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专利名称：循环肿瘤细胞染色试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术及医学领域，尤其涉及一种循环肿瘤细胞染色试剂盒及其应用。
背景技术：
循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)是实体瘤或转移灶自发脱落或因诊疗操作而进入外周血液循环的肿瘤细胞，它可以驻扎到血液、骨髓、淋巴结或其他健康的器官中，形成新的转移灶。通过检测并鉴定CTCs，有助于发现早期微转移，评估预后，评价治疗效果和实现个体化药物治疗。CTCs已成为肿瘤生物学的一个新的研究热点。目前检测CTCs的方法主要为基于PCR或免疫学的方法，它们都无法获得详细的细胞形态学的信息，并且所需试剂或仪器较昂贵。也有人用染色的方法从形态学角度来鉴定CTCs,如巴氏染色法、H&E染色法和MGG染色法，各种方法特征如下巴氏染色法是国内外广泛使用的组织病理学和细胞病理学染色方法，具有“细胞核结构清晰，分色明显，透明度好，胞浆着色艳丽”优点，但其所需试剂多，操作步骤繁琐，需时长，并且对操作人员技术要求较高。且在应用于细胞病理学染色时，其中的多种化学物质对细胞内蛋白及微细结构有一定破坏作用。H&E染色法H&E染色原理与巴氏染色类似，只是用伊红取代EA36和橘黄G6，其中使用的乙醇-盐酸分化液同样对蛋白质有水解作用，可能使染色质细微结构、特别是细小的核仁消失。同样地，操作步骤较多和需时较长。MGG染色法MGG是May-Griinwald-Giemsa的简称,也是一种常见的细胞病理学染色方法，利用Romanowsky Stain技术原理改良而成。各种细胞及细胞的各种成分由于其化学性质不同，对染色液中的酸性染料(曙红)和碱性染料(亚甲蓝和天青)的亲和力也不一样。因此，相应各类细胞及细胞成分呈现不同的着色，从而达到辨别其形态特征的目的。MGG法染色步骤主要步骤只有三步，需时约I小时，但相比新发明的试剂盒，仍不够简便和省时。

发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种循环肿瘤细胞染色试剂盒及其应用，旨在解决循环肿瘤细胞的染色鉴定操作周期长、程序复杂的问题。本发明实施例是这样实现的，一种循环肿瘤细胞染色试剂盒，包括过滤器和分装的嗜碱性染液、嗜酸性染液、等渗溶液、固定液，其中所述过滤器包括8 U m孔径的滤膜；所述嗜碱性染液为伊红Y的甲醇溶液；所述嗜酸性染液为含有美兰、天青I的pH为6. 6±0. 5的磷酸盐缓冲液；所述固定液为含有多聚甲醛和牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。以及，一种循环肿瘤细胞染色试剂盒在循环肿瘤细胞染色中的应用。
本发明的循环肿瘤细胞染色试剂盒及其应用与现有技术相比，具有以下优点本发明的染色试剂盒制备简单，成本低；本发明的染色试剂盒在应用时操作简便，快捷，所需步骤少，周期短，耗时约两分钟，大大提高了工作效率；利用本发明染色试剂盒的染色方法，集细胞富集与染色于一体，避免了染色过程中的细胞丢失，可对循环肿瘤细胞计数，结果真
实可靠。


图1和图2为利用本发明实施例的循环肿瘤细胞染色试剂盒对前列腺癌肿瘤细胞系PC3的染色结果。 图3和图4为利用本发明实施例的循环肿瘤细胞染色试剂盒对乳腺癌患者血液中循环肿瘤细胞的染色结果。
具体实施例方式为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例提供一种循环肿瘤细胞染色试剂盒，包括过滤器和分装的嗜碱性染液、嗜酸性染液、等渗溶液、固定液，其中所述过滤器包括8 U m孔径的滤膜；所述嗜碱性染液为伊红Y的甲醇溶液；所述嗜酸性染液为含有美兰、天青I的pH为6. 6±0. 5的磷酸盐缓冲液；所述固定液为含有多聚甲醛和牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。在具体的实施例中，该染色试剂盒针对的循环肿瘤细胞可来自于各种癌细胞，包括但不限于乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌，此外，该染色试剂盒也可用于实体肿瘤细胞，即乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌的肿瘤细胞的染色。上述过滤器为可拆卸式过滤器，优选但不限于针头式过滤器，该过滤器中使用的滤膜孔径为8 u m,该孔径可以将大部分的循环肿瘤细胞有效地截留而使小于该孔径的血细胞流出，提高了染色过程的分辨率和染色效率，同时被截留的还有较大的血细胞(包括大淋巴细胞、大单核细胞等)，但这些细胞在截留细胞中只占很小的比例，且其染色后的形态与循环肿瘤细胞有显著区别，因此不会显著影响循环肿瘤细胞鉴定结果。在本发明实施例中使用的滤膜的直径为13mm，当然也可使用其他直径的滤膜。上述嗜碱性染液中伊红Y的浓度为0. 8^1. 2g/L，伊红Y的浓度优选为lg/L，且甲醇为分析级甲醇，该嗜碱性染液优选用0. 22 pm或更小孔径的滤膜过滤以去除过大的颗粒，以降低染色背景，其中伊红Y为酸性染料，可与碱性胞浆结合并将其染成红色或蓝色。上述嗜酸性染液中美兰的浓度为0. 7 1. 3g/L，天青I的浓度为0. 7 1. 3g/L，优选地，美兰和天青I的浓度为lg/L，该嗜酸性染液优选用0. 22 U m或更小孔径的滤膜过滤以去除过大的颗粒，以降低染色背景，所述嗜酸性染液与可将细胞核染成蓝色，通常同时由于伊红Y而显紫红色。上述磷酸盐缓冲液(PBS )溶液制备方法为本领域技术人员熟知，优选但不限于，浓度为10g/L的磷酸氢二钠，12. 5g/L的磷酸二氢钾的水溶液。上述等渗溶液为0. 9% (w/v)氯化钠溶液或5% (w/v)葡萄糖溶液，优选为0. 9% (w/v)氯化钠溶液。上述固定液中含有0. 15 0. 25% (w/v)多聚甲醛(PFA)和0. 08 0. 15%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)，优选地，多聚甲醛的浓度为0. 2% (w/v)，牛血清白蛋白的浓度为0. l%(w/v)，其中固定剂PFA可较好地保持组织细胞结构，BSA起到稳定剂的作用。本发明实施例的循环肿瘤细胞染色试剂盒在染色过程中，集细胞的富集与染色于一体，染色效果好，操作步骤简单，需时短，并可对循环肿瘤细胞进行计数。本发明实施例还提供了本发明的染色试剂盒在肿瘤细胞染色或循环肿瘤细胞染色中的应用。在利用本发明的染色试剂盒进行循环肿瘤细胞染色过程包括以下步骤S01:取血液加入至固定液中得混悬液，固定；将固定后的混悬液经过滤器过滤；S02:向过滤器的滤膜上加入嗜碱性染液，染色后去除该嗜碱性染液；S03:向经嗜碱性染液染色后的滤膜上加入嗜酸性染液，染色后去除该嗜酸性染液；S04:用等渗溶液冲洗滤膜，晾干，封片，镜检。在上述步骤SOl中，上述血液为静脉血，固定前优选进行离心处理并去除上清，以减少血清中其他组分对染色的干扰。上述血液与固定液的比例为1:5 15，固定时间为8 15分钟，血液与固定液优选的比例为1:9，优选的固定时间为10分钟，在使用过滤器过滤时可以使用空气正压力或负压力进行过滤。在上述步骤S02中，在使用本发明实施例的过滤器时上述嗜碱性染液的用量为200-400 ii L，在使用其他规格的过滤器时可相应比例的增加或减少嗜碱性染液的用量，染色时间为30-60秒，在去除该嗜碱性染液时可利用正压或负压将其除去，且尽量将其去除干净，以避免与嗜酸性染液结合而堵塞滤孔。在上述步骤S03中，针对本发明实施例的过滤器时上述嗜酸性染液的用量为200-400 u L，在使用其他规格的过滤器时可相应比例的增加或减少嗜酸性染液的用量，该嗜酸性染液染色时间为30-60秒，在去除该嗜酸性染液时可利用正压或负压将其除去，且尽量将其去除干净，以保持背景的干净。上述步骤S04中，上述等渗溶液后尽量将其冲洗干净。在利用本发明的染色试剂盒进行肿瘤细胞系的染色时，在步骤SOl时，用肿瘤细胞的悬液代替血液加入固定液中固定，其余操作步骤与循环肿瘤细胞染色操作步骤相同。在本发明实施例中，经上述染色处理后，肿瘤细胞或循环肿瘤细胞的细胞核被染成紫红色，胞浆根据嗜碱性程度不同被染红色或蓝色，核仁根据带电荷状态不同染白色或蓝黑色。在显微镜下可以看到，染色后的肿瘤细胞或循环肿瘤细胞形态与其他的尺寸接近的细胞(如大淋巴细胞、大单核细胞等)有显著区别。本发明的染色试剂盒在针对实体肿瘤细胞或循环肿瘤细胞染色时操作简便，快捷，周期短，耗时约两分钟，大大提高了工作效率；该染色工艺集细胞富集与染色于一体，避免了染色过程中的细胞丢失，可对循环肿瘤细胞计数，结果真实可靠。下面结合实施例对本发明进行进一步说明。
实施例I循环肿瘤细胞染色试剂盒的制备1.嗜碱性染液的配制用量筒称取IOOOml分析级甲醇加入至烧杯中，用天平称取Ig伊红Y，加入烧杯中，震摇使伊红Y充分溶解,0. 22um滤膜过滤,室温保存备用。2.嗜酸性染液的配制先用天平称取IOg磷酸氢二钠和12. 5g磷酸二氢钾，溶于1000毫升蒸馏水中，制成PBS溶液，再称取Ig医用美兰、Ig天青I溶于该PBS溶液中，将pH调节至6. 6，0. 22 ii m孔径滤膜过滤，室温保存备用。3.氯化钠溶液配制用量筒称取IOOOml蒸馏水加入烧杯中，用天平称取9克氯化钠加入该烧杯，溶解，0. 22um孔径滤膜过滤，室温保存备用。4.固定液的配制用天平称取IOg磷酸氢二钠和12. 5g磷酸二氢钾，溶于1000毫升蒸馏水中，制成PBS 溶液，其 pH 为 6. 6，加入 0. 2% (w/v) PFA 和 0. 1% (w/v)的 BSA,溶解。5.过滤器的制备取直径为13_，孔径为8 u m的滤膜装入13_规格的针头式过滤器中，组成本发明的染色试剂盒的过滤器。实施例2肿瘤细胞系染色1.取2ml新鲜传代的前列腺癌细胞系PC3，调整细胞浓度至约0. 5X 106/ml，充分混匀。2.用移液枪取I U L (约500个)细胞加入至25ml实施例I制备的固定液中，固定十分钟。3.用实施例I制备的氯化钠溶液润湿过滤器的滤膜。4.将上述含有细胞的固定液用巴氏管转移至过滤器中，利用负压使固定液经滤膜流出，细胞被截留在滤膜上。5.取六孔板，在其中一孔中放置一块合适大小的封口膜，将过滤器放置于封口膜上，以防止过滤器中液体流出。6.向过滤器中滤膜上加300y L嗜碱性染液，染色30秒，利用负压使染液经过滤器流出，尽量将嗜碱性染液去除干净。7.将过滤器再次放置于封口膜上，并向过滤器中加300 y L嗜酸性染液，染色30秒，利用负压使染液经过滤器流出，尽量将嗜酸性染液去除干净。8.向过滤器中加5ml氯化钠溶液，利用负压使氯化钠溶液经过滤器流出，尽量将其去除干净。9.拆开过滤器，取下滤膜，晾干，封片，镜检，染色结果见图1和图2。实验结果如图1和图2所示PC3细胞核质区分明显，核染紫红色，核染色质结构清楚，细胞质染蓝色，核仁染蓝黑色；共计数细胞400多个。实施例3
乳腺癌患者血液样本过滤染色1.用EDTA-2K抗凝的采血管从临床医疗单位的乳腺癌患者采血2. 5ml。2.将血液离心，离心条件400G，10分钟；用移液枪小心吸去上清。3.将上述血液用移液枪转移至25ml固定液中，固定10分钟。4.用5% (w/v)葡萄糖溶液润湿过滤器中的滤膜。5.将上述含血液的固定液用巴氏管转移至过滤器中，利用负压使其经过滤器流出，血液中较大的细胞及循环肿瘤细胞被截留在膜上。6.加适量5%葡萄糖溶液冲洗，利用负压使其流出，尽量将其去除干净。7.取六孔板，在其中一个孔中放一块合适大小的封口膜，将过滤器放置于在封口膜上，以防止过滤器中液体流出。8.往过滤器中加300 ii L嗜碱性染液，染色60秒，利用负压使嗜碱性染液从过滤器流出，尽量将其去除干净。9.向过滤器中加300ii L嗜酸性染液，染色60秒，利用负压使嗜酸性染液从过滤器
流出，尽量将其去除干净。10.向过滤器中加5ml 5%葡萄糖溶液，利用负压使其从过滤器流出，尽量去除干净。11.拆开过滤器，取出滤膜，晾干，封片，镜检，染色结果见图3和图4。实施例4前列腺癌患者血液样本过滤染色1.用EDTA-2K抗凝的采血管从临床医疗单位的前列腺癌患者采血2ml。2.将血液离心，400G，10分钟；用移液枪小心吸去上清。3.将上述去除血清的血液用移液枪转移至18ml固定液中，混匀，固定15分钟。4.用0. 9% (w/v)氯化钠溶液润湿过滤器中的滤膜。5.将上述含血液的固定液用巴氏管转移至过滤器中过滤，血液中较大的细胞及循环肿瘤细胞被截留在膜上。6.加适量0. 9% (w/v)氯化钠溶液冲洗，利用负压使其流出，尽量将其去除干净。其余操作步骤同实施例3的步骤7-11,步骤10中用0. 9% (w/v)氯化钠溶液代替5%葡萄糖溶液。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种循环肿瘤细胞染色试剂盒，包括过滤器和分装的嗜碱性染液、嗜酸性染液、等渗溶液、固定液，其中 所述过滤器包括8 u m孔径的滤膜； 所述嗜碱性染液为伊红Y的甲醇溶液； 所述嗜酸性染液为含有美兰、天青I的PH为6. 6±0. 5的磷酸盐缓冲液； 所述固定液为含有多聚甲醛和牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
2.如权利要求I所述的循环肿瘤细胞染色试剂盒，其特征在于，所述等渗溶液为0.9%w/V氯化钠溶液或5%w/v葡萄糖溶液。
3.如权利要求I所述的循环肿瘤细胞染色试剂盒，其特征在于，所述嗜碱性染液中伊红Y的浓度为0. 8 1.2g/L。
4.如权利要求I所述的循环肿瘤细胞染色试剂盒，其特征在于，所述嗜酸性染液中美兰的浓度为0. 7 I. 3g/L，天青I的浓度为0. 7 I. 3g/L。
5.如权利要求I所述的循环肿瘤细胞染色试剂盒，其特征在于，所述固定液中多聚甲醛的浓度为0. 15^0. 25%w/v，牛血清白蛋白的浓度为0. 08^0. 15%w/v。
6.如权利要求1-5中任一项所述的循环肿瘤细胞染色试剂盒在肿瘤细胞染色或循环肿瘤细胞染色中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为循环肿瘤细胞染色，包括以下步骤 取血液加入至所述固定液中得混悬液，固定；将固定后的混悬液经所述过滤器过滤； 向所述过滤器的滤膜上加入所述嗜碱性染液，染色后去除所述嗜碱性染液； 向经嗜碱性染液染色后的所述滤膜上加入所述嗜酸性染液，染色后去除所述嗜酸性染液； 用所述等渗溶液冲洗滤膜，晾干，封片，镜检。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述血液在加入所述固定液之前经离心处理，并去除血清。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述固定时间为8 15分钟。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述嗜酸性染液和/或所述嗜碱性染液的染色时间为30-60秒。
全文摘要
本发明适用于生物技术及医学领域，提供了一种循环肿瘤细胞染色试剂盒及其应用。该染色试剂盒包括过滤器和分装的嗜碱性染液、嗜酸性染液、等渗溶液、固定液，其中该过滤器包括8μm孔径的滤膜；该嗜碱性染液为伊红Y的甲醇溶液；该嗜酸性染液为含有美兰、天青I的磷酸盐缓冲液；该固定液为含有多聚甲醛和牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。本发明的染色试剂盒染色效果好，而且制备简单，成本低，操作简便，需时短，大大提高了工作效率。
文档编号G01N1/30GK102980793SQ201210471758
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者李胜, 高杰, 王俊, 蔡从利, 周鹏飞 申请人:武汉友芝友生物制药有限公司