专利名称：神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物类免疫检测试剂领域，具体涉及一种神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒及其制备方法与应用，更具体地说，是涉及一种基于磁微粒分离化学发光法定量检测肿瘤标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)的试剂盒及其制备方法，以及应用该试剂盒定量检测肿瘤标志物神经元特异性烯醇化酶的方法。
背景技术：
神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)是参与糖酵解途径的烯醇化酶中的一种，存在于神经组织和神经内分泌组织中。NSE在脑组织细胞的活性最高，夕卜周神经和神经分泌组织的活性水平居中，最低值见于非神经组织、血清和脊髓液。含NSE的细胞破坏后会使NSE释放入血清，因此可以检测出来，正常人血清NSE水平为5 15ng/ml。细胞免疫化学的研究结果揭示，NSE高特异性的定位于神经元和神经内分泌细胞，如APUD细胞系。通过监测因基因表达活性改变和细胞表型转换所致代谢异常的疾病患者的生物体液，如血清和脊髓中的NSE活性水平，可对疾病提供诊断的有用信息。1982年Carney等人首先报道,小细胞肺癌的大多数患者显示血清NSE活性明显增高。其后，许多研究者也相继证明，NSE用于小细胞肺癌诊断，是一个具有高特异性和高灵敏性的肿瘤标记物，其特异性高达80% 90%，诊断灵敏度达80%。虽然NSE的异常表达并不真正构成是小细胞肺癌的早期诊断指标。但是，最重要和最有意义的是，NSE活性水平改变同小细胞肺癌的临床过程具有很好的相关性。相关临床资料分析结果显示，绝大多数患者经化疗或合并放疗后，肿瘤缩�。琋SE明显降低，与治疗前相比具有显著性差异。相反，若NSE在治疗过程中不降低，临床上肿瘤也不见治疗反应。纪树国等人指出，经化疗和放疗后，病情稳定的绝大多数病例NSE活性在正常值范围内波动。NSE活性不见降低的病例，表明病情控制不理想。NSE在神经母细胞瘤诊断中也得到应用，神经母细胞瘤是儿童中常见的实体瘤，它起源于神经脊，通常对它较难做出确切诊断。因为诸如横纹肌肉瘤、Wilms肿瘤等同神经母细胞瘤一样，有时也是由未分化的小燕麦细胞组成。近年来，研究者们应用NSE做出鉴别诊断，当患神经母细胞瘤时，NSE阳性率可达96% 100%，其测定值明显增高。类似的研究证明，NSE活性水平分析，同样可以用来监测神经母细胞瘤的病情改变，评价治疗效果和预报复发。即在治疗后，病情缓解时NSE活性降低，而复发时，NSE活性复又升高。这里有一点特别引人兴趣，Zeltzer等人发现,如果患者血清NSE的初始水平低于100ng/ml,其预后良好，存活率高。反之，如果NSE初始水平高于上述数值，其预后状况不佳，存活率明显为低。因此，临床中十分注意分析患者血清NSE的初始水平，对于实施分类救治方案是有重要意义的。在其他恶性肿瘤中，应用细胞免疫化学方法证明，NSE在非小细胞肺癌的各类型肺癌及其他一些内分泌肿瘤亦会显示出不同的免疫原性反应，为此，Tapia等人认为NSE活性几乎可以在所有的神经内分泌肿瘤中检出。Nakajima认为是肿瘤发生后酶学表达的变化，但可以归结为某些神经内分泌系统的细胞是来源于内胚层细胞，显示出双相或多相分化所致。总之，NSE在小细胞肺癌和神经母细胞瘤等内分泌肿瘤中显示出很高的免疫活性，并可在血清中直接检出，可以用来监测小细胞肺癌和神经母细胞瘤患者的病情发展，评价治疗效果，预报复发，其方法要比X线胸透检查来得早和方便，因此，NSE在临床中已被做为一个十分有用的血清学的肿瘤标记物予以应用。在国内，神经元特异性烯醇化酶(NSE)检测临床上主要以国外进口试剂和免疫组化试剂应用为主，国外进口试剂价格非常昂贵，给患者带来很大的经济负担，不利于在基层普及。具有自主知识产权的国产神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫化学发光检测试剂盒目前还较少，也仅停留在96孔微孔板式技术水平上。该技术灵敏度较低、线性窄、特异性较差，也不利于高通量的全自动检测。另外，由于板式检测试剂的特性，相对效期较短，加上神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗原容易失活，实际使用上，可靠性较低。因此，有待开发对神经元特异性烯醇化酶检测灵敏度高与可靠性并能降低检测成本的检测技术。
发明内容
本发明的一个目的在于针对上述现有技术检测神经元特异性烯醇化酶所存在的问题，提供一种新的可定量检测神经元特异性烯醇化酶的试剂盒，提高检测灵敏度及可靠性，并降低成本，延长有效期。本发明的另一目的在于提供制备神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒的方法。本发明的另一目的在于提供利用所述的试剂盒检测神经元特异性烯醇化酶的方法。一方面，本发明提供了一种神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒，该试剂盒包括以下试剂组分
校准品、磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂以及化学发光底物；其中所述校准品是按照以下方法配制得到的采用还原剂溶液处理神经元特异性烯醇化酶抗原，并稀释至含非离子表面活性剂的蛋白缓冲液中配制得到校准品；其中，所述还原剂为含有二硫键的化合物，优选地，该还原剂选自二硫苏糖醇(2-ME)、二巯基乙醇(DTT)、三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)、赖氨酸中的一种或多种，所述还原剂溶液中还原剂的浓度为5mM 80mM ;所述非离子表面活性剂选自Tween 20、Triton X100、Bronidox中的一种或多种，非离子表面活性剂在蛋白缓冲液中的浓度为O. 01% O. 5% ；所述磁分离试剂是按照以下方法制备得到的将链霉亲和素和磁微粒偶联制得链霉亲和素磁微粒，利用长臂生物素标记神经元特异性烯醇化酶捕获抗体制得生物素化抗体，然后将生物素化抗体与链霉亲和素磁微粒免疫固定，制得磁分离试剂；所述酶反应物包括碱性磷酸酶标记的神经元特异性烯醇化酶示踪抗体；所述稳定增强剂包括抗异嗜性抗体干扰的多组分免疫复合物，该多组分免疫复合物是按照以下方法制备得到的新生牛血清、小鼠血清、绵羊血清按I : 1.5 2.5 0.4 O. 6的体积比混合，加入硫酸铵沉淀过夜,离心’去上清,将沉淀溶于含O. 5%牛血清白蛋白的PBS pH7. 2缓冲液中，70 75°C放置O. 5 2小时，干燥，制得抗异嗜性抗体干扰的多组分免疫复合物；所述化学发光底物为经缓冲液稀释的APS-5化学发光底物。根据本发明的具体实施方案，本发明的神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒还可进一步包括质控品，质控品的配制同标准品。具体地，该质控品是按照以下方法配制得到的采用还原剂溶液处理神经元特异性烯醇化酶抗原，并稀释至含非离子表面活性剂的蛋白缓冲液中配制得到质控品；其中， 所述还 原剂为含有二硫键的化合物，优选地，该还原剂选自二硫苏糖醇、二巯基乙醇、三(2-甲酰乙基)瞵盐酸盐、赖氨酸中的一种或多种，所述还原剂溶液中还原剂的浓度为5mM 80mM ;所述非离子表面活性剂选自Tween 20、TritonX 100、Bronidox中的一种或多种，非离子表面活性剂在蛋白缓冲液中的浓度为O. 01 % O. 5%。根据本发明的具体实施方案，本发明的神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒中，所述校准品是按照以下方法配制得到的(如包含质控品，质控品的具体配制也可按照该方法进行)将神经元特异性烯醇化酶抗原溶解于含5mM 80mM 二硫苏糖醇的PBS pH7. 2缓冲液中至O. 5mg/ml, 15分钟后,加入终浓度为ImM赖氨酸反应5 120分钟；将上述反应物，按不同浓度用含非离子表面活性剂的PBS蛋白缓冲液稀释成不同浓度点，并定标，得到校准品；所述含非离子表面活性剂的PBS蛋白缓冲液组分为磷酸二氢钠 50mM，氯化钠 75mM，Tween 20 O. 02%,Triton XlOO O. 03%，蔗糖 I%，酪蛋白 O. 15%，牛血清白蛋白3%，Proclin 300 O. 02%，氢氧化钠pH 6.8。根据本发明的具体实施方案，本发明的神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒中，所述磁分离试剂是按照以下方法制备得到的磁性微粒与链霉亲和素的偶联取磁微粒，加入MES缓冲液中，加入su lfo-NHS,EDC,反应，之后去上清，洗涤，再加入链霉亲和素反应过夜，制得链霉亲和素磁微粒；更具体的操作可以是取250μ1 5%的磁微粒；用20mM MES pH6. O缓冲液洗涤；去上清后加入 20mM MES ρΗ6· O 缓冲液 400 μ 1，80mg/ml 的 sulfo-NHS 5 100 μ 1，25mg/ml EDC5 100 μ 1，反应30分钟；去上清，用20mM MES pH6. O缓冲液洗涤；加入2mg/ml链霉亲和素150 1000 μ I反应过夜；长臂生物素标记神经元特异性烯醇化酶捕获抗体将神经元特异性烯醇化酶捕获抗体透析至PBS ρΗ7. 2缓冲液中，浓缩至2 10mg/ml，得抗体溶液；将Biotin-LC-LC-NHS溶于PBS ρΗ7· 2至5mg/ml得Biotin-LC-LC-NHS溶液；按摩尔比I : 5 I : 100的比例在抗体溶液中加入Biotin-LC-LC-NHS溶液，反应过夜；次日，透析至PBS pH7. 2缓冲液中，得生物素化抗体；生物素化抗体与链霉亲和素磁微粒免疫固定将链霉亲和素磁微粒用PBS pH7. 2缓冲液稀释至0. 05%，每毫升加入用PBS pH7. 2缓冲液稀释至0. 5 20 μ g/ml的生物素化抗体I毫升，反应4小时；加入含0. 03% TritonXlOOU %蔗糖、5%聚乙二醇6000的PBS pH7. 2缓冲液5毫升；浓缩并真空干燥；再用含0. 15%酪蛋白、0. 5%的牛血清白蛋白、0. 2% Tween20、0. 02% Proclin300的PBS ρΗ7· 2缓冲液复溶；制得磁分离试剂。
根据本发明的具体实施方案，本发明的神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒中，所述酶反应物是按照以下方法配制得到的碱性磷酸酶标记神经元特异性烯醇化酶示踪抗体将碱性磷酸酶透析至PBSpH7. 2缓冲液中；将神经元特异性烯醇化酶示踪抗体透析至PBS pH6. 8缓冲液中；在碱性磷酸酶溶液中加入预先用二甲基亚砜溶解的SMCC溶液，反应5分钟后透析至PBS pH7. 2缓冲液，得活化的碱性磷酸酶溶液；在示踪抗体溶液中加入预先用的用PBS pH6. 8缓冲液溶解的2-IT溶液,反应15分钟后,透析至PBS pH7. 2缓冲液,得活化的示踪抗体溶液；将活化的碱性磷酸酶溶液和活化的示踪抗体溶液混合，反应过夜，得碱性磷酸酶标记的神经元特异性烯醇化酶示踪抗体；将上述碱性磷酸酶标记的神经元特异性烯醇化酶示踪抗体稀释至如下组分的缓冲液中磷酸二氢钠50mM、氯化钠75mM、Tween 20 O. 02%、蔗糖I %、酪蛋白O. 15%、牛血清白蛋白O. 5%、Proclin 300 O. 02%、氢氧化钠pH 6. 8，制得所述酶反应物。根据本发明的具体实施方案，本发明的神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒·中，所述稳定增强剂是按照以下方法配制得到的制备抗异嗜性抗体干扰的多组分免疫复合物将新生牛血清、小鼠血清、绵羊血清按I : 2 : O. 5的体积比混合；加入终浓度为57%的饱和硫酸铵，4摄氏度过夜；次日将处理后的混合血清离心，去上清，将沉淀溶于含O. 5%牛血清白蛋白的PBS pH7. 2缓冲液中，放置于温箱中，72°C放置I小时；用PBS pH7. 2缓冲液稀释至50mg/ml，分装后冷冻干燥；按如下配方配制稳定增强剂磷酸二氢钠50禮，氯化钠75禮，三乙醇胺2%，多组分免疫复合物6 μ g/ml，酪蛋白O. 15%，牛血清白蛋白O. 5% ,Proclin 300 O. 02%，氢氧化钠 pH 6.8。根据本发明的具体实施方案，本发明的神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒中，所述化学发光底物是按照以下方法配制得到的按I : 4 10的比例将APS-5化学发光底物稀释至下列组分的缓冲液中三乙醇胺2 %，二乙醇胺0.75%，CTAB2 %，N，N- 二甲二叮呢硝酸盐0.3%，牛血清白蛋白O. 15 %，BronidoxO. 5%,盐酸 ρΗ9· 5。根据本发明的具体实施方案，本发明的神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒，还进一步包括清洗液。该清洗液主要是用于在检测过程中清洗与磁分离试剂反应后的样品，清洗液的具体组分可以参照所属领域的常规操作进行。通常是磷酸二氢钠、氯化纳、Tween 20、Proclin300的混合溶液,在试剂盒制品中可以浓缩清洗液的形式存在,检测时适当稀释后使用。另一方面，本发明还提供了所述的神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒的制备方法，该方法包括步骤分别配制校准品、磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂、以及化学发光底物；各试剂组分的配制参见前面的记载，此处不再赘述；将校准品、磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂、化学发光底物等各试剂组分独立地置于包装容器内，得到神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒。另一方面，本发明还提供了利用所述的试剂盒定量检测神经元特异性烯醇化酶的方法，该方法包括步骤
-分别加30μ I神经元特异性烯醇化酶标准品、待测样本至对应试管底部；-加45μ I酶反应物至每一试管中；-加45μ I稳定增强剂至每一试管中；-加30μ I磁分离试剂至每一试管中；-用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s后，置37°C水浴15分钟；-试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟；缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
-加清洗液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀；-加200μ I化学发光底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。本发明的关键包括首先，采用还原剂处理神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗原增加其体外稳定性，并稀释至含非离子表面活性剂的蛋白缓冲组分中，增加其分散性，防止自身凝集，保持活性，效期至一年以上；其次，将链霉亲和素和磁微粒偶联，并长臂生物素标记捕获抗体，通过长臂生物素标记抗体和偶联链霉亲和素的磁微粒的免疫结合，延长抗体在磁微粒上的臂展和正确定向，大大提高了免疫固相的应用性能，整体上提高了试剂盒的灵敏度；并且采用了优化的固定化方法，使磁分离组分稳定性良好，效期可至一年以上；进一步，本发明采用不同种属血清球蛋白和少量白蛋白的提�。约岸蕴崛∽榉趾团Ｑ灏椎鞍字湎嗷ト染酆希票付嘧榉置庖吒春衔铮ü庖吒春衔锏奶乇鹱榉痔逑悼山饩鲋琢霰曛疚锛行姆觳庵幸焓刃钥固甯扇诺奈侍猓岣吡酥詹返奶匾煨裕桓徊剑痉⒚饔叛〔捎靡旃倌芡诺牧讲交罨椒ǎ直鸹罨固搴图钚粤姿崦傅陌被坏悖偻ü蚧慕岷辖罨募钚粤姿崦负突罨目固褰岷希岷闲视乓欤陨斫涣停岣吡俗钪帐约梁械牧槊舳群吞匾煨孕阅埽淮送猓诨Х⒐獾孜锓矫妫痉⒚鞑捎昧肆槊舳雀吆推教ㄎ榷ㄆ诔さ腁PS-5底物，并进一步优化了化学发光增强体系，保证了终产品的信号灵敏度高和稳定性好、变异小。本发明的试剂盒中未详细提及的试剂组分(例如清洗液、一些必要的缓冲液等)、试剂盒的外包装以及各试剂组分的独立包装容器等均可以按照所属领域的常规操作进行，符合相关行业规定即可。本发明的方法中未详细提及的操作步骤也可参照所属领域的常规操作进行，例如，在检测前，可将各试剂放至室温(18 25V )，加样前充分混匀；所用检测仪器设备例如化学发光类测定仪的使用按照说明书操作进行。本发明中，未特别注明单位的比例与含量，固体组分为质量比例与含量，液体组分为体积比例与含量。本发明的神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒，具有以下有益效果利用本发明的试剂盒定量检测神经元特异性烯醇化酶，样本和试剂一次加入，SP方便手动操作也利于提高全自动操作效率的神经元特异性烯醇化酶(NSE)磁微粒分离化学发光免疫测定；各试剂组分包括标准品、质控品、磁分离试剂、化学发光底物等稳定性良好，效期可至一年以上；检测灵敏度高，特异性能好、变异小。在本发明中，经过大量实验的工艺优化，得到完善统一工艺，并严格按照标准生产操作规程和质量控制规程进行生产。用户仅需按照操作说明进行规范操作，就可得到可靠的结果。目前该试剂盒已获得国家食品药品监督管理局诊断试剂三类注册证，在临床研究中与国外进口试剂的符合相关性高达95%以上，且费用仅为其1/3。
图I是神经元特异性烯醇化酶(NSE)磁微粒化学发光检测试剂盒标准曲线图。图2是神经元特异性烯醇化酶(NSE)磁微粒化学发光检测试剂盒正常值分布的直方图。图3是神经元特异性烯醇化酶(NSE)磁微粒化学发光检测试剂盒与进口试剂的性能对比。·
具体实施例方式为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中所用各试剂材料均可商购获得，所用各仪器设备也是所属领域的现有仪器设备，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。实施例I本发明中，所述的捕获抗体为能与人体内神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗原特异结合的单克隆抗体，所述的示踪抗体为能与神经元特异性烯醇化酶抗原特异结合的单克隆抗体。捕获抗体和示踪抗体除能与神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗原特异性结合外，配对使用时可与抗原形成“三明治”夹心结构。I、本实施例所用的神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗原采购自天健生物制药(天津)有限公司，本实施例所用的神经元特异性烯醇化酶(NSE)捕获抗体和示踪抗体采购自天健生物制药(天津)有限公司。本实施例中所述的各种缓冲液的配方如下PBS ρΗ7· 2缓冲液
试剂厂商终浓度 IOOOml试剂用量~
憐酸二氧纳 Sigma5OmM 6. Og
氯化纳Sigma75mM 4. 39g
4M 氢氧化纳 SigmaPH 7.2 25mlPBS ρΗ6· 8缓冲液
权利要求
1.一种神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒，该试剂盒包括以下试剂组分 校准品、磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂以及化学发光底物； 其中 所述校准品是按照以下方法配制得到的采用还原剂溶液处理神经元特异性烯醇化酶抗原，并稀释至含非离子表面活性剂的蛋白缓冲液中配制得到校准品；其中，所述还原剂为含有二硫键的化合物，优选地，该还原剂选自二硫苏糖醇、二巯基乙醇、三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐、赖氨酸中的一种或多种，所述还原剂溶液中还原剂的浓度为5mM 80mM ;所述非离子表面活性剂选自Tween 20、Triton X 100、Bronidox中的一种或多种，非离子表面活性剂在蛋白缓冲液中的浓度为O. 01% O. 5% ； 所述磁分离试剂是按照以下方法制备得到的将链霉亲和素和磁微粒偶联制得链霉亲和素磁微粒，利用长臂生物素标记神经元特异性烯醇化酶捕获抗体制得生物素化抗体，然后将生物素化抗体与链霉亲和素磁微粒免疫固定，制得磁分离试剂； 所述酶反应物包括碱性磷酸酶标记的神经元特异性烯醇化酶示踪抗体； 所述稳定增强剂包括抗异嗜性抗体干扰的多组分免疫复合物，该多组分免疫复合物是按照以下方法制备得到的新生牛血清、小鼠血清、绵羊血清按I : I. 5 2.5 : O. 4 O. 6的体积比混合,加入硫酸铵沉淀过夜,离心，去上清,将沉淀溶于含O. 5 %牛血清白蛋白的PBS pH7. 2缓冲液中，70 75°C放置O. 5 2小时，干燥，制得抗异嗜性抗体干扰的多组分免疫复合物； 所述化学发光底物为经缓冲液稀释的APS-5化学发光底物。
2.根据权利要求I所述的神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒，该试剂盒还包括质控品，该质控品是按照以下方法配制得到的采用还原剂溶液处理神经元特异性烯醇化酶抗原，并稀释至含非离子表面活性剂的蛋白缓冲液中配制得到质控品；其中，所述还原剂为含有二硫键的化合物，优选地，该还原剂选自二硫苏糖醇、二巯基乙醇、三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐、赖氨酸中的一种或多种，所述还原剂溶液中还原剂的浓度为5mM 80mM ;所述非离子表面活性剂选自Tween 20、Triton X 100、Bronidox中的一种或多种，非离子表面活性剂在蛋白缓冲液中的浓度为O. 01% O. 5%。
3.根据权利要求I或2所述的神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒，其中，所述校准品是按照以下方法配制得到的 将神经元特异性烯醇化酶抗原溶解于含5mM 80mM 二硫苏糖醇的PBS pH7. 2缓冲液中至O. 5mg/ml, 15分钟后，加入终浓度为ImM赖氨酸反应5 120分钟； 将上述反应物，按不同浓度用含非离子表面活性剂的PBS蛋白缓冲液稀释成不同浓度点，并定标，得到校准品；所述含非离子表面活性剂的PBS蛋白缓冲液组分为磷酸二氢钠50mM，氯化钠 75mM，Tween 200. 02%, Triton XlOO O. 03%，蔗糖 I %，酪蛋白 O. 15%，牛血清白蛋白 3%，Proclin 300 O. 02%，氢氧化钠 pH 6.8。
4.根据权利要求I或2所述的神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒，其中，所述磁分离试剂是按照以下方法制备得到的 磁性微粒与链霉亲和素的偶联取磁微粒，加入MES缓冲液中，加入sulfo-NHS、EDC，反应，之后去上清，洗涤，再加入链霉亲和素反应过夜，制得链霉亲和素磁微粒；更具体的操作可以是取250 μ I 5%的磁微粒；用20mM MES pH6. O缓冲液洗涤；去上清后加入20mM MES卩册.0缓冲液40(^ l,80mg/ml 的 sulfo-NHS 5 100 μ l，25mg/ml EDC5 100 μ I，反应 30分钟；去上清，用20mM MES pH6. O缓冲液洗涤；加入2mg/ml链霉亲和素150 1000 μ I反应过夜； 长臂生物素标记神经元特异性烯醇化酶捕获抗体将神经元特异性烯醇化酶捕获抗体透析至PBS ρΗ7. 2缓冲液中，浓缩至2 10mg/ml，得抗体溶液；将Biotin-LC-LC-NHS溶于PBS ρΗ7· 2至5mg/ml得Biotin-LC-LC-NHS溶液；按摩尔比I : 5 I : 100的比例在抗体溶液中加入Biotin-LC-LC-NHS溶液，反应过夜；次日，透析至PBS pH7. 2缓冲液中，得生物素化抗体； 生物素化抗体与链霉亲和素磁微粒免疫固定将链霉亲和素磁微粒用PBS pH7. 2缓冲液稀释至O. 05%，每毫升加入用PBS pH7. 2缓冲液稀释至O. 5 20 μ g/ml的生物素化抗体I毫升，反应4小时；加入含O. 03% TritonX100、l%蔗糖、5%聚乙二醇6000的PBS pH7. 2缓冲液5毫升；浓缩并真空干燥；再用含O. 15%酪蛋白、O. 5%的牛血清白蛋白、O. 2%Tween20、0. 02% Proclin300的PBS pH7. 2缓冲液复溶；制得磁分离试剂。
5.根据权利要求I或2所述的神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒，其中，所述酶反应物是按照以下方法配制得到的 碱性磷酸酶标记神经元特异性烯醇化酶示踪抗体将碱性磷酸酶透析至PBS pH7. 2缓冲液中；将神经元特异性烯醇化酶示踪抗体透析至PBS pH6. 8缓冲液中；在碱性磷酸酶溶液中加入预先用二甲基亚砜溶解的SMCC溶液，反应5分钟后透析至PBS pH7. 2缓冲液，得活化的碱性磷酸酶溶液；在示踪抗体溶液中加入预先用的用PBS pH6. 8缓冲液溶解的2-IT溶液，反应15分钟后,透析至PBS pH7. 2缓冲液,得活化的示踪抗体溶液；将活化的碱性磷酸酶溶液和活化的示踪抗体溶液混合，反应过夜，得碱性磷酸酶标记的神经元特异性烯醇化酶示踪抗体； 将上述碱性磷酸酶标记的神经元特异性烯醇化酶示踪抗体稀释至如下组分的缓冲液中磷酸二氢钠50mM、氯化钠75mM、Tween 20 O. 02%、蔗糖1%、酪蛋白O. 15%、牛血清白蛋S O. 5%, Proclin 300 O. 02%、氢氧化钠pH 6. 8，制得所述酶反应物。
6.根据权利要求I或2所述的神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒，其中，所述稳定增强剂是按照以下方法配制得到的 制备抗异嗜性抗体干扰的多组分免疫复合物将新生牛血清、小鼠血清、绵羊血清按1:2: O. 5的体积比混合；加入终浓度为57%的饱和硫酸铵，4摄氏度过夜；次日将处理后的混合血清离心,去上清,将沉淀溶于含O. 5%牛血清白蛋白的PBS pH7. 2缓冲液中，放置于温箱中，72°C放置I小时；用PBS pH7. 2缓冲液稀释至50mg/ml，分装后冷冻干燥； 按如下配方配制稳定增强剂磷酸二氢钠50禮，氯化钠75禮，三乙醇胺2%，多组分免疫复合物6 μ g/ml，酪蛋白O. 15%，牛血清白蛋白O. 5% ,Proclin 300 O. 02%，氢氧化钠pH6. 8。
7.根据权利要求I或2所述的神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒，其中，所述化学发光底物是按照以下方法配制得到的 按I : 4 10的比例将APS-5化学发光底物稀释至下列组分的缓冲液中三乙醇胺2%，二乙醇胺O. 75%, CTAB2%, N，N-二甲二叮呢硝酸盐O. 3%，牛血清白蛋白O. 15%,BronidoxO. 5%,盐酸 ρΗ9· 5。
8.根据权利要求I或2所述的神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒，该试剂盒还包括清洗液。
9.权利要求I 8任一项所述的神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒的制备方法，该方法包括步骤 分别配制校准品、磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂、以及化学发光底物； 将校准品、磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂、化学发光底物独立地置于包装容器内，得到神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒。
10.利用权利要求I 8任一项所述的试剂盒定量检测神经元特异性烯醇化酶的方法，该方法包括步骤 -分别加30 μ I神经元特异性烯醇化酶标准品、待测样本至对应试管底部； -加45 μ I酶反应物至每一试管中； -加45 μ I稳定增强剂至每一试管中； -加30 μ I磁分离试剂至每一试管中； -用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30S后，置37°C水浴15分钟； -试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟；缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴； -加清洗液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀； -加200 μ I化学发光底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
全文摘要
本发明涉及一种神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒及其制备方法与应用，该试剂盒包括校准品、磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂以及化学发光底物；校准品是采用还原剂溶液处理NSE抗原并稀释至含非离子表面活性剂的缓冲液中制得；磁分离试剂是将生物素化抗体与链霉亲和素磁微粒免疫固定制得；酶反应物包括碱性磷酸酶标记的NSE示踪抗体；稳定增强剂包括抗异嗜性抗体干扰的多组分免疫复合物。本发明还涉及该试剂盒的制备方法以及应用该试剂盒定量检测肿瘤标志物神经元特异性烯醇化酶的方法。试剂盒性能可靠，灵敏度高，线性范围宽，可配合全自动仪器仪器使用。目前该试剂盒已获得国家食品药品监督管理局诊断试剂三类注册证。
文档编号G01N33/573GK102914650SQ201210199398
公开日2013年2月6日 申请日期2012年6月14日 优先权日2012年6月14日
发明者刘劲, 吕纳新, 周昊, 张小平, 陈 峰, 赵鑫, 宋旭红, 仲维新 申请人:北京大成生物工程有限公司
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