专利名称：一种早期肺癌诊断的决策树模型的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，是一种可用于诊断早期肺癌的决策树模型，为肺癌的早期诊断提供了实验基础。
背景技术：
肺癌发生于支气管粘膜上皮，亦称支气管癌。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率明显增高，在男性癌瘤病人中，肺癌已居首位，女性发病率也迅速增高，占女性常见恶性肿瘤的第2位或第3位。肺癌起源于支气管粘膜上皮，癌肿可向支气管腔内或(和)邻近的肺组织生长，也可通过淋巴、血行或经支气管转移扩散。癌肿的生长速度和转移扩散的情况与癌肿的组织学类型、分化程度等生物学特性有一定关系。一直被认为是蛋白质组学研究的黄金工具一双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 (2D-PAGE)所能检测到的蛋白质也只是蛋白质组中的一小部分，许多种蛋白质尤其是低分子量蛋白(MW<20kD)不能用此方法析出，需要用先进的技术手段进行蛋白质组学研究。而最近几年才发展起来的一种新的蛋白质组学研究方法一表面加强激光解析电极飞行时间质谱技术具有特殊的固相层析表面能够将蛋白质保留在其上，经离子化后用飞行时间质谱仪对其进行检测，直接从未处理的生物样品获取蛋白质组图谱。利用经过特殊处理的固相支持物制成蛋白质芯片，根据蛋白质物理、化学性质的不同，可以非特异性或特异性地结合各种蛋白质，并在质谱仪中受到激光轰击，各种结合蛋白质会被激发而形成带电离子，根据不同电离子在电场中飞行的时间长短，形成强弱不同的质谱峰，进而形成图谱用于分析。这项技术与2D-PAGE相比，操作简单，灵敏度高，检测需要的样品量少。近年来该技术在差异表达蛋白质组、蛋白质相互作用及疾病检测方面得到了广泛的应用，尤其适合于多肽及低分子量蛋白质谱分析。该技术在寻找前列腺、乳腺、卵巢肿瘤等疾病的诊断标记物方面已经取得了较大进展。本发明从决策树的角度，建立了一种可用于诊断早期肺癌的模型，为肺癌的早期诊断提供了实验基础。
发明内容
本发明利用Ciphergen公司的蛋白质芯片飞行时间质谱仪系统，检测早期肺癌和健康人血清的蛋白质谱，利用软件分析早期肺癌与正常人血清不同的对照蛋白质组，发现新的早期肺癌相关性蛋白质，制作成决策树模型，用于诊断早期肺癌。本发明将早期肺癌和健康人血清分别利用Ciphergen公司蛋白质芯片检测，得到数据利用该公司的Biosystems软件的Biomarker wizard功能，分别对早期肺癌和正常组样品的蛋白质波谱进行比较，得出特异的蛋白质图谱，再根据统计分析发现早期肺癌与正常组有统计学显著差异的蛋白质峰，并使用MathWorks公司的Matlab 2009a软件对早期肺癌与对照组差异显著特异蛋白质进行分析，选取4个质谱峰(分别为m/Z4505，m/Z5689，m/ z7580, m/zll245)时正确率最高，为79%。利用这4个质谱峰建立了早期肺癌与正常人的决策树模型，利用该模型，将受检人血清中相应的蛋白质的质荷比与本发明模型逐一进行比对，可为早期肺癌诊断提供辅助指导。决策树模型的检测方法如下1.血清处理采集早期肺癌患者术前血和正常对照外周静脉血后立即放入4°C冰箱保存，备用。 检测时，融解冰冻血清，离心，取血清样品加缓冲液，振摇。2.芯片的平衡芯片孔中加入醋酸钠溶液，平衡芯片2次，每次5min。3.稀释取血清样品，加入尿素，振荡30min，加入醋酸钠溶液中，混勻稀释。4.上样取稀释后的血清样品加入平衡好的芯片加样孔，置芯片于摇床孵育90min。5.样品洗脱取醋酸钠溶液加入芯片加样孔，洗脱2次，每次5min。取去离子水冲洗芯片。6.芯片与蛋白质结合反应取能量吸收剂加入芯片加样孔，待自然挥发后再重复加吸收剂一次。7.芯片检测将芯片置于蛋白芯片阅读机中，用加有标准蛋白质的芯片校正仪器。设置芯片阅读仪参数，用CipheEgen Pmteinchip 3. 1. 1软件收集数据。其中纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比(M/Z)。经过临床试用，该决策树模型可以较好地区分早期肺癌和正常对照，该决策树正确率为79%。
图1肺癌与正常人鉴别的决策树模型图中m/z表示特异蛋白的质荷比，case代表早期肺癌病人，ctrl代表正常人。
具体实施例方式1.材料1. 1检测血清取受试者静脉血5ml，在4度冰箱中静置2小时后离心(4000rpm，5min).取血清， 置低温冰箱(负80度)或液氮保存，备用。1. 2所需主要试剂与仪器乙酸钠、乙腈、三氟乙酸、白芥子酸(SPA)均购自上海化学试剂公司。CMW蛋白芯片和蛋白质芯片阅读机(PBS II型)购自Ciphergen公司。2.方法2. 1芯片的平衡取200ul 50mmol/L pH 4. 0的醋酸钠(NaAc)溶液加入芯片的加样孔中，平衡芯片2次，每次5min。2. 2 稀释取6ul 血清样品，加入 12ul 9mmol/L尿素，振荡 30min，加入 222ul 50mmol/LpH 为3. 0的NaAc溶液中，混勻稀释。2. 3.上样取稀释后的血清样品200ul/孔加入平衡好的芯片加样孔，置芯片于摇床孵育 90mino2. 4.样品洗脱取50mmol/L pH 4. 0的NaAc溶液200ul/孔加入芯片加样孔，洗脱2次，每次5min。 取300ul/孔的去离子水冲洗芯片。2.5.芯片与蛋白质结合反应取能量吸收剂SPA (含饱和白芥子酸溶液与质量分数50%乙腈和0. 15%三氟乙酸)0. 5ul/孔加入芯片加样孔，待自然挥发后再重复加SPA —次。2. 6.芯片检测将芯片置于蛋白芯片阅读机中，用加有AU-in_0ne标准蛋白质的NP20芯片校正仪器至0. 1 %范围内。芯片阅读仪参数设置激光强度150，检测灵敏度7，优化范围1984. 2 9921u，最高分子量49605u，芯片上的每个点采集130次。用CipheEgen Proteinchip 3. 1. 1 软件收集数据。其中纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比(M/Z)。将分析得到的受检者的血清蛋白波谱根据决策树模型(图1)中特异蛋白质质荷比进行比较，以判断受检者是否患有早期肺癌(见实施实例)。实验实例取受检者血清，经检验得到其血清蛋白图谱，按图1早期肺癌与正常组鉴别的决策树模型，观察蛋白质波峰，先看质荷比M/Z为4505的蛋白质，其波峰强度系数A是否 (3. 16，是则再看M/Z为5689的蛋白质，其波峰强度系数A是否彡1. 18，是则为对照组， 否则为病例组。看质荷比M/Z为4505的蛋白质，其波峰强度系数A > 3. 16时再看M/Z为 11245的蛋白质，其波峰强度系数A是否彡0. 14，是则为对照组，否则最后看M/Z为7580的蛋白质，其波峰强度系数A是否< 31. 25，是则为病例组，否则为对照组。以上是对本发明的描述而非限定，基于本发明思想的其它实施方式，均在本发明的保护范围之中。
权利要求
1.用于肺癌早期诊断的决策树模型，其特征在于由蛋白质芯片飞行时间质谱仪系统检测的血清蛋白质图谱经过软件统计分析得到肺癌患者多个特异蛋白质的质荷比(m/z)及其蛋白质波峰强度系数A绘制而成，所说的特异蛋白质的质荷比(m/z)分别为m/z4505，m/ z5689, m/z7580, m/z11245
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，是一种可以用于早期肺癌诊断的决策树模型。本发明运用蛋白质芯片飞行时间质谱系统，检测正常人及早期肺癌病人的外周血清样品，找出与肺癌患者差异显著的特异蛋白质峰，根据各蛋白质峰的质荷比(m/z)，采用决策树算法，建立一个决策树模型。只要将检测人血清中相应的蛋白质的m/z与本发明的模型进行分析，就可以初步用于肺癌诊断。其预测准确率为79％。
文档编号G01N27/64GK102323328SQ20101056169
公开日2012年1月18日 申请日期2010年11月25日 优先权日2010年11月25日
发明者曾华宗 申请人:上海聚类生物科技有限公司
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