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专利名称：基于荧光量子点编码二氧化硅球进行多种转基因植物的检测方法
技术领域：
一种基于荧光量子点编码二氧化
硅球进行多种转基因植物的检测方法，属于材料应用技术领域。
背景技术：
量子点，又可称为纳米晶，英文名称quantum dots，简称QDs，是一种由II-VI族或III-V族元素组成的粒径在1 IOnm间纳米颗粒。QDs具有量子尺寸效应和表面效应， 受激后可以发射荧光。和传统荧光染料相比，QDs具有宽的激发光谱、窄的发射光谱和高的荧光量子产率。QDs已逐渐取代染料作为一种新型的生物标记材料，广泛应用于细胞成像、 免疫荧光技术、活体成像、核酸识别方面，同时在实现高灵敏度、高通量的生物分析和检测方面表现重大前景。二氧化硅，英文名称silicon dioxide，是一种透明的惰性材料。二氧化硅的合成技术已经相当成熟，其表面含有比较丰富的硅羟基，可以在此基础上修饰各种官能团，比如氨基、羧基、巯基等，更好地实现和目标生物分子的偶联。本发明将不同数量、不同荧光特性的量子点包裹于二氧化硅球中，使二氧化硅球具有不同光谱特征和亮度特征，可进行多元光学编码二氧化硅球。目前国内外只是集中在 QDs编码聚苯乙烯微球的研究。本发明采用QDs编码二氧化硅球，不仅对QDs的荧光性没有影响，能够阻止环境中的氧向纳米晶体扩散，有效抑制纳米晶体由于光氧化导致的降解，而且能够阻止包覆后的纳米晶体在水相中的聚集，提高纳米晶体的稳定性。本发明采用反相微乳法合成荧光量子点编码二氧化硅球，该方法合成的二氧化硅球结构大小均一，荧光强度好。合成后的荧光量子点编码二氧化硅球和特定DNA片段偶联作为一种荧光探针，进行转基因植物的检测。根据二氧化硅球中编码的量子点种类和数目不同，不同编码的二氧化硅球具有不同的荧光强度比值，可实现多元转基因序列的检测。

发明内容
本发明的目的是提供一种荧光量子点编码二氧化硅球进行多元转基因检测的方法。该方法制备的二氧化硅球结构均一，单分散性好，荧光强度好，并实现了多种转基因植物的检测。本发明的技术方案一种荧光量子点编码二氧化硅球进行多种转基因植物的检测方法
A、采用下列不同体积比荧光量子点编码二氧化硅球的制备
535nmQDs 629nmQDs=2 1，
535nmQDs 629nmQDs=l 2，
535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2，
535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l :2:2
4(1)将15mL的曲拉通和15mL的正己醇混合IOminJnA60mL的环己烷，搅拌20min ；
(2)取1400μ L 535nmQDs和700 μ L 629nmQDs混合均勻，加入到步骤(1)溶液中，均勻搅拌30min，配置成微乳体系；
(3)向上述微乳体系中加入2mL氨水，混合30min，加入^iL正硅酸四乙酯TEOS和2mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES，水解12h ；
(4)加入15mL丙酮破乳，搅拌30min，离心醇洗3次，将二氧化硅球分散在水中，制得 535nm :629nmQDs=2 :1编码的二氧化硅球；
(5)调节QDs的种类和比例，制备其它三种荧光QDs编码的二氧化硅球
取700 μ L 535nmQDs和1400 μ L 629nmQDs混合，其他按上述相同条件制得 535nmQDs 629nmQDs=l 2 编码的二氧化硅球；
取 500 μ L 535nmQDs, 500 μ L 602nmQDs 和 1000 μ L 650nmQDs 混合，其他按上述相同条件制得 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2 编码的二氧化硅球；
取 400 μ L 535nmQDs,800 μ L 602nmQDs 和 800 μ L 650nmQDs 混合，其他按上述相同条件制得 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l :2:2 编码的二氧化硅球； B、量子点编码二氧化硅球检测转基因玉米、大豆、油菜、棉花
(1)分别制备编码的二氧化硅球-probeDNA偶联物
取2μ L羧基修饰的probe DNA 1，加入50 μ L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC和50 μ L的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，活化30min后，加入100 μ L的 535nmQDs 629nmQDs=2 1编码二氧化硅球水溶液中，反应浊，离心洗涤3次，制得编码的二氧化硅球-probe DNA 1偶联物；
同样probe DNA 2活化后和535nmQDs 629nmQDs=l 2编码二氧化硅球偶联，离心洗涤3次，制得编码的二氧化硅球-probe DNA 2偶联物；
probe DNA 3 活化后和 535nmQDs :602nmQDs 650nmQDs=l :1:2 编码的二氧化硅球偶联，离心洗涤3次，制得编码的二氧化硅球-probe DNA 3偶联物；
probe DNA 4 活化后和 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2 编码的二氧化硅球偶联，离心洗涤3次，制得编码的二氧化硅球-probe DNA 4偶联物；
(2)将四种Target DNAl, Target DNA2, Target DNA3, Target DNA4 各取取 2 μ L 混合在200 μ L、ρΗ为7. 4的磷酸盐缓冲液中，加入100 μ L的535nmQDs :629nmQDs=2 :1编码二氧化硅球-probe DNA1，室温杂交12h，离心，分别将上清液和沉淀放在不同的管中；
将沉淀离心、超纯水洗涤3次，分散在200 μ L、ρΗ为7. 4的磷酸盐缓冲液中，加入经氨基-6-甲基香豆素乙酸盐AMCA染料标记的capture DNA1，室温杂交12h，离心洗涤3次，取沉淀分散在200 μ L、ρΗ为7. 4的磷酸盐缓冲液中，进行荧光扫描，即得到进行Target 1检测的荧光谱图，进行转基因玉米的检测；
(3)在步骤(2)离心所得上清液中加入100μ L的535nmQDs 629nmQDs=l 2编码二氧化硅球-probe 2，室温杂交12h，离心，分别将上清液和沉淀放在不同的管中；
将沉淀离心洗涤3次，分散在200 μ L、ρΗ为7. 4的磷酸盐缓冲液中，加入AMCA标记的 capture DNA2,室温杂交12h，离心洗涤3次，取沉淀分散在200 μ L、ρΗ为7. 4的磷酸盐缓冲液中，进行荧光扫描，即得到进行target 2检测的荧光谱图，进行转基因大豆的检测；
(4)在步骤(3)离心所得上清液中加入100μ L 的5;35nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2编码二氧化硅球-probe 3，室温杂交12h，呙心，分别将上清液和沉淀放在不同的管中；
将沉淀离心洗涤3次，分散在200 μ L、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，加入AMCA标记的 capture DNA3,室温杂交12h，离心洗涤3次，取沉淀分散在200 μ L、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，进行荧光扫描，即得到进行target 3检测的荧光谱图，进行转基因油菜的检测；
(5)在步骤(4)离心所得上清液中加入100 μ L 的5;35nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2编码二氧化硅球-probe 4，室温杂交12h，离心，分别将上清液和沉淀放在不同的管中；
将沉淀离心洗涤3次，分散在200 μ L、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，加入AMCA标记的 capture DNA4,室温杂交12h。离心洗涤3次，取沉淀分散在200 μ L、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，进行荧光扫描，即得到进行target 4检测的荧光谱图，进行转基因棉花的检测。—种荧光量子点编码二氧化硅球进行多元转基因检测的方法，包括荧光量子点编码二氧化硅球的合成，硅球的修饰，多元转基因成分的检测。上述步骤简明表示为
(1)将正己醇、曲拉通和环己烷均勻混合，加入不同种类、特定比例的QDs的水溶液， 搅拌均勻配置成微乳体系。加入氨水、正硅酸四乙酯(TEOS)和3-氨丙基三乙氧基硅烧 (APTES )，水解 1 1。(2)水解后，加入丙酮破乳，离心醇洗三次。(3)将二氧化硅硅球分散在杂交缓冲液中，加入probe DNAs，target DNAs和 capture DNAs进行sandwich杂交，室温12h,离心洗涤。(4)将杂交后的二氧化硅硅球体系，进行荧光扫描，得到荧光谱图。本发明的有益效果本发明方法操作简便易行，合成的二氧化硅球结构均一、形状规则、单分散好，二氧化硅球的荧光性好，成功实现了荧光量子点编码二氧化硅球检测多种转基因植物的目的。图 1 535nm 629nmQDs=2 1编码二氧化硅球的透射电镜照片。图 2 535nm 629nmQDs=2 1编码的二氧化硅球进行转基因玉米检测,图 3 535nm 629nmQDs=2 2编码的二氧化硅球进行转基因大豆检测,535nm 602nmQDs=1 1:2编码的二氧化硅球进行转基因油菜检测。 535nm 602nmQDs 650nmQDs=122编码的二氧化硅球机型转基因棉花检测。
具体实施方式
实施例1
所用535nmQDs，602nmQDs，629nmQDs，650nmQDs量子点均购自武汉珈源有限公司。采用下列不同体积比
535nmQDs 629nmQDs=2 1，535nmQDs 629nmQDs=l 2，
535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2，
535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2编码二氧化硅球的制备及其在进行转基因玉米、大豆、油菜、棉花检测中的应用。1.荧光量子点编码二氧化硅球的制备
(1)将15mL的曲拉通和15mL的正己醇混合IOminJnA 60mL的环己烷，搅拌20min。(2)取1400yL 5;35nmQDs和700 μ L 6^nmQDs混合均勻，加入到上述溶液中，均勻搅拌30min，配置成微乳体系。(3)向上述体系中加入2mL氨水，混合30min，加入2mL的TEOS和2mL的APTES，水解 12h。(4)加入15mL丙酮破乳，搅拌30min，离心醇洗3次，将二氧化硅球分散在水中，制得535nm :629nmQDs=2 :1编码的二氧化硅球。(5)调节QDs的种类和比例，制备其它三种荧光QDs编码的二氧化硅球。取 700μ L 535nmQDs 和 1400μ L 629nmQDs 混合，制得 535nmQDs 629nmQDs=l 2 编码的二氧化硅球。同样取 500 μ L 535nmQDs, 500 μ L 602nmQDs 和 1000 μ L 650nmQDs 混合，制得 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2 编码的二氧化硅球。取 400 μ L 535nmQDs, 800μ L 602nmQDs 禾口 800μ L 650nmQDs 混合，制得 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2编码的二氧化硅球。2、量子点编码二氧化硅球检测转基因玉米、大豆、油菜、棉花 (1)分别制备编码的二氧化硅球-probe DNA偶联物
取2μ L羧基修饰的probe DNA 1，加入50 μ L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和50yL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化30min后，加入100 μ L的 535nmQDs 629nmQDs=2 1编码二氧化硅球水溶液中，反应浊。离心洗涤3次，制得编码的二氧化硅球-probe DNA 1偶联物。同样probe DNA 2活化后和535nmQDs 629nmQDs=l 2编码二氧化硅球偶联， probe DNA 3 活化后和 535nmQDs :602nmQDs 650nmQDs=l 1 2 编码的二氧化硅球偶联，probe DNA 4 活化后和 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2 编码的二氧化硅球偶联。离心洗涤3次，分别制得编码的二氧化硅球-probe DNA 2偶联物，制得编码的二氧化硅球-probe DNA 3偶联物，制得编码的二氧化硅球-probe DNA 4偶联物。(2)将四种 Target DNAl, Target DNA2, Target DNA3, Target DNA4 各取取 2 μ L 混合在200 μ L、ρΗ为7. 4的磷酸盐缓冲液中，加入100 μ L的535nmQDs :629nmQDs=2 :1编码二氧化硅球-probe DNA1，室温杂交12h，离心，分别将上清液和沉淀放在不同的管中。将沉淀离心、超纯水洗涤3次，分散在200 μ L、ρΗ为7. 4的磷酸盐缓冲液中，加入经氨基-6-甲基香豆素乙酸盐(AMCA)染料标记的capture DNA1，室温杂交12h，离心洗涤3 次，取沉淀分散在200 μ L、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，进行荧光扫描，即得到进行Target 1检测的荧光谱图。用于进行转基因玉米的检测。(3)在步骤(2)离心所得上清液中加入100 μ L的535nmQDs 629nmQDs=l 2编码二氧化硅球-probe 2，室温杂交12h，离心，分别将上清液和沉淀放在不同的管中。将沉淀离心洗涤3次，分散在200 μ L、ρΗ为7. 4的磷酸盐缓冲液中，加入AMCA标记的capture DNA2,室温杂交12h。离心洗涤3次，取沉淀分散在200 μ L、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，进行荧光扫描，即得到进行target 2检测的荧光谱图。用于进行转基因大豆的检测。 (4)在步骤(3)离心所得上清液中加入100μ L的5;35nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2编码二氧化硅球-probe 3，室温杂交12h，离心，分别将上清液和沉淀放在不同的管中。 将沉淀离心洗涤3次，分散在200 μ L、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，加入AMCA标记的capture DNA3,室温杂交12h。离心洗涤3次，取沉淀分散在200 μ L、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，进行荧光扫描，即得到进行target 3检测的荧光谱图。用于进行转基因白菜的检测。(5)在步骤(4)离心所得上清液中加入100μ L的5;35nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2编码二氧化硅球-probe 4，室温杂交12h，离心，分别将上清液和沉淀放在不同的管中。将沉淀离心洗涤3次，分散在200 μ L、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，加入AMCA标记的capture DNA4,室温杂交12h。离心洗涤3次，取沉淀分散在200 μ L、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，进行荧光扫描，即得到进行target 4检测的荧光谱图。用于进行转基因棉花的检测。所述的DNA列表如表1所示。表 权利要求
1. 一种荧光量子点编码二氧化硅球进行多种转基因植物的检测方法，其特征在于A、采用下列不同体积比荧光量子点编码二氧化硅球的制备 535nmQDs 629nmQDs=2 1，535nmQDs 629nmQDs=l 2，535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2，535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l :2:2(1)将15mL的曲拉通和15mL的正己醇混合IOminJnA60mL的环己烷，搅拌20min ；(2)取1400μ L 535nmQDs和700 μ L 629nmQDs混合均勻，加入到步骤(1)溶液中，均勻搅拌30min，配置成微乳体系；(3)向上述微乳体系中加入2mL氨水，混合30min，加入^iL正硅酸四乙酯TEOS和2mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES，水解12h ；(4)加入15mL丙酮破乳，搅拌30min，离心醇洗3次，将二氧化硅球分散在水中，制得 535nm :629nmQDs=2 :1编码的二氧化硅球；(5)调节QDs的种类和比例，制备其它三种荧光QDs编码的二氧化硅球取700 μ L 535nmQDs和1400 μ L 629nmQDs混合，其他按上述相同条件制得 535nmQDs 629nmQDs=l 2 编码的二氧化硅球；取 500 μ L 535nmQDs, 500 μ L 602nmQDs 和 1000 μ L 650nmQDs 混合，其他按上述相同条件制得 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2 编码的二氧化硅球；取 400 μ L 535nmQDs,800 μ L 602nmQDs 和 800 μ L 650nmQDs 混合，其他按上述相同条件制得 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2 编码的二氧化硅球；B、量子点编码二氧化硅球检测转基因玉米、大豆、油菜、棉花(1)分别制备编码的二氧化硅球-probeDNA偶联物取2μ L羧基修饰的probe DNA 1，加入50 μ L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC和50 μ L的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，活化30min后，加入100 μ L的 535nmQDs 629nmQDs=2 1编码二氧化硅球水溶液中，反应浊，离心洗涤3次，制得编码的二氧化硅球-probe DNA 1偶联物；同样probe DNA 2活化后和535nmQDs 629nmQDs=l 2编码二氧化硅球偶联，离心洗涤3次，制得编码的二氧化硅球-probe DNA 2偶联物；probe DNA 3 活化后和 535nmQDs :602nmQDs 650nmQDs=l :1:2 编码的二氧化硅球偶联，离心洗涤3次，制得编码的二氧化硅球-probe DNA 3偶联物；probe DNA 4 活化后和 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2 编码的二氧化硅球偶联，离心洗涤3次，制得编码的二氧化硅球-probe DNA 4偶联物；(2)将四种Target DNAl, Target DNA2, Target DNA3, Target DNA4 各取取 2 μ L 混合在200 μ L、ρΗ为7. 4的磷酸盐缓冲液中，加入100 μ L的535nmQDs :629nmQDs=2 :1编码二氧化硅球-probe DNA1，室温杂交12h，离心，分别将上清液和沉淀放在不同的管中；将沉淀离心、超纯水洗涤3次，分散在200 μ L、ρΗ为7. 4的磷酸盐缓冲液中，加入经氨基-6-甲基香豆素乙酸盐AMCA染料标记的capture DNA1，室温杂交12h，离心洗涤3次，取沉淀分散在200 μ L、ρΗ为7. 4的磷酸盐缓冲液中，进行荧光扫描，即得到进行Target 1检测的荧光谱图，进行转基因玉米的检测；(3)在步骤(2)离心所得上清液中加入100μ L的535nmQDs 629nmQDs=l 2编码二氧化硅球-probe 2，室温杂交12h，离心，分别将上清液和沉淀放在不同的管中；将沉淀离心洗涤3次，分散在200 μ L、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，加入AMCA标记的 capture DNA2,室温杂交12h，离心洗涤3次，取沉淀分散在200 μ L、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，进行荧光扫描，即得到进行target 2检测的荧光谱图，进行转基因大豆的检测；(4)在步骤(3)离心所得上清液中加入100μ L 的5;35nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2编码二氧化硅球-probe 3，室温杂交12h，离心，分别将上清液和沉淀放在不同的管中；将沉淀离心洗涤3次，分散在200 μ L、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，加入AMCA标记的 capture DNA3,室温杂交12h，离心洗涤3次，取沉淀分散在200 μ L、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，进行荧光扫描，即得到进行target 3检测的荧光谱图，进行转基因油菜的检测；(5)在步骤(4)离心所得上清液中加入100μ L 的5;35nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2编码二氧化硅球-probe 4，室温杂交12h，离心，分别将上清液和沉淀放在不同的管中；将沉淀离心洗涤3次，分散在200 μ L、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，加入AMCA标记的 capture DNA4,室温杂交12h ；离心洗涤3次，取沉淀分散在200 μ L、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，进行荧光扫描，即得到进行target 4检测的荧光谱图，进行转基因棉花的检测。
全文摘要
基于荧光量子点编码二氧化硅球进行多种转基因植物的检测方法，属于材料应用技术领域。本发明采用反相微乳法制备的二氧化硅球结构均一，过程简单易操作，控制QDs的种类和比例能够准确编码二氧化硅球，二氧化硅对QDs的荧光起到保护作用，提高QDs的稳定性。利用荧光量子点编码二氧化硅球成功实现了多种转基因植物检测的目的。
文档编号G01N21/64GK102169089SQ20101060467
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者王利兵, 胥传来, 赵媛, 郝昌龙, 陈伟 申请人:江南大学