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专利名称：二氧化碳诊断/测定试剂盒及二氧化碳的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种二氧化碳诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定二氧 化碳浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
血液内二氧化碳的含量对人体内酸碱平衡的调节起着重要的作用。血液
pH的恒定是维持生命活动必不可少的条件，血浆中的多种缓冲系统中以碳酸 氢盐缓冲系统最为重要，直接影响血液的pH。
血液内二氧化碳的含量变化主要反映代谢性酸碱平衡紊乱。单纯代谢性 酸或碱中毒时，血液碳酸氢根[HC(V]下降或升高，总二氧化碳也随之下降或 升高。而单纯呼吸性酸或碱中毒时，血液碳酸氢根升高或下降。
总二氧化碳和碳酸氢根的测定方法较可分为直接测定和间接推算两类。 直接测定主要有量气法、量压法、滴定法、比色法、Conway微量扩散法、流
动注射气体扩散法等。间接推算是利用血气分析仪测得的ra与PC02，根据H-H
方程的变换形式
HC03— (m mol /L) =0. 03XPC02(mm Hg) Xantilog(PH-p ka)或 HC03—(m mol/L)二0. 225XPC02(k Pa) Xantilog(PH—p Ka) 计算获得。
式中PH为37。 C时测得值，p ka在37。 C为6. 10。
目前，以间接推算法应用较普遍，由血液分析仪的微处理计算机并与血气 分析结果一起报告，准确性基本可以符合临床要求。
直接测定法以滴定法应用最广泛，但由于受多种因素影响，测定误差较大。
4酶法测定适合自动化分析，结果可靠，应当是很有前途的测定方法，但 目前尚有待深入研究。
检索中国专利发现，申请号为96190276.0、申请日为1996. 02. 06的发明 专利申请公开了一种用来导出病人血液中气体含量的非侵入性的系统和方 法。该系统相应于体积测量呼气中的二氧化碳浓度。然后处理该数据导出动 脉血中二氧化碳气体水平。若数据为时间域，处理可将时间域数据转换成体 积域。该方法也经迭代评估了多个变量的显著性，所得的关系可供快速和准 确地对健康人和患肺病病人进行血中气体含量的测定。近年来，申请号为 02282386. 7、申请日为2002. 10. 29的实用新型专利公开了一种医用的血液碳 酸氢根测定仪，主要由操作面板、进样检测机构、定滴加液机构、搅拌机构 和以单片机为主控元件的电器控制部分组成。其操作面板包括有手动按键、 输入键盘和显示屏；进样检测机构由沿圆周均布样本孔且在孔内放置样本瓶 的样本转盘和竖直装配在转盘下面的驱动电机及对应于检测位样本孔设置的 光电检测器组成；定滴加液机构由配置电机的微量泵和设置于样本孔上方的 定滴头及配置在定滴头滴液口处的计滴器组成；搅拌机构由设置在样本转盘 下方相应位置的搅拌电机和装配在搅拌电机轴上的磁盘及放置于样本瓶内的 搅拌棒组成。
以上专利均与酶法测定无关，这从一个侧面说明，国内此方面的实验研 究十分缺乏。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联 法(Couple Reaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm 波长处吸光度的变化，得以测定二氧化碳浓度的方法，同时，本发明还将给
5出用以实现该方法的二氧化碳诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/ 可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行二氧化碳浓度测定，而且测定 速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明二氧化碳浓度测定方法原理如下
二氧化碳+乙酸+亚铁细胞色素bl 丙酮酸脱氢酶(1)
丙酮酸+高铁细胞色素151+水 丙酮酸+辅酶八+辅酶丙酮酸脱氢酶(2) 二氧化碳+
乙酰辅酶八+还原型辅酶 这种方法应用二个特异性不同的丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶(1)
(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.2.2)酶(偶)联丙酮酸脱氢酶(2) (pyruvate dehydrogenase; EC 1.2丄51)酶促反应连续监测法。丙酮酸脱氢酶(1)作为
作用酶，功能为将二氧化碳酶解产生丙酮酸。丙酮酸脱氢酶(2)作为循环酶
丙酮酸脱氢酶(2)的酶促作用使丙酮酸再次变回二氧化碳，使二氧化碳不断 地被重复循环利用。丙酮酸脱氢酶(2)又作为显色酶，将辅酶(在340nm处 没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还 原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速 度，可以测算出二氧化碳的浓度。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无 论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明二氧化碳诊断/测定试剂盒 较为理想
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L辅酷 . 3 mmol/L
丙酮酸脱氢酶(1) 10000 U/L
丙酮酸脱氢酶(2) 12000 U/L
乙酸 8 mmol/L
亚铁细胞色素bl 2 mmol/L
辅酶A 2 mmol/L
本发明的二氧化碳诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸脱氢酶(1)、丙酮酸脱氢酶(2)、乙 酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶(1)、丙酮酸脱氢酶(2)。 辅酶、丙酮酸脱氢酶(1)、丙酮酸脱氢酶(2)、乙酸、亚铁细胞色素bl、 辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A。试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶(2)。
试剂3
缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶(1)。
辅酶、丙酮酸脱氢酶(1)、丙酮酸脱氢酶(2)、乙酸、亚铁细胞色素bl、 辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状 态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定二氧化碳浓度的方法，其辅酶可 以是NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的二氧化碳诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
丙酮酸脱氢酶(1) 10000 U/L
丙酮酸脱氢酶(2) 12000 U/L
乙酸 8 mmol/L
亚铁细胞色素bl 2mmol/L
辅酶A 2 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光度
《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测二氧化碳样品与试剂的 体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右， 检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出二氧化碳的浓度 大小。 实施例二
本实施例的二氧化碳诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂1
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂
乙酸
亚铁细胞色素bl
辅酶A
50 mmol/L 3 mmol/I> 8 mmol/L 2 mmol/L 2 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
丙酮酸脱氢酶(1) 丙酮酸脱氢酶(2)
100 mmol/L 50 mmol/L 10000U/L 12000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度
《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测二氧化碳样品与试剂1、 试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约 2分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出二氧化碳的浓度 大小。 实施例三
本实施例的二氧化碳诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定剂
辅酶
乙酸
亚铁细胞色素bl 辅酶A
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 8 mmol/L 2 mmol/L 2 mmol/L
试剂
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
丙酮酸脱氢酶(2)
试剂
画mmol/L 500 mmol/L 12000 U/L三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
丙酮酸脱氢酶(1) 10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定二氧化碳浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间 10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测 二氧化碳样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为 正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出二氧化碳的浓度 大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达 到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.042;吸光度 时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可 达10mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过土5 %;试剂测试的 精密度(重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.18 ± 0.09 AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广 应用。
权利要求
1. 一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法的二氧化碳的浓度测定方法，其方法原理如下二氧化碳+乙酸+亚铁细胞色素b1 <u>丙酮酸脱氢酶(1)</u> 丙酮酸+高铁细胞色素b1+水丙酮酸+辅酶A+辅酶 <u>丙酮酸脱氢酶(2)</u> 二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出二氧化碳的浓度大小测定结果。
2. —种二氧化碳诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20—一500 mmol/L稳定剂1——-4000 mmol/L辅酶1—6 mmol/L丙酮酸脱氢酶(1)1000———80000 U/L丙酮酸脱氢酶(2)IOOO-——80000 U/L乙酸1—50 mmol/L亚铁细胞色素bl1—50 mmol/L辅酶A1——50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范 围外，试剂仍会反应作用。可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述二氧化碳诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸脱氢酶(1)、丙酮酸脱氢酶(2)、乙酸、 亚铁细胞色素bl、辅酶A组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述二氧化碳诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸脱氢酶(1)、丙酮酸脱氢酶(2)、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅 酶、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶(1)、丙酮酸脱氢酶(2)组成。辅酶、丙酮酸脱氢酶(1)、 丙酮酸脱氢酶(2)、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A在试剂1或试剂2 中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述二氧化碳诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸脱氢酶(1)、丙酮酸脱氢酶(2)、乙酸、 亚铁细胞色素bl、辅酶A组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅 酶、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、 丙酮酸脱氢酶(2)组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶(1)组成。辅酶、丙酮酸脱氢酶(1)、丙酮酸脱氢酶(2)、乙酸、亚铁细胞色 素bl、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述二氧化碳诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳 定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二 醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的二氧化碳诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定二氧化碳浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、乙酸、亚铁细胞色素b1、辅酶A、丙酮酸脱氢酶(1)、丙酮酸脱氢酶(2)及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出二氧化碳的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464268SQ20071019142
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司