专利名称：用于果汁中耐热菌双抗体夹心elisa检测试剂盒的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及食品微生物检测领域，具体涉及到果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA快速检测所用的试剂盒的制备方法或应用。
背景技术：
耐热菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)在高温或不利环境中可以形成芽孢，具有很强的耐热性，能够耐受果汁加工中的巴氏杀菌过程以芽孢的形式存在于果汁中，是引起浓缩苹果汁变质的主要微生物之一，耐热菌超标也是苹果汁生产企业最急需解决的问题。
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目前，生产企业多采用传统平板培养计数法检测耐热菌，平板培养计数法主要包括美国KFL方法(美国库克实验室法)和澳大利亚Berri公司方法。KFL方法主要是采用滤膜过滤，将耐热菌截留在滤膜上，再将滤膜置于培养基上培养计数，此法检测周期一般为4 5天，在实际生产中无法满足耐热菌的实时检测。也有用PCR法，即聚合酶链式反应法检测耐热菌，其具有快速、特异的优点，但该方法对设备、实验室条件及环境要求高，实验操作步骤较繁锁，且假阳性较难控制，限制了 PCR检测法的推广应用。为此发明人所在的课题组曾提出了耐热菌的ELISA快速检测方法，已申请了中国专利，专利申请号分别为200910022897. 7和201010249781. X，该方法具有特异性高，操作简便，重复性好等特点，检测限可满足苹果浓缩汁中耐热菌不超过I个/ IOmL的国际标准，操作过程可在20小时内完成，达到快速检测的效果。但是这种方法在实施耐热菌的ELISA检测时，首先要制备抗体，包被酶标板，检测时间较长。抗体和酶标板制备对检测结果的可靠性很关键，也是实现ELISA检测方法标准化的关键环节，如能将抗体和酶标板提前制备成试剂盒，成为进一步研究的重要课题。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于克服现有技术中的耐热菌的ELISA检测方法所存在的不足，提供了一种能抗体和酶标板提前制备成试剂盒，操作简单，能够实现ELISA检测方法标准化的用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的制备方法。本发明所要解决的另一个技术问题在于提供利用上述的制备方法所制备的用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的新的检测方法。本发明解决技术问题的技术方案是用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的制备方法包括以下步骤(I)耐热菌兔源多克隆抗体包被酶标板用浓度为0. 05mol / L、pH值为9. 6的碳酸缓冲液将耐热菌兔源多克隆抗体溶液稀释至浓度为4. 8 5. 2 ii g / mL,加入酶标板孔内，每孔加100 u L,置于恒温培养箱37°C孵育I. 9 2. I小时，将吐温-20与浓度为0. Olmol / L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为I : 1900 2200混合配制成洗液，用洗液冲洗酶标板2 3分钟，重复冲洗3 5次，拍干酶标板；(2)封闭酶标板向步骤(I)拍干的酶标板的每个孔内加入IOOy L的封闭液，置于恒温箱中37°C保温封闭90 150分钟，取出，用步骤(I)配制的洗液冲洗酶标板2 3分钟，重复冲洗3 5次，拍干，得到封闭的酶标板；(3)试剂盒包装
将封闭的酶标板用铝箔袋真空包装，得到耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒；上述的封闭液是质量分数为1% 5%的明胶溶液或质量分数为1% 5%的牛血清蛋白溶液或质量分数为0. 1% 0. 5%的脱脂奶溶液。上述封闭液是质量分数为3. 8% 4. 2%的明胶溶液。利用上述制备的试剂盒进行果汁中的耐热菌的双抗体夹心ELISA检测方法，包括以下步骤(I)将经过灭菌处理的果汁样品作为阴性样品与待测果汁样品按照每孔IOOy L的量分别加入上述制备的试剂盒的酶标板孔中，置于恒温箱中37°C保温50 150分钟后取出，将吐温-20与浓度为0. Olmol / L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为I :1900 2200混合配制成洗液，用洗液冲洗酶标板2 3分钟，重复冲洗3 5次，拍干酶标板；(2)将浓度为0. Olmol / L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 3mg / mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照体积比为I :190 220混合，加入步骤(I)的拍干后的酶标板中，每孔IOOii L，置于恒温箱中37°C孵育50 150分钟后取出，用步骤(I)中配制的洗液冲洗酶标板2 3分钟，重复冲洗3 5次，拍干酶标板；(3)将浓度为0. 01mol/L、pH值为7. 6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 8mg/mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液按照体积比为I :2500 11000混合，加入步骤(2)拍干的酶标板板孔中，每孔IOOy L，将其置于恒温箱中37°C孵育50 120分钟后取出，用步骤(I)配制的洗液冲洗酶标板2 3分钟，重复冲洗3 5次，拍干酶标板；(4)向步骤(3)的拍干后的酶标板板孔内加入底物工作液，每孔IOOii L，在恒温箱中37°C避光反应15 20分钟，加入50 u L浓度为2mol / L的硫酸溶液终止反应；(5)用酶标仪在450nm波长下测定步骤(4)反应终止酶标板的分光光度值，与步骤(I)的阴性样品的cut off值进行比较，确定待测果汁样品中耐热菌的存在，样品分光光度值大于cut off值，为阳性，表明样品中存在耐热菌，样品分光光度值小于cut off值，为阴性，表明样品中无耐热菌，cut off值按下式计算Cutoff = X+2xSD式中文表示阴性样品OD45tl的平均值，SD表示阴性样品OD45tl的标准差，OD45tl是波长为450nm下的分光光度值。上述步骤(2)中将浓度为0. Olmol / L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 3mg / mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照较佳体积比为I :195 210混合,加入步骤
(I)的拍干后的酶标板中。上述步骤(3)中将浓度为0. Olmol / L、pH值为7. 6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 8mg/mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液按照较佳体积比为I :3000 6000混合，加入步骤(2)拍干的酶标板板孔中。上述步骤(4)中的底物工作液的配制方法为取浓度为0. 2mol / L的磷酸盐缓冲溶液和浓度为0. Imol / L的柠檬酸溶液与二蒸水混合，二蒸水与磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸溶液的体积比为I :0. 514 :0. 486，配制成底物缓冲液；再将固液比为0. OOlg / mL的3，3-,5, 5’-四甲基联苯胺乙醇溶液与底物缓冲液以体积比为I :1混合，配制成混合溶液，加入质量分数为30%的H2O2溶液，混合溶液与H2O2溶液的体积比为I :0. 002，摇匀，即配制成底物工作液。上述的兔源多克隆抗体制备采用王峰，李建科等人报道的《苹果浓缩汁中嗜酸耐 热菌多克隆抗体的制备及纯化》(食品与发酵工业，2009年第35卷第4期，33-36页)的方法。上述的鼠源多克隆抗体采用名称为《耐热菌鼠源多克隆抗体制备》，专利申请号为201110427711. 3的中国专利所公开的制备方法制备。本发明预先将兔源多克隆抗体包被在酶标板上再加入封闭液封闭后用铝箔袋真空包装，制备成一个标准试剂盒，将抗体和酶标板提前制备好，制备方法简单，能够实现ELISA快速检测方法的标准化，大大缩短检测时间，使得ELISA检测更加方便、可靠，减少了操作步骤，实现了关键环节标准化，提高了检测结果的可靠性。检测时将该试剂盒中加入样品中捕集的耐热菌抗原，再加入耐热菌鼠源多克隆抗体，形成抗体-抗原-抗体的双抗体复合物，与酶标抗体、底物工作液，使双抗体复合物上的酶催化底物，再通过酶标仪测定其分光光度值与阴性对照样品的cut off值比较，从而判定其为阴性或阳性，进而实现一种耐热菌双抗体夹心ELISA检测方法，检测时间短，检测结果稳定，大大提高了检测效率。
图I为阴性样品的OD45tl值统计图表。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例I以耐热囷兔源多克隆抗体为检测抗体制备用于果汁中耐热囷双抗体夹心ELISA检测试剂盒，其制备方法如下(I)耐热菌兔源多克隆抗体包被酶标板用浓度为0. 05mol / L、pH值为9. 6的碳酸缓冲液将浓度为10 U g/mL的耐热菌兔源多克隆抗体溶液稀释至浓度为g/mL，加入酶标板孔内，每孔加IOOy L，置于恒温培养箱37°C孵育2小时，取ImL吐温-20溶解于2L浓度为0. Olmol / L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液中，配制成体积比为I :2000的洗液，用洗液冲洗酶标板2. 5分钟，重复冲洗4次，轻轻甩�。谏床忌系箍矍崆崤母擅副臧�。(2)封闭酶标板向步骤(I)拍干的酶标板的每个孔内加入100 U L质量分数为4%的明胶溶液作为封闭液，将酶标板置于恒温箱中37°C保温封闭120分钟，取出，用步骤I中配制的洗液冲洗酶标板2. 5分钟，重复冲洗4次，轻轻甩�。谏床忌系箍矍崆崤母桑玫椒獗盏拿副臧�。(3)试剂盒包装将步骤(2)制备好的封闭的酶标板用铝箔袋真空包装，得到用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒。本实施例的试剂盒可以置于冰箱中3°C 5°C保存，有效期为半年。用上述方法制备的试剂盒进行果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒来检测果汁中的耐热菌，其检测方法如下(I)将经过灭菌处理的果汁样品作为阴性样品与待测果汁样品按照每孔IOOy L的量分别加入上述制备的试剂盒的酶标板孔中，置于恒温箱中37°C保温60分钟后取出，将ImL吐温-20与2L浓度为0. Olmol / L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为I : 2000混合配制成洗液，用配制的洗液冲洗酶标板2. 5分钟，重复冲洗4次，轻轻甩�。谏床忌系箍矍崆崤母擅副臧濉Ｉ鲜龅拇夤肥蔷淼模咛迨且晕蘧僮鳎Oml浓缩清汁置于15ml灭菌的试管中，再移取IOml浓缩清汁置于另一个带有温度计的15mL的试管中，作为温度控制用，盖上样品试管的盖子，将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中，当温度达到80±1°C，开始计时，维持13分钟，冷却至室温，用IOOml的灭菌蒸馏水将热处理过的样品转入灭菌容器中，摇匀。将稀释后的样品溶液用0. 45um的滤膜真空过滤，将滤膜放置于盛有IOOmL的402培养基的三角瓶中，盖上瓶塞，放入恒温摇床中45°C，190r/min,孵育13小时为集菌后的果汁。本实施例是将集菌处理后的果汁作为被检样品。(2)将浓度为0. 01mol/L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 3mg / mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照体积比为I :200混合，加入步骤(I)的拍干后的酶标板孔中，每孔IOOii L，置于恒温箱中37°C孵育60分钟后取出，用步骤(I)中配制的洗液冲洗酶标板2. 5分钟，重复冲洗4次，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干酶标板。(3)将浓度为0. Olmol / L、pH值为7. 6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 8mg / mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液以体积比为I :4000混合，加入步骤(2)拍干的酶标板孔中，每孔IOOy L，将其置于恒温箱中37°C孵育90分钟后取出，用步骤(I)配制的洗液冲洗酶标板2. 5分钟，重复冲洗4次，轻轻甩�。谏床忌系箍矍崆崤母擅副臧�。(4)向步骤(3)拍干的酶标板孔内加入底物工作液，每孔IOOii L，在恒温箱中37°C避光反应18分钟，加入50 u L物质的量浓度为2mol / L的硫酸溶液终止反应；上述底物工作液的配制方法为称取7. 16g Na2HPO4W蒸馏水定容至lOOmL，配制成物质的量浓度为0.2mol /L的磷酸盐缓冲溶液；称取2. Ig柠檬酸加蒸馏水定容至IOOmL,配制成物质的量浓度为0. Imol / L的柠檬酸溶液；取25. 7mL物质的量浓度为0. 2mol / L的磷酸盐缓冲溶液和24. 3mL物质的量浓度为0. Imol / L的柠檬酸溶液，加二次蒸馏水定容至IOOmL,即二蒸水与磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸溶液的体积比为I :0. 514 :0. 486，摇匀，配制成底物缓冲液；将0. Ig 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺用IOOmL无水乙醇溶解，加入IOOmL底物缓冲液中，SP3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺乙醇溶液与底物缓冲液以体积比为I :1混合，再加入400 y L质量分数为30%的H2O2溶液，即混合溶液与H2O2溶液的体积比为I :0. 002，摇匀，配制成底物工作液，底物工作液现配现用。
(5)用酶标仪在450nm波长下测定步骤(4)反应终止的酶标板的分光光度值，即测出酶标板待测样品孔的OD45tl值和酶标板阴性样品孔的OD45tl值，依据cut off值的计算公式Cutoff= X+2xSD其中文表示阴性样品OD450的平均值，SD表示阴性样品OD450的标准差，OD450是波长为450nm下的分光光度值。将待测样品的0D450值与阴性对照样品的cut off值进行比较，当样品分光光度值大于cut off值，为阳性，表明样品中存在耐热菌；当样品分光光度值小于cut off值，为阴性，表明样品中无耐热菌。
实施例2以耐热囷兔源多克隆抗体为检测抗体制备用于果汁中耐热囷双抗体夹心ELISA检测试剂盒，其制备方法如下(I)耐热菌兔源多克隆抗体包被酶标板用浓度为0. 05mol / L、pH值为9. 6的碳酸缓冲液将浓度为10 U g/mL的耐热菌兔源多克隆抗体溶液稀释至浓度为4. g/mL，加入酶标板孔内，每孔加IOOy L，置于恒温培养箱37°C孵育I. 9小时，将吐温-20与浓度为0. Olmol / L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为I :1900混合摇匀，配制成洗液，用洗液冲洗酶标板3分钟，重复冲洗3次，轻轻甩�。谏床忌系箍矍崆崤母擅副臧�。(2)封闭酶标板向步骤(I)拍干的酶标板的每个孔内加入100 U L质量分数为3. 8%的明胶溶液作为封闭液，将酶标板置于恒温箱中37°C保温封闭90分钟，取出，用步骤(I)中配制的洗液冲洗酶标板3分钟，重复冲洗3次，轻轻甩�。谏床忌系箍矍崆崤母桑玫椒獗盏拿副臧濉�(3)试剂盒包装与实施例I相同，得到耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒。用上述制备的用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒来检测果汁中的耐热菌，其检测方法如下(I)将经过灭菌处理的果汁样品作为阴性样品与待测果汁样品按照每孔IOOy L的量分别加入上述制备好的试剂盒的酶标板孔中，将其同时置于恒温箱中37°C保温50分钟后取出，将吐温-20与浓度为0. Olmol / L，pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液以体积比为I :1900混合摇匀，配制成洗液，用配制的洗液冲洗酶标板3分钟，重复冲洗3次，轻轻甩�。谏床忌系箍矍崆崤母擅副臧澹渌牟僮饔胧凳├齀相同。(2)将浓度为0. Olmol / L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 3mg / mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照体积比为I :195混合，加入步骤I的拍干后的酶标板孔中，每孔IOOii L，置于恒温箱中37°C孵育50分钟后取出，用步骤(I)中配制的洗液冲洗酶标板3分钟，重复冲洗3次，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干酶标板。(3)将浓度为0. Olmol / L、pH值为7. 6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 8mg / mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液按照体积比为I :3000混合，加入步骤(2)拍干的酶标板孔中，每孔100 u L，将其置于恒温箱中37 V孵育50分钟后取出，用步骤(I)配制的洗液冲洗酶标板3分钟，重复冲洗3次，轻轻甩�。谏床忌系箍矍崆崤母擅副臧�。
(4)向步骤(3)拍干的酶标板孔内加入底物工作液，每孔IOOii L，在恒温箱中37°C避光反应15分钟，加入50 u L浓度为2mol / L的硫酸溶液终止反应；其它的步骤与实施例I相同。步骤5 :与实施例I相同。实施例3以耐热菌兔源多克隆抗体为检测抗体制备用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒，其制备方法如下(I)耐热菌兔源多克隆抗体包被酶标板用浓度为0. 05mol / L、pH值为9. 6的碳酸缓冲液将浓度为10 u g/mL的耐热菌兔源多克隆抗体溶液稀释至浓度为5. g/mL，加入酶标板孔内，每孔加IOOy L，置于恒温培养箱37°C孵育2. I小时，将吐温-20与浓度为0. Olmol / L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为I :2200混合配制成洗液，用该洗液冲洗酶标板2分钟，重复冲洗5次，轻轻甩�。谏床忌系箍矍崆崤母擅副臧�。(2)封闭酶标板向步骤(I)拍干的酶标板的每个孔内加入100 U L质量分数为4. 2%的明胶溶液作为封闭液，将酶标板置于恒温箱中37°C保温封闭150分钟，取出，用步骤(I)中配制的洗液冲洗酶标板2分钟，重复冲洗5次，轻轻甩�。谏床忌系箍矍崆崤母桑玫椒獗盏拿副臧�。(3)试剂盒包装与实施例I相同，得到耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒。用上述制备的用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒来检测果汁中的耐热菌，其检测方法如下 (I)将经过灭菌处理的果汁样品作为阴性样品与待测果汁样品按照每孔IOOy L的量分别加入上述制备好的试剂盒的酶标板孔中，将其同时置于恒温箱中37°C保温150分钟后取出，将吐温-20与浓度为0. Olmol / L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为I 2200混合配制成洗液，用该洗液冲洗酶标板2分钟，重复冲洗5次，轻轻甩�。谏床忌系箍矍崆崤母擅副臧�。其它的操作与实施例I相同。(2)将浓度为0. Olmol / L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 3mg / mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照体积比为I :210混合，加入步骤(I)的拍干后的酶标板孔中，每孔IOOii L，置于恒温箱中37°C孵育150分钟后取出，用步骤(I)中配制的洗液冲洗酶标板2分钟，重复冲洗5次，轻轻甩�。谏床忌系箍矍崆崤母擅副臧�。(3)将浓度为0. 01mol/L pH值为7. 6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 8mg/mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液按照体积比值为I :6000混合，加入步骤(2)拍干的酶标板孔中，每孔100 yL，将其置于恒温箱中37°C孵育120分钟后取出，用步骤(I)配制的洗液冲洗酶标板2分钟，重复冲洗5次，轻轻甩�。谏床忌系箍矍崆崤母擅副臧�。(4)向步骤(3)拍干的酶标板孔内加入底物工作液，每孔IOOii L，在恒温箱中37°C避光反应20分钟，加入50 u L物质的量浓度为2mol / L的硫酸溶液终止反应；其它的操作与实施例I相同。 步骤5 :与实施例I相同。 实施例4
在上述实施例I 3的用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的制备方法中，在步骤(2)中的封闭液还可以用1%的明胶溶液或者是1%的牛血清蛋白溶液或者是0. 1%的脱脂奶溶液来替换。其它的步骤与相应的实施例相同。实施例5在上述实施例I 3的用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的制备方法中，在步骤(2)中的封闭液还可以用5%的明胶溶液或者是5%的牛血清蛋白溶液或者是0. 5%的脱脂奶溶液来替换。其它的步骤与相应的实施例相同。实施例6在上述的实施例I 5的果汁中的耐热菌的双抗体夹心ELISA检测方法中，在步 骤(2)中将浓度为0. Olmol / L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 3mg / mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照体积比为I :190混合，加入步骤(I)的拍干后的酶标板孔中，每孔IOOii L，本步骤其它的操作与相应的实施例相同。在步骤(3)中将浓度为0. Olmol /L pH值为7. 6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 8mg/mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液按照体积比值为I :2500混合，加入步骤(2)拍干的酶标板孔中，每孔100 y L，本步骤中其它的操作与相应的实施例相同。其它的步骤与相应的实施例相同，确定待测果汁样品中耐热菌的存在。实施例I在上述的实施例I 5的果汁中的耐热菌的双抗体夹心ELISA检测方法中，在步骤(2)中将浓度为0. Olmol / L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 3mg / mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照体积比为I :220混合，加入步骤(I)的拍干后的酶标板孔中，每孔IOOii L，本步骤其它的操作与相应的实施例相同。在步骤(3)中将浓度为0. Olmol /L pH值为7. 6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 8mg/mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液按照体积比值为I :11000混合，加入步骤(2)拍干的酶标板孔中，每孔IOOii L，本步骤中其它的操作与相应的实施例相同。其它的步骤与相应的实施例相同。为了确定本发明检测步骤中的各最佳条件，发明人进行了大量的实验室研究试验，每种实验重复三次，实验结果为三次重复试验的平均值，各种试验情况如下试验材料与试剂浓缩苹果汁pH值3. 5 4. 5，可溶性固形物含量为71 ±1° Brix，由陕西阿果安娜果汁股份有限公司提供；HRP酶标山羊抗大鼠抗体Jackson ImmunoResearch进口分装；TMB (3，3’5，5’-四甲基联苯胺)=OURchem ;弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司；SDS-PAGE低分子量标准蛋白Fermentas进口分装；考马斯亮蓝R250 :USB进口分装；溴酹蓝Sigma进口分装；TEMED (四甲基乙二胺):Sigma进口分装；过硫酸铵(AP) :Amresco进口分装；SDS (十二烷基硫酸钠)=Sigma进口分装；甲叉双丙烯酰胺AmreSC0进口分装；丙烯酰胺Amresco进口分装；巯基乙醇Amresco进口分装；明胶Sigma进口分装；牛血清白蛋白AmresC0进口分装；脱脂奶完达山牌脱脂奶粉。其它试剂均为分析纯。供试菌种耐热菌标准菌株Alicyclobacillusacidoterrestris DSMZ 3922,购自德国微生物菌种保藏中心，由本实验室保藏。大肠杆菌(Escherichia coli ATCC8739)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis ATCC6633)、腊状芽抱杆菌(Bacillus cereus ATCC11778)、黑曲霉(Aspergillus niger ATCC 16404)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus ATCC6538)由陕西师范大学生命科学学院微生物实验室提供。实验动物SD大鼠10只，成年雄性；大耳白兔，体重2. 5±0. 25kg，购自西安交通大学实验动物中心。试验仪器可见分光光度计UNIC0 WFJ2000型，上海龙尼柯仪器有限公司；紫外可见分光光度计U-3010，日本HITACHI公司；隔水式恒温培养箱GSP-9080_MBE型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；台式离心机TGL-16G型，上海安亭科学仪器厂；超净操作台SW-CJ-1F，苏净集团安泰公司；电热恒温水槽HHW-21⑶-600型，上海福玛实验设备有限公司；精密微量移液器德国 Eppendorf (10 IOOii L，0. I IOii L，30 300 iiL) ;XW_80A ·漩涡混合仪海门市其林贝尔仪器制造有限公司；超声波清洗机KQ3200B型，昆山市超声仪器有限公司；酶标仪伯乐680型，美国伯乐公司；D25mm透析袋北京鼎国生物技术有限公司；Hitrap Protain G 亲和层析柱，Hitrap Protain A 亲和层析柱GE Healthcare ;恒流泵上海沪西分析仪器厂有限公司；电泳仪北京君意东方电泳设备有限公司；垂直平板凝胶电泳槽北京六一仪器厂；微孔板振荡器杭州奥盛仪器有限公司。I、耐热菌兔源多克隆抗体包被酶标板( I)确定抗体包被缓冲液分别以物质的量浓度为0. 05mol / L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液、物质的量浓度为0. Olmol / L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液、物质的量浓度为0. 05mol / LpH值为8. 5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲溶液作为耐热菌兔源多克隆抗体包被缓冲液。检测抗原为耐热菌，浓度分别为I X IO8个/ mL、1父106个/ mL、1父104个/ mL，即分别为强阳性组、中阳性组、弱阳性组；同时设阴性对照，阴性对照分别用物质的量浓度为0. 05mol / LpH值为9. 6的碳酸缓冲溶液、物质的量浓度为0. Olmol / L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液、物质的量浓度为0. 05mol / L pH值为8. 5的Tris-HCl缓冲溶液，置于37°C孵育2小时，用吐温-20的质量分数为0. 05%的物质的量浓度为0. Olmol / L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板3次，每次2 3分钟，轻轻甩�。谏床忌系箍矍崆崤母�。按照本发明的技术方案的检测方法进行操作，测定OD■值，实验及计算结果见表I。表I不同包被缓冲液的检测结果
OD450 值
包彼 派----
强阳性组中阳性组弱阳性组 cut off值
0.05mol/LpH 为 9.6 碳酸缓冲溶液 0.804 0.118 0.066 0.0420.01mol/LpH 为 7.4 磷酸盐缓冲溶液 0.092 0.033 0.024 0.0370.05mol/L pH 为 8.5 Tris-HCl 缓冲溶液 0.062 0.037 0.022 0.036注cut off值为测定结果判断基线值，( 450值> cut off值为阳性，0D450值< cutoff值为阴性。
由表I可见，在强阳性组中，以物质的量浓度为0. 05mol / L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液或物质的量浓度为0. Olmol / L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液或物质的量浓度为0. 05mol / L pH值为8. 5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液作为耐热菌兔源多克隆抗体包被液，OD45tl值均大于cut off值，其中，以物质的量浓度为0.05mol / L pH值为9. 6的碳酸缓冲液作为包被液时，OD■值最大。在中阳性和弱阳性组中，以物质的量浓度为0. 05mol /L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液为包被液，OD450值均大于cut off值。本发明选择最佳包被液为物质的量浓度为0. 05mol / L pH值为9.6的碳酸缓冲液。(2)确定抗体包被浓度采用方阵滴定法确定耐热菌兔源多克隆抗体包被浓度。将耐热菌兔源多克隆抗体稀释至浓度为IOii g / mL,采用2倍倍比稀释，浓度分别为IOii g / mL、5ii g /mL>2. 5 u g / mL>I. 25 u gmL>0. 625 u g / mL>0. 3125 u g / mL>0. 15625 u g / mL、
0. 078125 u g / mL,以上述抗体浓度分别包被96孔酶标板各列，每种浓度包被一列。最后一列为空白对照。明胶封闭后，加入浓度为IO8个/ mL，5X107f/ mL，107个/ mL，5X106个/ mL，106个/ mL，5X105f/ mL，IO5个/ mL的耐热菌菌悬液抗原，每种稀释倍数加一行，最后一行为空白对照，按照本发明专利技术方案中检测方法进行检测，比较不同抗体浓度和不同抗原浓度下的OD45tl值，同时参照空白对照组的OD■值，选择空白值最�。粜灾底畲蟮目孜腿染迷炊嗫寺】固遄罴寻慌ǘ�。实验及计算结果见表2。表2方阵滴定法确定抗体包被浓度
权利要求
1.一种用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (O耐热菌兔源多克隆抗体包被酶标板 用浓度为O. 05mol / L、pH值为9. 6的碳酸缓冲液将耐热菌兔源多克隆抗体溶液稀释至浓度为4. 8 5. 2 μ g / mL,加入酶标板孔内，每孔加100 μ L,置于恒温培养箱37°C孵育I.9 2. I小时，将吐温-20与浓度为O. Olmol / L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为I :1900 2200混合配制成洗液，用洗液冲洗酶标板2 3分钟，重复冲洗3 5次，拍干酶标板； (2)封闭酶标板 向步骤(I)拍干的酶标板的每个孔内加入100μ L的封闭液，置于恒温箱中37°C保温 封闭90 150分钟，取出，用步骤(I)配制的洗液冲洗酶标板2 3分钟，重复冲洗3 5次，拍干，得到封闭的酶标板； (3)试剂盒包装 将封闭的酶标板用铝箔袋真空包装，得到耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒； 上述的封闭液是质量分数为1% 5%的明胶溶液或质量分数为1% 5%的牛血清蛋白溶液或质量分数为O. 1% O. 5%的脱脂奶溶液。
2.根据权利要求I所述的用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述封闭液是质量分数为3. 8% 4. 2%的明胶溶液。
3.一种利用权利要求I制备的试剂盒进行果汁中的耐热菌的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于包括以下步骤 (1)将经过灭菌处理的果汁样品作为阴性样品与待测果汁样品按照每孔100μL的量分别加入上述制备的试剂盒的酶标板孔中，置于恒温箱中37°C保温50 150分钟后取出，将吐温-20与浓度为O. Olmol / L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为I :1900 2200混合配制成洗液，用洗液冲洗酶标板2 3分钟，重复冲洗3 5次，拍干酶标板； (2)将浓度为O.Olmol / L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为O. 3mg / mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照体积比为I :190 220混合，加入步骤(I)的拍干后的酶标板中，每孔100 μ L，置于恒温箱中37°C孵育50 150分钟后取出，用步骤(I)中配制的洗液冲洗酶标板2 3分钟，重复冲洗3 5次，拍干酶标板； (3)将浓度为O.01mol/L、pH值为7. 6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为O. 8mg/mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液按照体积比为I :2500 11000混合，加入步骤(2)拍干的酶标板板孔中，每孔100 μ L，将其置于恒温箱中37°C孵育50 120分钟后取出，用步骤(O配制的洗液冲洗酶标板2 3分钟，重复冲洗3 5次，拍干酶标板； (4)向步骤(3)的拍干后的酶标板板孔内加入底物工作液，每孔IOOyL,在恒温箱中37°C避光反应15 20分钟，加入50 μ L浓度为2mol / L的硫酸溶液终止反应； (5)用酶标仪在450nm波长下测定步骤(4)反应终止酶标板的分光光度值，与步骤(I)的阴性样品的cut off值进行比较，确定待测果汁样品中耐热菌的存在，样品分光光度值大于cut off值，为阳性，表明样品中存在耐热菌，样品分光光度值小于cut off值，为阴性，表明样品中无耐热菌，cut off值按下式计算 Cutoff= X-2xSD式中又表示阴性样品OD45tl的平均值，SD表示阴性样品OD45tl的标准差，OD450是波长为450nm下的分光光度值。
4.根据权利要求3的果汁中的耐热菌的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于所述步骤(2)中将浓度为O. Olmol / L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为O. 3mg / mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照体积比为I :195 210混合，加入步骤(I)的拍干后的酶标板中。
5.根据权利要求3的果汁中的耐热菌的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于所述步骤(3)中将浓度为O. Olmol / L、pH值为7. 6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为O. 8mg/mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液按照体积比为I :3000 6000混合，加入步骤(2 )拍干的酶标板板孔中。
6.根据权利要求3的果汁中的耐热菌的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于所述步骤(4)中的底物工作液的配制方法为取浓度为O. 2mol / L的磷酸盐缓冲溶液和浓度为O.Imol / L的柠檬酸溶液与二蒸水混合，二蒸水与磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸溶液的体积比为I :0.514 :0. 486，配制成底物缓冲液；再将固液比为O. OOlg / mL的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺乙醇溶液与底物缓冲液以体积比为I :I混合，配制成混合溶液，加入质量分数为30%的H2O2溶液，混合溶液与H2O2溶液的体积比为I :0. 002，摇匀，即配制成底物工作液。
全文摘要
本发明涉及一种用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的制备方法及应用，其是预先将兔源多克隆抗体包被在酶标板上再加入封闭液封闭后用铝箔袋真空包装，制备成一个标准试剂盒，能够实现ELISA快速检测方法的标准化，检测时将该试剂盒中加入样品中捕集的耐热菌抗原，再加入耐热菌鼠源多克隆抗体，形成抗体-抗原-抗体的双抗体复合物，与酶标抗体、底物工作液，使双抗体复合物上的酶催化底物，再通过酶标仪测定其分光光度值与阴性对照样品的cut off值比较，从而判定其为阴性或阳性，进而实现一种耐热菌双抗体夹心ELISA检测方法，检测时间短，检测结果稳定，大大提高了检测效率。
文档编号G01N33/543GK102854308SQ20121035296
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月20日 优先权日2012年9月20日
发明者李建科, 夏凯, 黄瑞蕊 申请人:陕西师范大学
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