专利名称：一种检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及羊驼副结核分支杆菌(Mycobacterium paratuberculosis, MAP)的 hed(Host expression dependent)蛋白间接ELISA检测试剂盒及其检测方法，属于生物技 术领域。
背景技术：
羊驼原产于南美洲安第斯山脉，与驼羊、骆马、原驼共同属于美洲驼属，被称为南 美小型驼。驼绒有22种天然色，是高级毛纺原料，具有“软黄金”之称；其皮可制成地毯、 被子等；其肉蛋白质含量高，味道鲜美。羊驼是一种很有市场前景的经济动物，我国山西于 2000年首次从澳大利亚引进羊驼，随后在新疆维吾尔自治区等地区也先后引进羊驼，为我 国农牧民增收增添了新的亮点。羊驼副结核病是由副结核分支杆菌(Mycobacterium paratuberculosis, MAP)引 起的羊驼的一种慢性传染性肠炎，羊驼价格昂贵，一旦羊驼牧场被大面积传染该�。斐傻� 经济损失将是巨大的。副结核病的检测常采用皮内变态反应、补体结合试验等，但是皮内变 态反应需要检测活动物，且灵敏度较低；补体结合试验灵敏度较低，且检测很不方便。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒及其检测方法， 该检测方法特异性高，灵敏度高，方便，快速，适合大规模样品检测。本发明提供一种检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒，包含下列试剂(1)、副结核分支杆菌重组hed蛋白；(2)、羊驼副结核阳性对照血清、阴性对照血清。所述试剂盒还可以包含酶标板、包被液、封闭液、PBST、辣根过氧化物酶标记的金 黄色葡萄球菌蛋白A(HRP-SPA)、显色液配制原料和终止液；所述包被液是浓度为lmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH 7. 5 ；所述封闭液是质量浓度为2%的明胶溶液；所述PBST 的组成是=Na2HPO4 2. 9g/L, KH2PO4 0. 2g/L, NaCl 8. 0g/L, KCl 0. 2g/L, Tween-20体积浓度为0. 05%，其pH为7. 4 ；所述显色液配制原料包括①由Na2HPO4 ·12Η20 18. 408g/L，柠檬酸5. 106g/L组成 的磷酸盐_柠檬酸盐缓冲液，PH 5. 0 ；②邻苯二胺；③体积浓度为30%的H2O2水溶液；所述终止液是浓度为2mol/L的H2SO4溶液。本发明还提供采用上述试剂盒检测羊驼副结核分支杆菌抗体的方法，按如下步 骤(1)、包被副结核分支杆菌重组hed蛋白用包被液稀释至3. 75 μ g/mL,于酶标板 各孔中分别加入100 μ L，4°C包被过夜，用PBST洗涤5次；(2)、封闭每孔加入300 μ L封闭液，4°C封闭过夜，用PBST洗涤5次；
(3)、加入待检样品以PBST分别将阳性对照血清、阴性对照血清、待检血清按体 积1 50稀释，每孔中加入100yL，37°C孵育60min，用PBST洗涤5次；(4)、加入辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌蛋白A 用PBST将辣根过氧化物 酶标记的金黄色葡萄球菌蛋白A作1 5000稀释，每孔中加入100yL，37°C孵育60min，用 PBST洗涤5次；(5)、配制并加入显色液临显色之前向所述磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中加入邻苯 二胺，使邻苯二胺浓度达到0. 4g/L，然后加入所述的H2O2水溶液0. 15mL,即获得显色液；每 孔加入该显色液100μ L，37°C避光孵育15min ；(6)、终止每孔加入100 μ L终止液终止反应，酶标仪测定每孔的OD49tlnm值；(7)、判定待检血清孔的OD49tlnm值彡阴性对照血清孔的OD49tlnm值+0. 24，判为阳性； 反之判为阴性。本发明提供的检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒，引入了特异性强、且高效 表达的副结核分支杆菌hed蛋白，用它作为检测抗原，直接检测羊驼抗副结核分支杆菌抗 体，具有良好的特异性和灵敏度。用本试剂盒检测羊驼副结核分支杆菌抗体方法简便、快速 且准确，适合大批量样品检测。
具体实施例方式实施例1副结核分支杆菌重组hed蛋白的制备1.引物设计从GenBank上调取MAP的基因序列(X16293)，用DNAStar软件分析 hed (Host expression d印endent)基因的抗原性，选取抗原性较好的840bp片断作 为扩增目的基因，上游引物Pl :5，-ATAGGATCCGGTAGTTACCGCGGCGAA-3’，下游引物P2 5’ -CGCAAGCTTTTAGGTGTGGCGTT TTC-3，，限制性内切酶位点为 BamH I 和 Hind III。2. hed基因的扩增、克隆提取副结核分支杆菌K-IO的基因组DNA，进行PCR扩增，采用50 μ L体系体积 IOXEx Taq Buffer 5 μ L, dNTPs (IOmM) 4 μ L，Mg2+(25mM) 4 μ L，TaKaRaEx Taq 酶(5U/ μ L)0. 3 μ L，上游引物 Pl (20pmol/L) 1 μ L，下游引物 P2(20pmol/L) 1 μ L，超纯水 32. 7 μ L， 模板DNA2y L。反应程序为:94°C预变性 5min，94°C 45s, 57°C 45s, 72°C 45s，35 个循环；72°C 延伸lOmin。扩增产物电泳、回收后，克隆至pGEM-T，获得重组质粒pGEM-T-hed。按照碱裂解 法提取重组质粒，BamH I和Hind III双酶切后电泳，回收大小为840bp的特异性目的片段， 与重组载体pET-32a(+)用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)按照说明书的条件进行连接，按照 常规方法转化到感受态细胞E. coli BL21(DE3)中，筛选到阳性表达质粒(pET-32a-hed)。 对表达质粒pET-32a-hed进行PCR扩增、BamH I和Hind III双酶切，电泳后在大小约为 840bp处均出现特异性条带。对表达质粒pET-32a-hed进行测序，结果经DNAStar软件分析 发现，PCR扩增片段与X16293序列同源性为99. 5%，推导的氨基酸序列与已报道的氨基酸 序列相同。3.副结核分支杆菌重组hed蛋白的表达及纯化将含有表达质粒pET-32a_hed的E. coli BL21 (DE3)于LB培养基中培养至对数生 长期(OD6tltlmin为0. 6-0. 8)，加入IPTG至浓度为0. 8mM,诱导4h后离心，菌体沉淀用PBS缓冲液重悬，超声裂解后离心，沉淀用6M的尿素溶液溶解，离心，上清用0. 45 μ m微孔滤膜过滤 后，用His Bind Purification Kit (Novagen公司)按照说明书的方法纯化副结核分支杆 菌重组hed蛋白。纯化的重组蛋白用SDS-PAGE电泳分析，观察到约49. 5kD的特异性蛋白 条带，大小与预计相似，说明纯化的副结核分支杆菌重组hed蛋白的纯度较好。实施例2鉴定副结核分支杆菌重组hed蛋白的反应原性和免疫原性1.免疫转印将实施例1纯化的重组hed蛋白经SDS-PAGE电泳后，凝胶用半干转印仪 (Bio-Rad)电转印至PVNF膜(Osmonics公司)。将转印后的PVNF膜用1% (m/v)牛血清 白蛋白封闭，加入1 100稀释的羊抗副结核阳性血清(中国兽药监察所)，37°C作用1.5h 后洗膜；加入1 10000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊IgG，37°C作用Ih后 洗膜；用3，3-二氨基联苯胺(DAB)显色5min后，显示单一的特异性条带，大小与重组蛋白 相似，说明重组蛋白具有良好的反应原性。2.小鼠免疫试验纯化的重组hed蛋白用PBS缓冲液稀释至400 μ g/mL，加入等量的弗氏完全佐剂 (GIBC0公司)乳化，腹部皮下注射4周龄清洁级雄性小鼠，0. 2mL/只，共10只，每2周加强 免疫1次，共加强免疫2次，最后一次免疫IOd后采血分离血清，用ELISA方法检测血清抗 体。结果显示血清抗体效价大于1 6400，说明重组hed蛋白具有良好的免疫原性。ELISA反应程序为重组hed蛋白用lmol/L的Tris-HCl (pH为7. 5)稀释至 4.4yg/mL，4°C包被过夜；2% (质量浓度)明胶4°C封闭过夜；小鼠血清自1 100起始做 2倍倍比稀释，加入酶标板每孔100yL，37°C作用1. 5h ；HRP标记的羊抗鼠二抗(辣根过氧 化物酶标记的羊抗鼠二抗)1 1000稀释，37°C作用l.Oh;邻苯二胺(OPD) 37°C避光显色 15min ；硫酸终止反应后，测定OD49tlnm值，然后计算抗体效价。实施例3本发明试剂盒的组成及制备检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒包括下列试剂(1)、副结核分支杆菌重组hed蛋白(制备方法见实施例1)；(2)、羊驼副结核阳性对照血清、阴性对照血清；(3)、酶标板；(4)、包被液浓度为 lmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液，pH 7. 5 ；(5)、封闭液质量浓度为2%的明胶溶液；(6)、PBST =Na2HPO4 2. 9g/L, KH2PO4 0. 2g/L, NaCl 8. Og/L, KCl 0. 2g/L, Tween-20 体积浓度为0. 05 %，其pH为7. 4 ；(7)、辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌蛋白A (HRP-SPA)；(8)、显色液配制原料①由Na2HPO4 ·12Η20 18. 408g/L，柠檬酸5. 106g/L组成的磷 酸盐_柠檬酸盐缓冲液，PH 5. 0 ；②邻苯二胺；③体积浓度为30%的H2O2水溶液；(9)、终止液浓度为2mol/L的H2SO4溶液。其中，阴性对照血清的制备如下选取10头临床健康的青年公羊驼，用补体结合 试验和变态反应检测均为阴性，采取血清用实施例4最终确定的间接ELISA反应检测，选取 OD490nm值小于0. 30、P/N值小于0. 8、阻断试验OD49tlnm值无明显变化的5份血清混合后，作为 羊驼副结核阴性对照血清。
阻断试验是将待检血清中加入过量的纯化重组hed蛋白，37°C中和Ih后，用实施 例4最终确定的间接ELISA反应检测，比较血清处理前后OD49tlnm值有无明显变化。羊驼副结核阳性对照血清的制备如下副结核灭活疫苗(吉林兽医研究所生产) 按照说明书的剂量免疫健康成年羊驼2头，首次免疫20d后加强免疫，加强免疫3次，每次 间隔15-20d，最后一次免疫20天后采血，用补体结合试验和以上建立的间接ELISA方法检 测均为阳性。将制备的2份羊驼副结核阳性血清等体积混勻得到羊驼混合阳性血清。将羊 驼混合阳性血清用以上羊驼阴性对照血清稀释至滴度为1 400，再次用实施例4最终确定 的间接ELISA反应检测确认其滴度的准确性，该血清作为间接ELISA方法的阳性对照血清。实施例4用本发明试剂盒检测羊驼副结核分支杆菌抗体_间接ELISA反应1.方法将纯化的副结核分支杆菌重组hed蛋白用包被液适当稀释后，包被酶标板，4°C过 夜；用PBST洗涤酶标板5次，加入封闭液(300 μ L/孔)于4°C封闭过夜，洗涤同前；将待检 血清、阴性和阳性对照血清用PBST稀释至最佳浓度(100 μ L/孔)，37°C作用一定时间，洗涤 同前；加入适当浓度的HRP-SPA，100 μ L/孔，37°C孵育一定时间，洗涤同前；加入OPD底物 显色液，作用15min ；2mo VLH2SO4终止反应；酶标仪读取OD49tlmin值。2.最佳抗原、抗体浓度确定纯化的重组hed蛋白用lmol/L Tris-HCl (pH 7. 5)以起始浓度为17. 6μ g/mL做2 倍倍比稀释，羊驼抗副结核阳性血清和阴性血清(制备方法见本实施例中标号9)以起始浓 度为1 25做2倍倍比稀释，采用方阵滴定法确定重组hed蛋白的包被浓度以及血清的最 佳工作浓度。实验结果表明，当抗原浓度为3.75yg/mL，血清以1 50稀释时，P/N值(阴 阳性检测结果之比)最大(为6. 23)，故将其确定为最佳的抗原包被浓度和抗体稀释浓度。3.封闭条件的选择采用以上步骤2确定的最佳抗原包被浓度和抗体稀释浓度，分别以0. 1 % (质量 浓度)BSA、2% (质量浓度)明胶或5% (质量浓度)脱脂乳作为封闭液，于4°C封闭过夜、 37°C封闭2h进行间接ELISA反应。发现2%明胶的封闭效果好于0. 1%BSA和5%脱脂乳， 4°C孵育过夜的封闭效果明显好于37°C孵育2h，因此确定2%明胶，4°C封闭过夜为最佳封 闭条件。4.血清最佳反应时间的确定按照以上步骤2和3确定的最佳条件，将血清于37 °C分别孵育30min、60min、 90min、120min,进行间接ELISA反应。结果显示，当反应时间为60min时，Ρ/Ν值最高，确定 最佳血清反应时间为60min。5.酶标二抗的最佳稀释度和作用时间的选择按照以上步骤2、3、4确定的最佳条件，将HRP-SPA分别作1 1000，1 5000， 1 10000稀释，并使各稀释度的酶标SPA分别于37°C作用30min、60min、90min、120min,按 间接ELISA程序进行。当HRP-SPA稀释度为1 5000，作用时间为60min时，P/N值最大， 即反应效果最佳。6.底物作用时间的确定按照以上步骤2-5确定的最佳反应条件进行间接ELISA反应，加入底物显色液后 分别于37°C避光孵育5min、10min、15min、20min终止反应，比较效果。结果显示，37°C避光显色15min，Ρ/Ν值最高。7.结果判定取30份健康羊驼血清，将其1 50稀释，按照以上步骤2-6确定的最佳反应条件 进行测定，这些血清数据经过统计学分析，得到OD49tlnm平均值X和标准差S。发现血清OD49tlnm 值最高为0. 38，最低为0. 17，平均值为0. 25，标准方差S为0. 08。判定方法设定为血清样 品OD490nm值彡阴性血清OD490nm值+0. 24 (即3S)，且该样品的Ρ/Ν彡2. 5，判为阳性；反之判 为阴性。因此，最终确定的间接ELISA反应过程(1)、包被副结核分支杆菌重组hed蛋白用包被液稀释至3. 75 μ g/mL,于酶标板 各孔中分别加入100μ L，4°C包被过夜，用PBST洗涤5次。(2)、封闭每孔加入300 μ L封闭液，4°C封闭过夜，用PBST洗涤5次。(3)、加待检样品以PBST将阳性对照血清、阴性对照血清、待检血清按1 50稀 释，每孔中加入100 μ L，37°C孵育60min,用PBST洗涤5次；(4)、加 HRP-SPA 将 HRP-SPA 用 PBST 作 1 5000 稀释，每孔中加入 100 μ L, 37°C 孵育60min，用PBST洗涤5次；(5)、配制并加入显色液临显色之前向所述磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中加入邻苯 二胺，使邻苯二胺浓度达到0. 4g/L，然后加入所述的H2O2水溶液0. 15mL,即获得显色液；每 孔加入该显色液100μ L，37°C避光孵育15min ；(6)、终止每孔加入100 μ L终止液终止反应，酶标仪测定每孔的OD49tlnm值；(7)、判定待检血清孔的OD49tlnm值彡阴性对照血清孔的OD49tlnm值+0. 24，判为阳性； 反之判为阴性。8.敏感性测定副结核灭活疫苗(吉林兽医研究所生产)按照说明书的剂量免疫健康成年羊驼2 头，首次免疫20d后加强免疫，加强免疫3次，每次间隔15-20d，最后一次免疫20天后采血， 用补体结合实验和以上建立的间接ELISA方法检测均为阳性。将制备的2份羊驼副结核阳 性血清等体积混勻得到羊驼混合阳性血清，自1 25起始做倍比稀释，用本实验建立的间 接ELISA方法对各个稀释度进行检测，得出该混合血清的效价为1 3200，表明抗原抗体反 应的敏感性良好。9.阴阳性对照血清的制备选取了 10头临床健康的青年公羊驼，用补体结合试验和变态反应检测均为阴性， 采取血清用以上间接ELISA方法检测，选取OD49tlnm值小于0. 30、P/N值小于0. 8、阻断试验 OD490nm值无明显变化的5份血清混合后，作为间接ELISA方法的阴性对照血清。将以上步骤8制备的羊驼混合阳性血清用以上阴性对照血清稀释至滴度为 1 400，再次用间接ELISA确认其滴度的准确性，该血清作为间接ELISA方法的阳性对照 血清。阻断试验是将待检血清中加入过量的纯化重组hed蛋白，37°C中和Ih后，用以上 间接ELISA方法检测，比较血清处理前后OD49tlnm值有无明显变化。10.保存期测定按照以上确定的间接ELISA反应程序，包被、封闭酶标板后，分别于4°C和_20°C保
7存，分别于1周、2周、1个月、2个月、3个月、6个月取出，进行间接ELISA检测，其它试剂于 4°C保存。结果显示，包被的酶标板在4°C保存时间为1个月，而在-20°C可保存6个月以上。
实施例4临床样品检测 用建立的间接ELISA方法对47份羊驼血清进行检测，结果均为阴性，用副结核补 体结合试验检测和变态反应检测，结果也均为阴性，证实该方法具有一定的临床实践性。
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权利要求
一种检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒，包含下列试剂(1)副结核分支杆菌重组hed蛋白；(2)羊驼副结核阳性对照血清、阴性对照血清。
2.根据权利要求1所述的检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒，其特征在于还包含 酶标板、包被液、封闭液、PBST、辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌蛋白A、显色液配制 原料和终止液；所述包被液是浓度为lmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH 7. 5 ；所述封闭液是质量浓度为2%的明胶溶液；所述 PBST 的组成是=Na2HPO4 2. 9g/L, KH2PO4 0. 2g/L, NaCl 8. Og/L, KCl 0. 2g/L, Tween-20体积浓度为0. 05%，其pH为7. 4 ；所述显色液配制原料包括①由Na2HPO4 · 12H20 18. 408g/L,柠檬酸5. 106g/L组成的磷 酸盐_柠檬酸盐缓冲液，PH 5. 0 ；②邻苯二胺；③体积浓度为30%的H2O2水溶液；所述终止液是浓度为2mol/L的H2SO4溶液。
3.一种采用权利要求2的试剂盒检测羊驼副结核分支杆菌抗体的方法，按如下步骤(1)、包被副结核分支杆菌重组hed蛋白用包被液稀释至3.75 μ g/mL，于酶标板各孔 中分别加入100μ L，4°C包被过夜，用PBST洗涤5次；(2)、封闭每孔加入300μ L封闭液，4°C封闭过夜，用PBST洗涤5次；(3)、加入待检样品以PBST分别将阳性对照血清、阴性对照血清、待检血清按体积 1 50稀释，每孔中加入100yL，37°C孵育60min，用PBST洗涤5次;(4)、加入辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌蛋白A用PBST将辣根过氧化物酶标 记的金黄色葡萄球菌蛋白A作1 5000稀释，每孔中加入100μ ，37 孵育60min，用PBST 洗涤5次；(5)、配制并加入显色液临显色之前向所述磷酸盐_柠檬酸盐缓冲液中加入邻苯二 胺，使邻苯二胺浓度达到0. 4g/L，然后加入所述的H2O2水溶液0. 15mL,即获得显色液；每孔 加入该显色液100 μ L，37°C避光孵育15min ；(6)、终止每孔加入100μ L终止液终止反应，酶标仪测定每孔的OD49tlnm值；(7)、判定待检血清孔的OD49tlnm值彡阴性对照血清孔的OD49tlnm值+0.24，判为阳性；反 之判为阴性。
全文摘要
本发明提供一种检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。该试剂盒包含副结核分支杆菌重组hed蛋白，羊驼副结核阳性对照血清、阴性对照血清，还可以包括酶标板、包被液、封闭液、PBST、辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌蛋白A(HRP-SPA)、显色液配制原料和终止液。由于本发明试剂盒，引入了特异性强、且高效表达的副结核分支杆菌hed蛋白，用它作为检测抗原，直接检测羊驼抗副结核分支杆菌抗体，具有良好的特异性和灵敏度。用本试剂盒检测羊驼副结核分支杆菌抗体方法简便、快速且准确，适合大批量样品检测。
文档编号G01N33/569GK101949928SQ20101026468
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月26日 优先权日2010年8月26日
发明者唐泰山, 姜焱, 廉慧锋, 张常印, 张睿, 王凯民, 祝长青 申请人:江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心
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