抗可用各种本领域已知的可检测信号进行标记。然而，优选的是用荧光信号进行标记，尤其是通过生物素-亲和素连接方式标记PE。
在一优选例中，二抗的生物素(Biotin)标记方法如下分别取针对不同肿瘤标志物抗原的二抗(anti2X，X代表肿瘤标志物抗原)透析纯化后加入生物素二甲基亚砜(DMSO)溶液，避光反应，透析去除未反应的生物素，保存备用。
分别取针对不同肿瘤标志物抗原的生物素标记的anti2X，按比例混合，加入亲和素(Streptavidin)标记的PE，使生物素与Streptavidin结合，生成带荧光素标记的第二抗体(即PE-anti2X，其中PE表示藻红蛋白)，得到第二抗体溶液(简称为C液)。
质控或标准为了消除假阳性和假阴性，宜在检测过程中设置质控。此外，为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的多个肿瘤标志物的标准品。
例如，抗原标准(STDn，n＝0～5)和质控品(质控1、质控2)溶液的配制可按下表配制表1混合抗原标准质控品溶液配制表
表中第1列为不同的肿瘤标志物，STD0表示该标准溶液中的所有肿瘤标志物的浓度均为0，为标准曲线的起始点；STD1表示该标准溶液中的不同肿瘤标志物的浓度分别为C1-1、C2-1、C3-1……C40-1，为标准曲线的第2点；依此类推STD2、STD3、STD4、STD5的含义；质控1表示该标准溶液中的不同肿瘤标志物的浓度分别为C1-6、C2-6、C3-6……C40-6，介于STD0和STD5之间，为内部质控点；质控2表示该标准溶液中的不同肿瘤标志物的浓度分别为C1-7、C2-7、C3-7………C40-7，介于STD0和STD5之间，为另1内部质控点。STD0～STD5及质控1和质控2构成质控液(检测为B液)。
将上述的第一抗体溶液、质控液和第二抗体溶液(即A、B和C液)依次或同时混匀，然后充分反应(如在37±5℃反应10-100min)，随后在luminex100上读数，即可得到多条标准曲线(具体数目由肿瘤标志物组合中不同的肿瘤标志物数目决定)。
肿瘤标志物的组合本发明人经过多年实践发现，由于众多肿瘤标志物的特性各不相同，因此，为了同时获得较佳的检测结果，宜对各众多肿瘤标志物进行组合。一种优选的组合情况如下(i)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、糖链抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)；(ii)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、糖抗原72-4(CA72-4)、糖抗原50(CA50)；(iii)胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)、糖抗原50(CA50)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)、CYFRA21-1；(iv)癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、癌抗原(CA15-3)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)；(v)总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)。
对应于各组肿瘤标志物，第一抗体溶液、第二抗体溶液和质控液也含有相应的一抗、二抗或肿瘤标志物。
例如，当待检测的肿瘤标志物是甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、糖链抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)时；其对应的A液为anti1AFP-beads、anti1CEA-beads、anti1CA125-beads、anti1CA19-9-beads、anti1PSA-beads、anti1f-PSA-beads、anti1NSE-beads、anti1CA242-beads、anti1CA15-3-beads、anti1β-HCG-beads组成的混合液；其对应的B液为标准液0(STD0)，其中不含任何肿瘤标志物；标准液1-5(STD1、STD2、STD3、STD4、STD5)，含有不同已知浓度的上述10种肿瘤标志物抗原；质控品液1(质控1)，含有上述10种肿瘤标志物抗原、质控品液2(质控2)，含有上述10种肿瘤标志物抗原；其对应的C液为PE-anti2APEP、PE-anti2CEA、PE-anti2CA125、PE-anti2CA19-9、PE-anti2PSA、PE-anti2PE-PSA、PE-anti2NSE、PE-anti2CA242、PE-anti2CA15-3、PE-anti2β-HCG组成的混合液。
当肿瘤标志物为其他组合时，可依此类推。
样品的检测可用本发明方法检测的样品没有特别限制，可以是任何含有肿瘤标志物的样品，代表性的例子包括血清样本、尿液样本、唾液样本等。优选的样品是血清样品。
在检测时，可将A液、人血清样本和C液依次或同时混匀，然后充分反应(如在37±5℃反应10-100min)，随后在Luminex100上读数，根据各肿瘤标志物的阈值判断其是否存在，也可根据标准曲线换算出某个或某几个肿瘤标志物的浓度。
本发明的主要优点在于一次实验能得到样品多项指标的定性定量信息，灵敏、准确、重复性好，具有较宽的线性范围且操作简单。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例材料抗原和抗体来源
微球(Beads)购自美国Luminex公司，规格为5.0μm，微球表面为-COOH修饰，其他常规试剂为市售品。
实施例110种肿瘤标志物并行检测1.准备1.1 一抗预先去除含氨基小分子和杂蛋白(透析或过层析柱)，测量其浓度。
1.2 在1.5ml聚丙烯离心管中，精确称取5mg左右N-hydroxysulfosuccini-mide(NHSS)，备用(防潮)。
1.3 在1.5ml聚丙烯离心管中，精确称取5mg左右N-ethyl-N′(3-dimethylainopropyl)-carbodiimide(EDC)，备用(防潮)。
2.微球(Beads)活化2.1 微球原液旋涡混旋仪混悬20秒，移取200μL微球(相当于2.5×106微球)于1.5ml聚丙烯离心管中。
2.2 15000rpm离心2分钟(设置3分钟)，移去上清液。
2.3 加入100μL蒸馏水，旋涡混旋仪混悬20秒，15000rpm离心2分钟，移去上清液。
2.4 重复2.3。
2.5 加入80μL 0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)，pH 6.2，旋涡混旋仪混悬20秒。
2.6 用蒸馏水将(NHSS)稀释至50mg/ml。(现配现用)2.7 取10μL 50mg/ml(NHSS)加到Beads溶液中，旋涡混旋仪混悬20秒。
2.8 用蒸馏水将EDC稀释至50mg/ml。(现配现用)2.9 取10μL 50mg/ml EDC加到Beads溶液中，旋涡混旋仪混悬20秒。
2.10 避光、37℃孵育20分钟。
2.11 15000rpm离心2分钟，移去上清液。
2.12 加入250μL 50mmol/L 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid(MES)(MES)pH5.0。
2.13 15000rpm离心2分钟，移去上清液。
2.14 重复2.12，2.13，马上进行下步实验。
3.交联、封闭和储存3.1 加20μg已处理的一抗到已活化的Beads中，旋涡混旋仪混悬20秒。
3.2 避光、37℃反应2小时，每十五分钟混匀一次。
3.3 加入1ml PBS-TBN，旋涡混旋仪混悬20秒，15000rpm离心2分钟。移去上清液(PBS-TBN的组成为10mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液、0.02％吐温20、1mg/ml的小牛血清白蛋白和0.05％叠氮钠)。
3.4 加入500μL PBS-TBN，旋涡混旋仪混悬20秒，15000rpm离心2分钟。移去上清液。
3.5 加入500μL PBS-TBN，旋涡混旋仪混悬20秒。
3.6 2-8℃避光保存。
4.二抗(anti2X)的生物素标记4.1二抗预处理
4.2 生物素标记反应取上述预处理的二抗25μL，加入25μL的1mg/ml NHSS-biotin DMSO溶液，混匀，4℃冰箱避光反应2小时。
5.混合抗原标准、质控品(B液)的配制
用pH7.4的磷酸盐缓冲液按上表配制B液。
6.A液的配制取10种不同Beads的下列anti1β-HCG-Beads，anti1PEree-PSA-Beads，anti1total-PSA-Beads，anti1NSE-Beads，anti1CA15-3-Beads，anti1CA19-9-Beads，anti1CA125-Beads，anti1CA242-Beads，anti1APEP-Beads，anti1CEA-Beads溶液，按4×105个/种混合，加在pH7.4 PBS中，体积为5ml，4℃避光保存备用。
7.混合二抗-PE混合物(℃液)配制分别取标记好biotin的PEree-PSA，total-PSA，NSE，CA242，CA19-9，CA125，β-HCG，CA15-3，APEP，CEA二抗加入pH7.4 PBS中，每种二抗终浓度为5μg/ml，同时加入PE总浓度为60μg/ml，混合二抗-PE混合物总体积为5ml，4℃避光保存备用。
8.病人血清消化道肿瘤标志物含量检测8.1 收集病人血样10份2ml/份，5000rpm×5min，取上清，备用。
8.2 分别加入A液于96孔酶标板，50μl/孔；然后加入标准品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5)、质控品(Contol1、Contol2)、血清样品1-9号，5μl/孔；再加入C液，50μl/孔。在旋涡混旋仪上充分混匀，放入37℃摇床孵育40min。
8.3 孵育完成后于旋涡混旋仪上充分混匀在Luminex100上读数。
8.4 检测结果见下表
注表格中粗斜体部分为标准品检测结果，其他为样本检测结果。
结果表明，用本发明方法可同时获得多个肿瘤标志物的定量测定结果，例如第7号样品中存在大量的肿瘤标志物t-PSA，从而可为临床诊断提供辅助性的参考指标。
实施例26种肿瘤标志物并行检测1～4操作步骤同实施例1。
5.混合抗原标准质控品(B液)的配制
用pH7.4的磷酸盐缓冲液按上表配制B液。
6.A液的配制取6种不同Beads的下列anti1CA19-9-Beads，anti1CA125-Beads，anti1CA72-4-Beads，anti1CA50-Beads，anti1APEP-Beads，anti1CEA-Beads溶液按4×105个/种混合，加在pH7.4 PBS中，体积为5ml，4℃避光保存备用。
7.混合二抗-PE混合物(C液)配制分别取标记好biotin的CA19-9，CA125，CA72-4，CA50，APEP，CEA二抗加入pH7.4 PBS中每种二抗终浓度为5μg/ml，同时加入PE总浓度为60μg/ml，混合二抗-PE混合物总体积为5ml，4℃避光保存备用。
8.病人血清消化道肿瘤标志物含量检测8.1 收集病人血样6份2ml/份，5000rpm×5min，取上清，备用。
8.2 分别加入A液于96孔酶标板，50μL/孔；然后加入标准品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5)、质控品(Contol1、Contol2)、血清样品1-6号，50μL/孔；再加入C液，50μL/孔。在旋涡混旋仪上充分混匀，放入37℃摇床孵育40min。
8.3 孵育完成后于旋涡混旋仪上充分混匀在Luminex100上读数。
8.4 检测结果见下表
注表格中粗斜体部分为标准品检测结果，其他为样本检测结果。
结果表明，用本发明方法可同时获得多个肿瘤标志物的定量测定结果，例如第7号样品中存在大量的肿瘤标志物APEP，从而可为临床诊断提供辅助性的参考指标。
实施例37种肿瘤标志物并行检测1～4操作步骤同实施例1。
5.混合抗原标准、质控品(B液)的配制
用pH7.4的磷酸盐缓冲液按上表配制B液。
6.A液的配制取7种不同Beads的下列anti1β-HCG-Beads，anti1SCCA-Beads，anti1CYPERA21-1-Beads，anti1NSE-Beads，anti1CA125-Beads，anti1CEA-Beads，anti1CA50-Beads溶液按4×105个/种混合，加在pH7.4 PBS中，体积为5ml，4℃避光保存备用。
7.混合二抗-PE混合物(C液)配制分别取标记好biotin的CA50，CYPERA21-1，SCCA，NSE，CA125，β-HCG，CEA二抗加入pH7.4 PBS中每种二抗终浓度为5μg/ml，同时加入PE总浓度为60μg/ml，混合二抗-PE混合物总体积为5ml，4℃避光保存备用。
8.病人血清消化道肿瘤标志物含量检测8.1 收集病人血样9份2ml/份，5000rpm×5min，取上清，备用。
8.2 分别加入A液于96孔酶标板，50ul/孔；然后加入标准品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5)、质控品(Contol1、Contol2)、血清样品1-7号，20μl/孔；再加入混合二抗-PE混合物(C液)，50μl/孔。在旋涡混旋仪上充分混匀，放入37℃摇床孵育40min。
8.3 孵育完成后于旋涡混旋仪上充分混匀在Luminex100上读数。
8.4 检测结果见下表
注表格中粗斜体部分为标准品检测结果，其他为样本检测结果。
结果表明，用本发明方法可同时获得多个肿瘤标志物的定量测定结果，例如第11号样品中存在大量的肿瘤标志物SCCA，从而可为临床诊断提供辅助性的参考指标。
实施例45种肿瘤标志物并行检测1～4操作步骤同实施例1。
5.混合抗原标准、质控品(B液)的配制
用pH7.4的磷酸盐缓冲液按上表配制B液。
6.A液的配制取5种不同Beads的下列anti1β-HCG-Beads，anti1SCCA-Beads，anti1CA15-3-Beads，anti1CA125-Beads，anti1CEA-Beads溶液按4×105个/种混合，加在pH7.4 PBS中，体积为5ml，4℃避光保存备用。
7.混合二抗-PE混合物(C液)配制分别取标记好biotin的SCCA，CA15-3，CA125，β-HCG，CEA二抗加入PH7.4PBS中每种二抗终浓度为5μg/ml，同时加入PE总浓度为60μg/ml，混合二抗-PE混合物总体积为5ml，4℃避光保存备用。
8.病人血清消化道肿瘤标志物含量检测8.1 收集病人血样6份2ml/份，5000rpm×5min，取上清，备用。
8.2 分别加入A液于96孔酶标板，50μl/孔；然后加入标准品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5)、质控品(Contol1、Contol2)、血清样品1-6号，20μl/孔；再加入C液，50μl/孔。在旋涡混旋仪上充分混匀，放入37℃摇床孵育40min.
8.3 孵育完成后于旋涡混旋仪上充分混匀在Luminex100上读数。
8.4检测结果见下表
注表格中粗斜体部分为标准品检测结果，其他为样本检测结果。
结果表明，用本发明方法可同时获得多个肿瘤标志物的定量测定结果，例如第8号样品中存在大量的肿瘤标志物CA153，从而可为临床诊断提供辅助性的参考指标。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种多肿瘤标志物并行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤(a)将待测样品与第一抗体溶液混合，其中所述的第一抗体溶液含有2-50种不同的第一抗体，所述的每一种第一抗体分别抗一种肿瘤标志物并且偶联于不同的微球而形成式I所示的第一抗体-微球的二元复合物，anti1X-bead (I)式中，X表示肿瘤标志物，anti1X表示抗肿瘤标志物X的第一抗体，bead表示微球，-表示第一抗体与微球之间的共价键；从而使待测样品中的肿瘤标志物与第一抗体形成“肿瘤标志物-第一抗体-微球”三元复合物；(b)将步骤(a)形成的溶液与第二抗体溶液混合，其中所述的第二抗体溶液含有2-50种不同的带有可检测信号的第二抗体，所述的每一种第二抗体分别抗一种肿瘤标志物且对应于第一抗体溶液中相应的第一抗体，而且对应的第二抗体与第一抗体可同时结合于该肿瘤标志物且第一抗体与第二抗体的摩尔比为1∶0.1-1∶2，从而形成“第二抗体-肿瘤标志物-第一抗体-微球”四元复合物；(c)检测四元复合物中不同微球的可检测信号，从而确定待检测样品中各肿瘤标志物的存在与否，附加条件是待测样品与第一抗体溶液和第二抗体溶液的混合，可依次进行，也可同时进行。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤(d)将测定的可检测信号与质控或标准曲线进行比较，从而确定待检测样品中各肿瘤标志物的存在与否，和/或数量。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可检测信号是荧光信号。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微球是平均粒径为2-10μm、且染上不同荧光的聚苯烯微球。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一抗体溶液和第二抗体溶液含有针对以下各组肿瘤标志物的第一抗体和第二抗体(i)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、糖链抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)；(ii)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、糖抗原72-4(CA72-4)、糖抗原50(CA50)；(iii)胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)、糖抗原50(CA50)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)、CYFRA21-1；(iv)癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、癌抗原(CA15-3)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)；(v)总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一抗体溶液中，各第一抗体的浓度为1-100ug/ml，在所述的第二抗体溶液中，各第二抗体的浓度为0.1-200ug/ml。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中用Luminex xMAP法进行检测。
8.一种用于检测多肿瘤标志物的试剂盒，其特征在于，它包括以下组分(a’)第一容器以及装于该容器中的第一抗体溶液，其中所述的第一抗体溶液含有2-50种不同的第一抗体，所述的每一种第一抗体分别抗一种肿瘤标志物并且偶联于不同的微球而形成式I所示的第一抗体-微球的二元复合物，anti1X-bead(I)式中，X表示肿瘤标志物，anti1X表示抗肿瘤标志物X的第一抗体，bead表示微球，-表示第一抗体与微球之间的共价键；(b’)第二容器以及装于该容器中的第二抗体溶液，其中所述的第二抗体溶液含有2-50种不同的带有可检测信号的第二抗体，所述的每一种第二抗体分别抗一种肿瘤标志物且对应于第一抗体溶液中相应的第一抗体，而且对应的第二抗体与第一抗体可同时结合于该肿瘤标志物且第一抗体与第二抗体的摩尔比为1∶0.1-1∶2。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括(c’)用作质控的标准液、或质控液。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的第一抗体溶液和第二抗体溶液含有针对以下各组肿瘤标志物的第一抗体和第二抗体(i)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、糖链抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)；(ii)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、糖抗原72-4(CA72-4)、糖抗原50(CA50)；(iii)胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)、糖抗原50(CA50)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)、CYFRA21-1；(iv)癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、癌抗原(CA15-3)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)；(v)总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)。
10.如权利要求7所述试剂盒的用途，其特征在于，用于检测体外样品中是否存在肿瘤标志物。
全文摘要
本发明公开了一种多肿瘤标志物并行检测的方法，它包括步骤(a)将待测样品与第一抗体溶液混合，形成“肿瘤标志物－第一抗体－微球”三元复合物；(b)将步骤(a)形成的溶液与第二抗体溶液混合，形成“第二抗体－肿瘤标志物－第一抗体－微球”四元复合物；(c)检测四元复合物中不同微球的可检测信号，从而确定待检测样品中各肿瘤标志物的存在与否。本发明方法可简便、快速、准确地同时定性和定量检测多种肿瘤标志物。
文档编号G01N33/533GK1743849SQ20041005425
公开日2006年3月8日 申请日期2004年9月3日 优先权日2004年9月3日
发明者周雪雷, 罗朝领, 蔡勇华, 茅柳娟 申请人:上海透景生命科技有限公司
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