专利名称：使用多特异性捕获和混合物检测试剂检测胰腺患者中的循环肿瘤细胞的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤学和诊断测试领域。本发明用于癌症筛选、分期、监控化学疗法治疗应答、癌症复发等。更具体地，本发明提供了便于肿瘤细胞或从生物样品中分离的其它罕见细胞的分析和计数的试剂、方法和测试试剂盒。
背景技术：
使用CellSearchCTC测定法计数具有转移性乳腺、前列腺和结肠癌的患者中的循环肿瘤细胞(CTC)预测患者存活，且致使治疗应答的监控成为可能。另外，CTC可以就多种分子标记进行表征，所述分子标记已提议作为动态研究患者中的肿瘤生物学的方法。然而，已存在关于具有胰腺癌的患者中的CTC检测的少数研究，并且初步研究暗示最初测定法配置对于检测这些细胞可能不是最佳的(参见以引用的方式并入的US7，332，288)。最初CellSearch CTC测定法使用缀合至顺磁纳米颗粒的抗EpCAM(EpCAM铁磁流体)以捕获CTC0通过EpCAM铁磁流体捕获的CTC由缀合至藻红蛋白的抗细胞角蛋白抗体(CK8、18和19)染色，以检测CTC。除了来自不同癌症的细胞可能表达与乳腺、前列腺或结肠直肠癌那些相比较不同的肿瘤抗原的问题，存在描述在原发性肿瘤内的细胞异质性的增长中的文献。近期进展已显示肿瘤祖细胞(TPC)在解释一些癌症为何在化学疗法后恢复中可能是关键性重要的。这些TPC看起来对许多常规疗法是高度抗性的，并且能够在未来一定时间重建肿瘤。近来，文献也已鉴定可在转移过程中起主要作用的上皮间充质转化细胞(EMT)。认为TPC和EMT表达与CTC那些不同的抗原。CTC捕获依赖于在CTC上的EpCAM表达；因为CTC捕获已局限于单一捕获抗原。在CTC上的EpCAM的生物学并未得到充分了解，并且可能EpCAM抗原在一些CTC中可能是下调或阴性的。在此类情况下，CTC将不由EpCAM铁磁流体捕获，并且在测定法中将导致零CTC。另一种可能性是由它们捕获的CTC由于测定法中使用的细胞角蛋白标记的不存在而无法检测。因此，尽管许多CTC通过目前技术成功地捕获且检测，但在癌症患者的血液中存在无法检测的CTC是可能的，因为它们未能表达在目前测定法中使用的标记。最后，未知TPC和EMT是否在血液中循环并且可以被检测到。然而，目前捕获和检测技术已局限于一种抗原或一类抗原的靶向的事实意指TPC或EMT不可能用目前技术检测到。基于上文，显而易见用于在继发性肿瘤建立前鉴定循环中的这些细胞的方法是高度希望的，特别是在癌症早期。许多实验室和临床程序采用用于从生物样品中分离罕见细胞的生物特异性亲和反应。此类反应通常用于诊断测试中，或用于分离广泛范围的靶物质，尤其是生物学实体例如细胞、蛋白质、细菌、病毒、核酸序列等。
基于在目的物质和靶物质与之特异性结合的另一种物质之间的复合物形成，多种方法可用于分析或分离上述靶物质。使复合物与未结合的材料分离可以例如通过偶联到靶物质的细分颗粒或珠的沉降或者通过离心来重力完成。如果需要，此类颗粒或珠可以制备为磁性的，以促进结合/游离分离步骤。磁性颗粒是本领域熟知的，如其在免疫和其它生物特异性亲和反应中的用途一样。参见例如，美国专利号4，554，088和用于临床化学的免疫测定法(Immunoassays for Clinical Chemistry),第 147-162 页，Hunter 等人编辑，爱丁堡的丘吉尔利文斯敦(Churchill Livingston,Edinburgh) (1983)。一般地,促进磁性或重力分离的任何材料都可用于这个目的。然而，已变得明确的是磁分离方法是选择的方法。磁性颗�？梢曰诖笮》掷辔�(1.5至约50微米)、小(0.7-1.5微米)或胶体(< 200nm)，所述胶体也称为纳米颗粒。也称为铁磁流体或铁磁流体样材料且具有常规铁磁流体的许多性质的后者在本文中有时被称为胶体、超顺磁颗粒。上述类型的小磁性颗粒在涉及生物特异性亲和反应的分析中是相当有用的，因为它们方便地用生物功能聚合物(例如蛋白质)涂布，提供极高的表面积且给出合理的反应动力学。范围为0.7-1.5微米的磁性颗粒已在专利文献中描述，包括例如美国专利号3，970，518 ;4，018，886 ;4，230，685 ;4，267，234 ;4，452，773 ;4，554，088 ；和 4，659，678 中。这些颗粒中的某些公开为用于免疫学试剂的有用固体载体。如同上文提及的小磁性颗粒，大磁性颗粒(> 1.5微米至50微米)也可以显示出顺磁行为。此类材料一般是由Ugelstad在美国专利号4，654267中描述且由Dynal，(挪威的奥斯陆(Oslo,Norway))制造的那些。Ugelstad过程涉及引起膨胀的聚合物颗粒的合成，并且磁性晶体嵌入膨胀的颗粒中。在相同大小范围中的其它材料通过在分散的磁性晶体的存在下合成聚合物颗粒进行制备。这导致在聚合物基质中磁性晶体的捕获，从而使得所产生的材料磁性。在两种情况下，所产生的颗粒都具有超顺磁行为，所述顺磁行为通过在磁场去除后容易分散的能力表现。与先前提及和在下文进一步详细讨论的磁性胶体或纳米颗粒不同，这些材料以及小磁性颗粒由于磁性材料的质量/颗粒由简单的实验室磁学容易地分离。因此，分离在低至数百高斯/cm到至多约1.5千高斯/cm的梯度中实现。另一方面，由于其分散能量、小磁质量/颗�：退雇锌怂棺枇Γ禾宕判钥帕�(低于约200nm)要求基本上更高的磁性梯度。给予Owen等人的美国专利号4，795，698涉及聚合物涂布的、胶体、顺磁颗粒,所述颗粒通过在聚合物的存在下来自Fe+VFe+3盐的磁石形成产生。给予Molday的美国专利号4，452，773描述了在性质中与Owen等人中所述那些相似的材料，所述材料通过在极高浓度的葡聚糖的存在下经由碱添加由Fe+VFe+3形成磁石和其它氧化铁产生。由两种程序所得到的颗粒显示出对于长达几个月的观察期没有来自含水悬浮液的沉降的合适趋势。如此产生的材料具有胶体性质并且已证明在细胞分离中是非常有用的。Molday技术已通过德国贝尔吉施格拉德巴赫的美天旎生物公司(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)和加拿大温哥华的泰瑞.托马斯公司(Terry Thomas, Vancouver, Canada)商业化。用于生产顺磁、胶体颗粒的另一种方法在美国专利号5，597，531中描述。与Owen等人或Molday专利中所述的颗粒形成对比,这些后面一种颗粒通过将生物功能聚合物直接涂布到预形成的超顺磁晶体上产生，所述预形成的超顺磁晶体已通过大功率声能分散成范围为25至120nm的准稳定的晶状簇。所得到的颗粒在本文中称为直接涂布颗粒，显示出比相同总尺寸的胶体颗粒例如由Molday或Owen等人描述的那些明显更大的磁矩。磁分离技术是已知的，其中将磁场应用于流体介质，以便从流体介质中分离铁磁体。相比之下，与其相对弱的磁应答性结合，胶体、超顺磁颗粒保留在悬浮液中的趋势要求使用高梯度磁分离(HGMS)技术，以便从它们悬浮于其中的无磁性流体介质中分离此类颗粒。在HGMS系统中，磁场的梯度即空间导数对悬浮颗粒的行为施加比在给定点通过场强度施加更大的影响。HGMS系统可以分成两个广泛类别。一个此类类别包括采用磁路的磁分离系统，所述磁路对于分离室或器皿是完全位于外部的。此类外部分离器的例子在给予Liberti等人的美国专利号5，186，827中描述。在这个专利中所述的几个实施例中，通过将永磁体置于无磁性容器外围附近，使得磁体的相同极在场相对配置中，来产生必要的磁场梯度。可以在此类系统中获得的在测试介质内的磁场梯度程度受磁体强度和磁体间的分隔距离限制。因此，存在可以由外部梯度系统获得的梯度的有限限度。另一类HGMS分离器利用设置在测试介质内的铁磁收集结构，以便I)强化应用的磁场且2)在测试介质内产生磁场梯度。在一类已知的内部HGMS系统中，将优质钢丝绒或纱布填充到位于与磁体邻近的柱内。应用的磁场集中在钢丝附近，使得悬浮的磁性颗粒将被吸引朝向且附着至丝表面。在此类线上产生的梯度与线直径成反比，使得磁范围随着直径增加而减少。因此，可以生成极高梯度。内部梯度系统的一个缺点是钢丝绒、纱布材料或钢微珠的使用可以通过在交叉线附近或在交叉线之间的间隙内的毛细管作用诱陷测试介质的无磁性组分。多种涂布程序已应用于此类内部梯度柱(参见例如给予Miltenyi的美国专利号5，693，539和给予Kronick的4，375，407)，然而，此类系统中的大表面积仍产生由于吸附的回收关注。因此，内部梯度系统是不可取的，尤其当极低频率捕获实体的回收是分离的目的时。此外，它们使得自动化困难且昂贵。由Owen等人和Molday描述的材料都要求使用此类高梯度柱。相比之下，使用外部梯度用于细胞分离的HGMS方法提供了许多方便。首先，可以采用简单实验室容器例如试管、离心管或甚至vacutainers(用于血液收集)。当外部梯度是产生单层分离细胞的种类时，如用上文提及的美国专利号5，186，827的四极/六极装置或给予Liberti等人的美国专利5，466，574中所述的相对偶极排列的情况,便于细胞的洗涤或后续操作。进一步地，来自管或相似容器的细胞回收是简单和有效的过程。这尤其是当与来自高梯度柱的回收进行比较时的情况。此类分离器皿还提供了另一重要特点，即减少样品体积的能力。例如，如果从用缓冲液稀释50%以减少粘度的IOml血样中分离特定人血细胞子集(例如磁标记的CD34+细胞)，那么15ml圆锥形试管可用作合适四极磁性装置中的分离器皿。从15mls溶液开始，执行第一次分离，并且将回收的细胞重悬浮于3mls中。随后执行第二次洗涤/分离，并且将分离的细胞重悬浮于200ul的最终体积中。在洗涤和/或分离和重悬浮以去除未结合的细胞后，CD34+细胞可以有效重悬浮于200 μ I的体积中。当使用已对于这些分离器最佳化的直接涂布的铁磁流体在适当处理的器皿中小心完成时，取决于抗原密度，细胞回收在40-90%范围中是相当有效的。此类技术和试剂是达到上文提及的癌症测试种类所需的灵敏度程度必需的。磁分离可以由其完成的效率以及磁标记的细胞的回收和纯度将取决于许多因素。这些包括此类考虑如待分离的细胞数目、此类细胞的受体密度、磁负荷/细胞、磁性材料的非特异性结合(NSB)、采用的技术、器皿的性质、器皿表面的性质、介质的粘度和采用的磁分离装置。如果系统的非特异性结合水平是基本上恒定的，如通常的情况，那么靶群体如纯度一样减少。例如，回收80%群体的具有0.8% NSB的系统将具有25%的纯度，所述80%群体在最初混合物中处于0.25%。然而，如果初始群体处于0.01% (在IO6旁观者细胞中的一个靶细胞)，并且如果NSB是0.001 %，那么纯度将是8%。纯度越大，分析就越容易且越好。因此，明确的是极低的非特异性结合是执行有意义的罕见细胞分析所需的。较不显而易见的是靶细胞群体越�。判员昙乔一厥站驮嚼训氖率�。此外，标记和回收将显著依赖于采用的磁性颗粒的性质。例如，当细胞与大磁性颗粒例如Dynal珠一起温育时，细胞通过由系统混合产生的碰撞进行标记，因为珠太大而不能有效分散。因此，如果细胞以I细胞/ml血液或甚至更少的频率存在于群体中，如在极早期癌症中的肿瘤细胞的情况，那么标记靶细胞的可能性将与加入系统中的磁性颗粒数目和混合的时间长度有关。因为细胞与此类颗粒混合大量时间段将是有害的，所以尽可能多地增加颗粒浓度变得必需。然而，存在关于可以加入的磁性颗粒数量的限制，因为可以用与其它血细胞混合的罕见细胞代替与分离后的大量磁性颗粒混合的罕见细胞。后面一种条件不显著改善计数目的细胞或检查目的细胞的能力。存在使用大颗粒分离以罕见频率的细胞(I至50细胞/ml血液)的另一缺点。尽管大磁性颗粒允许使用非常简单设计的外部梯度和相对低的磁性梯度的事实，但大颗粒趋于以笼样形式在细胞周围成簇，使得细胞难以看见或分析。因此，磁性颗粒必须在分析前从靶细胞中释放，并且释放颗粒显然引入其它复杂情况。基于前文所述，用采用高磁性、低非特异性结合、胶体磁性颗粒的外部场装置的高梯度磁分离是用于从真核细胞的混合群体中分离目的细胞子集的选择方法，尤其当目的子集包含整个群体的小部分时。由于其散布性质，此类材料容易地发现且磁性标记罕见事件，例如血液中的肿瘤细胞。此类分离一般依赖对于特异性目的细胞子集独特的细胞表面抗原的鉴定，在肿瘤细胞的情况下，该特异性目的细胞子集可以是合适单克隆抗体缀合的铁磁流体可以靶向其的肿瘤抗原。作为另外一种选择，当检查血样时，在血液中通常未发现的细胞类别例如上皮细胞上的决定簇可以提供合适受体。存在采用胶体磁性材料用于此类分离的其它良好原因，条件是可以达到回收的磁负荷。具有合适的负荷，对细胞施加足够的力，使得即使在与适度稀释的全血的那种一样粘稠的介质中也可以达到分离。如注意到的，低于约200纳米的胶体磁性材料将显示出布朗运动，所述布朗运动显著增强其与罕见细胞碰撞且磁性标记罕见细胞的能力。这在美国专利号5，541，072中得到证实，其中描述了采用具有IOOnm平均直径的胶体磁性颗粒或铁磁流体的非常有效的肿瘤细胞净化实验的结果。同样重要地，具有在或低于这个尺寸范围的粒子大小的胶体材料一般不干扰细胞的检查。如此寻回的细胞可以通过流式细胞术、激光扫描显微镜检查或通过采用可视或荧光技术的显微镜检查进行检查。
发明内容
本发明提供了不仅用于表征肿瘤细胞还用于表征罕见细胞或来自生物样品的其它生物学实体的快速和有效的筛选方法。本发明的方法提供了致使能够有效富集目的实体的高度灵敏的分析技术。确保靶生物实体富集同时在分析前消除大量碎片和其它干扰物质的这种两阶段法允许检查否则将是不实际的样品大小。本文描述的方法以独特方法组合免疫磁性富集的元件与多参数流式细胞术、显微镜和免疫细胞化学分析。还可利用其它富集方法，例如密度梯度离心或淘选或通过合适标记改变靶细胞密度。根据优选实施例，本发明的方法致使能够测定全血用于癌症分期、监控和筛选。测定法的灵敏性质便于残留疾病的检测，从而使得能够监控癌症复发。本发明掺入使不同抗体缀合至相同铁磁流体的方法。这具有就铁磁流体结合的抗原而言使得铁磁流体双、三或多特异性的效应。在相同铁磁流体上存在的多重抗体看起来不彼此封闭或另外干扰。此类铁磁流体具有能够与多于一种类型的细胞特异性结合的高度期望效应，致使捕获具有低EpCAM表达但其它肿瘤标记的高表达的CTC的能力成为可能；在本发明的一个实施例中，从患者获得包含怀疑含有目的罕见细胞的混合细胞群体的生物样品。随后通过将生物样品与下列混合制备免疫磁性样品:(i)偶联到与血细胞上发现的那些不同的罕见细胞决定簇或决定簇类别特异性反应的生物特异性配体的磁性颗粒，以基本排除其它样品组分，和(ii)至少一种标记罕见细胞的生物特异性试剂。使所得到的免疫磁性样品经受磁�。龃懦〗酚行Х掷氤晌幢昙堑募斗趾桶康暮奔赴�(如果在样品中存在的话)的标记的磁性级分。随后分析如此分离的细胞群体，以确定罕见细胞的存在和数目。在优选实施例中，在这种方法中使用的颗粒是胶体纳米颗粒。本发明允许在胰腺癌患者中的CTC的改善检测。使用多特异性捕获和检测试齐U，代替仅抗EpCAM试剂，多特异性试剂例如但不限于连同几种其它抗体一起用作对照的抗EpCAM用于检测在患者的血液中先前未检测到的循环癌细胞，所述几种其它抗体识别在CTC上的不同抗原。捕获试剂被称为多特异性捕获试剂，因为它识别几种抗原。因此，CTC捕获不依赖于单独的EpCAM抗原，并且即使EpCAM抗原未表达也捕获CTC，条件是选择用于捕获的其它抗原存在于CTC上。产生具有足够的结合能力、低非特异性结合和无抗体的交叉封闭的多特异性铁磁流体的能力，连同适当的特异性检测抗体混合物的使用，致使所有多种类型的CTC的捕获成为可能。在本发明中，对于CTC特异性的抗体混合物代替单一抗体缀合至铁磁流体用于捕获，以使对单一靶的CTC捕获依赖降到最低。此外，检测的另外抗体覆盖更广泛范围的抗原。尽管本发明涉及循环肿瘤细胞领域，但考虑在血液中的其它形式的罕见细胞分析。
图1(A)显示了根据在细胞表面上的靶抗原表达的四个细胞系的染色强度。所有抗体都以2ug/ml进行测试(η = 2)。(B)显示了对于靶抗原表达的四个细胞系的平均百分比阳性群体。图2㈧显示了根据细胞内靶抗原表达的四个细胞系的染色强度。⑶显示了对于靶抗原表达的四个细胞系的平均百分比阳性群体。图3(A)显示了具有不同试剂盒配置的掺料CAPANl肿瘤细胞的回收。(B)显示了具有不同试剂盒配置的掺料BxPC3肿瘤细胞的回收。
具体实施例方式根据优选实施例，本发明提供了使用多特异性铁磁流体用于从生物样品中快速和有效分离罕见生物实体的组合物、方法和试剂盒。所述方法可用于有效分离和表征血样中存在的肿瘤细胞，同时使非特异性结合的细胞的选择降到最低。使用如本文所述的多重捕获和检测试剂，罕见细胞测定法比先前使用的单一靶分子进一步改善。这种修饰改善罕见细胞例如但不限于胰腺CTC的捕获和检测。此外，非上皮标记例如间充质标记(η-钙粘蛋白)可以与上皮标记结合使用，以捕获上皮和间充质肿瘤细胞。本发明致使能够同时检测罕见细胞的不同群体，例如CTC和肿瘤细胞的不同群体。如本文所用的术语“靶生物实体”指广泛多样的生物学或医学目的材料。例子包括激素、蛋白质、肽、凝集素、寡核苷酸、药物、化学物质、核酸分子(例如RNA和/或DNA)和生物学起源的微粒分析物，该微粒分析物包括生物颗粒例如细胞、病毒、细菌等。在本发明的优选实施例中，使用本发明的组合物、方法和试剂盒，罕见细胞例如母体循环中的胎儿细胞或循环癌细胞可以与非靶细胞和/或其它生物实体有效分离。术语“生物样品”包括但不限于含细胞体液、流体、外周血、组织匀浆物、乳头抽吸物和可得自人受检者的罕见细胞的任何其它来源。示例性组织匀浆物可得自乳腺癌患者中的前哨结。当参考前述靶生物实体中的任何使用时，术语“决定簇”可由生物特异性配体或生物特异性试剂特异性结合，并且指涉及且负责与特异性结合物质的选择性结合的靶生物实体的那个部分，所述特异性结合物质的存在是选择性结合发生所需的。在基础术语中，决定簇是在靶生物实体上的分子接触区域，所述靶生物实体由特异性结合对反应中的受体识别。如本文所用的术语“特异性结合对”包括抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、核酸(RNA或DNA)杂交序列、Fe受体或小鼠IgG-蛋白A、抗生物素蛋白-生物素、链霉抗生物素蛋白-生物素和病毒-受体相互作用。多种其它决定簇-特异性结合物质组合考虑用于在实践本发明的方法中使用，例如对于本领域技术人员显而易见的。如本文所用的术语“抗体”包括免疫球蛋白、单克隆或多克隆抗体、免疫反应免疫球蛋白片段和单链抗体。还考虑用于在本发明中使用的是肽、寡核苷酸或其组合，其以类似于常规生成抗体的特异性来特异性识别决定簇。术语“可检测标记”在本文中用于指其通过物理或化学方法的直接或间接检测或测量指示测试样品中靶生物实体的存在的任何物质。有用的可检测标记的代表性例子包括但不限于下列:基于光吸收度、突光、反射、光散射、磷光或发光性质，可直接或间接检测的分子或离子；可通过其放射性质检测的分子或离子；可通过其核磁共振或顺磁性质检测的分子或离子。包括在基于光吸收度或荧光可间接检测的分子组中的是例如多种酶，所述酶促使合适底物例如从不吸光转换为吸光分子，或从非荧光转换为荧光分子。短语“基本排除”指在生物特异性配体或生物特异性试剂及其相应靶决定簇之间的结合反应的特异性。生物特异性配体和试剂具有对于其靶决定簇的特异性结合活性，仍可以显示出与其它样品组分的低水平的非特异性结合。如本文所用的术语“早期癌症”指已在临床上确定为器官局限的那些癌症。还包括的是太小而无法通过常规方法检测的肿瘤，所述常规方法例如用于乳腺癌患者的乳房X线照相术或用于肺癌患者的X射线。如本文所用的术语“富集”指从生物样品中富集单核细胞。在其中外周血用作原材料的情况下，当评估富集程度时不计数红细胞。用于在执行本发明中使用的优选磁性颗粒是表现为胶体的颗粒。此类颗粒的特征在于其亚微米粒子大小(这一般小于约200纳米(nm) (0.20微米))，及其与溶液重力分离延长时间段的稳定性。除了许多其它优点外，这个尺寸范围使得其对于通常应用于细胞分析的分析技术基本上不可见。在90-150nm范围内且具有70-90%之间的磁质量的颗�？悸怯糜谠诒痉⒚髦惺褂�。合适的磁性颗粒由通过分子包围的超顺磁材料的晶状核组成，所述分子键合例如物理吸附或共价附着至磁芯，并且赋予稳定胶体性质。涂层材料应优选以有效防止样品中发现的生物大分子和磁芯之间的非特异性相互作用的量应用。此类生物大分子可包括在非靶细胞表面上的唾液酸残基、凝集素、糖蛋白及其它膜组分。此夕卜，材料应含有尽可能多的磁质量/纳米颗粒。包含芯的磁性晶体的尺寸足够�。沟盟遣缓暾沤峁褂颉Ｄ擅卓帕５某叽缱愎恍。沟闷洳祭誓芰砍浯啪�。因此，北极、南极比对及其胶体磁性颗粒的后续相互吸引/排斥看起来即使在中等强的磁场中也不发生，促成其溶液稳定性。最后，磁性颗粒应在高磁性梯度外部场分离器中可分离。这个特征便于样品处理且提供超过装载有铁磁珠或钢丝绒的更复杂的内部梯度柱的经济优点。具有上述性质的磁性颗�？梢酝ü奘蚊拦ɡ�4，795，698,5, 597，531和5，698，271中所述的基底材料进行制备。其来自那些基底材料的制备在下文描述。应当指出许多不同细胞分析平台可以用于鉴定且计数富集样品。此类分析平台的例子是分别在美国专利申请08/931，067和08/867，009中描述的CellSpotter系统(用于细胞的手动观察的磁性细胞固定器)和CellTracks系统(自动光学扫描磁性细胞固定器)。上述美国专利申请都以引用的方式并入本文，作为公开用于手动或自动化定量和定性细胞分析的各自仪器和方法。其它分析平台包括激光扫描细胞术(Compucyte)、基于亮视野的图像分析(Chromavision)和毛细管容量测定法(Biometric imaging)。使用本发明的方法和组合物计数血液中的循环上皮细胞通过从血液中免疫磁性选择(富集)上皮细胞随后通过多参数流式细胞术分析样品来达到。免疫磁性样品制备对于减少样品体积且获得靶(上皮)细胞的IO4倍富集是重要的。用于多参数流式细胞术分析的试剂是最佳化的，使得靶细胞定位于通过两个光散射器和三个荧光参数的表格方式采集产生的多维空间中的独特位置。这些包括I)针对泛白细胞抗原CD45的抗体，以鉴定白细胞(非肿瘤细胞)；对于核酸染料特异性的细胞类型，该核酸染料允许排除残留红血细胞、血细胞及其它无核事件；和3)针对细胞角蛋白的生物特异性试剂或抗体或对于EpCAM表位具有特异性的抗体，该抗体不同于用于免疫磁性选择细胞的那种。捕获靶:用于捕获的抗体基于用组织培养的肿瘤细胞的初始测试进行选择。该策略选择代表多种分化状态的细胞系的横断面，因为表达水平依照分化状态而改变。数据暗示大多数原始位点细胞系是分化不良的，而腹水和转移灶衍生的细胞系是中等至良好分化的。因此，选择BxPC3 (中等)、Panc-1 (不良)、CAPAN-1 (良好)和CAPAN-2 (良好)肿瘤细胞用于基于分化状态的抗体估计。EpCAM.、Mucinl、Mesothelin、Claudin-4、EGFRl 和 CEACAM6 确定为捕获抗原的靶。流式细胞术分析策略用于确定抗原表达水平和阳性细胞群体数目百分t匕。在研究中使用的所有抗体都是初级抗体，并且使用缀合至荧光染料的抗小鼠次级抗体监控染色。图1(A)显示了具有指示表达水平的多种标记的细胞染色强度。图1(B)显示了具有标记的阳性细胞百分比。图1中的数据显示了筛选的所有靶都以关于彼此的不同表达水平存在于细胞系上，并且表达水平对于测试的所有细胞系并不一致。数据暗示抗原表达跨越细胞系改变，指示抗原在CTC中也可以改变，类似于组织培养的肿瘤细胞。分析揭示EpCAM、Claudin-4、EGFRl和一定程度的Mucin-1跨越所有细胞系遍在表达。平均起来，抗原在65%至100%的细胞群体中表达。因此，使用覆盖广泛范围的肿瘤细胞的多重捕获靶对于有效捕获是重要的。此外，这些标记对于肿瘤细胞应是特异性的并且不应存在于白血细胞上。候选捕获抗体用白血细胞进行测试。大多数标记以低水平在白血细胞上表达，除了看起来在粒细胞中高度普遍和在单核细胞中至更少程度的CEACAM6外。这个结果排除CECAM6作为用于这个测定法中的捕获靶的用途。基于上述数据，EpCAM、Mucinl、Mesothelin、Claudin-4和EGFR抗原是用于捕获肿瘤细胞的良好靶。检测靶:关于多种标记的抗体就肿瘤细胞的检测进行测试。测试的标记是细胞角蛋白7、
8、17、18、19和c-Src。这些标记通过流式细胞术且跨越所有四个细胞系以2ug/ml浓度进行测试。图2(A)和图2(B)概括这些结果。细胞角蛋白家族在所有细胞系中是遍在表达的(79%至100%的群体对于靶中的至少一种是阳性的)。c-Src家族也在测试的所有细胞系中表达，具有不同表达水平(66%至100%阳性群体)。全面地，所有细胞角蛋白抗体都同样良好地工作,具有可比较的染色模式和结果。来自安迪生物(R&D Systems)的c_Src看起来是弱粘合剂，并且不是非常亮的，尽管这可能是由于用作检测试剂的FITC缀合的次级。然而，抗细胞角蛋白17和抗c-Src在白血细胞(单核细胞和粒细胞)上都是阳性的。基于这个数据，选择细胞角蛋白7、8、18和19用作混合物检测抗体。捕获靶与铁磁流体的缀合:基于用胰腺组织培养的肿瘤细胞系的初始估计，选择抗EpCAM、抗EGFR1、抗Mucl和抗Claudin4用于捕获。最多三种抗体使用Veridex以几个组合缀合至铁磁流体。LLC缀合化学和组合如下:A.抗EpCAM/EGFRl/Mucl多特异性铁磁流体B.抗 EpCAM/EGFRl/Claudin4 多特异性铁磁流体C.抗EpCAM/Mucl/Claudin4多特异性铁磁流体抗EpCAM抗体在所有组合中使用。检测靶与藻红蛋白(PE)的缀合:抗细胞角蛋白(识别细胞角蛋白8和18的Cll抗体)、抗细胞角蛋白7、抗细胞角蛋白18和抗细胞角蛋白19都使用Veridex LLC标准缀合化学缀合至PE。缀合至PE的所有细胞角蛋白抗体都与抗⑶45-APC组合，以产生混合物染色试剂。本领域技术人员应认识到，富集肿瘤细胞群体的分析方法将取决于本发明的预期用途。例如，在筛选癌症或监控疾病复发中，如下文描述的，循环上皮细胞的数目可以是极低的。在那种情况下，基于显微镜检查的分析可以证明是最精确的。此类检查还可以包括形态的检查、已知肿瘤标记和或癌基因的鉴定。作为另外一种选择，在其中循环上皮细胞的数目远远超过在正常群体中观察到的那种的疾病状态，计数此类细胞的分析方法应是足够的。根据本文所述方法的患者状态的确定基于正常群体中存在的循环罕见细胞数目的统计平均值作出。在早期癌症患者和具有侵略性转移性癌症的患者中的循环上皮细胞水平也可以如本文所述在统计上进行测定。如上所述，试剂盒从用于富集来自全血的肿瘤细胞的试剂、装置和方法开始。试剂盒将含有测试血样中的乳腺癌细胞的试剂，所述试剂评估六种因素或指示剂。分析平台需要这样配置，使得报道分子DAP1、CY2、CY3、CY3.5、CY5和CY5.5通过合适的激发和发射滤波器区分。这个例子中的分析平台使用配备水银弧光灯的荧光显微镜，和合适的滤波器组用于评估采用的检测标记的波长。所有标记都用这种方法一次引入。本发明在CellSearch 上皮细胞试剂盒(CellSearch Epithelial Cell Kit)(Veridex7LLC)上改善。多特异性铁磁流体和混合物检测试剂的几个组合包括在本发明中用于产生多种试剂盒配置。主要改善是捕获和检测试剂组分的掺入。不同试剂盒配置如下:1.试剂盒I作为对照的CellSearch上皮细胞试剂盒:用于捕获的EpCAM ;用于检测的 C11(CK8U8)和 CK19。2.试剂盒2多重捕获和混合物检测:用于捕获的EpCAM/EGFR/Muc-1 (E29);用于检测的 C11(CK8、18)+CK19+CD7+CD18。3.试剂盒3多重捕获和混合物检测:用于捕获的EpCAM/EGFR/Claudin4 ;用于检测的 C11(CK8、18)+CK19+CK7+CK18。4.多重捕获和混合物检测:用于捕获的EpCAM/Muc-1 (E29)/Claudin4 ;用于检测的 C11(CK8、18)+CK19+CK7+CK18。不同试剂盒配置的估计上述试剂盒配置首先用组织培养的胰腺肿瘤细胞掺料的正常血样估计，以检查其性能。将胰腺肿瘤细胞(BxPC3和CAPAN-1细胞系)掺料到7.5mls CellSave供体血液(η=2)中。样品在CellTracks AutoPrep上进行加工，并且在CellTracks分析仪II上进行分析。掺料的Capan-1细胞用修饰试剂盒的回收类似于标准上皮细胞试剂盒(约60% )的那种，然而，用两个版本的修饰试剂盒存在BxPC3细胞(约90% )的一致更高的回收(图3a 和 3b)。用来自正常健康供体和转移性乳腺癌患者的血样估计四个试剂盒配置。来自这个估计的结果显示于表I和2中。初步数据显示与标准上皮细胞试剂盒I相比较，CTC回收率在使用所有版本的修饰试剂盒的临床样品中更高(表I)。使用修饰试剂盒从正常健康供体样品中未检测到CTC (表2)。表1:
权利要求
1.一种检测和计数混合细胞群体中的罕见细胞的方法，所述罕见细胞在所述群体中的存在指示疾病状态，所述方法包括: a)从测试受检者获得生物样品，所述样品包含怀疑含有所述罕见细胞的混合细胞群体； b)制备免疫磁性样品以基本排除其它样品组分，其中所述生物样品与偶联到多特异性配体的磁性颗粒混合，所述多特异性配体与所述罕见细胞特异性反应； c)使所述免疫磁性样品与至少一种标记所述罕见细胞的多特异性试剂接触；以及 d)分析所述标记的罕见细胞以确定所述免疫磁性样品中的任何罕见细胞的存在和数目，所述样品中存在的罕见细胞的数目越大，所述疾病状态的严重性就越大。
2.根据权利要求1所述的方法，其中作为介于所述免疫磁性样品制备和使所述免疫磁性样品与至少一种多特异性试剂接 触之间的中间步骤，使所述免疫磁性样品经受磁场以产生作为所述免疫磁性样品的罕见细胞富集的细胞悬浮液。
3.根据权利要求3所述的方法，其中含有所述富集的罕见细胞的所述免疫磁性样品的体积是减少的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在分析前，将所述免疫磁性样品分离成含有标记的罕见细胞的级分和未标记的级分。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述磁性颗粒是胶体的，并且分离通过使所述免疫磁性样品经受磁梯度场实现。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述罕见细胞选自内皮细胞、母体循环中的胎儿细胞、细菌细胞、心肌细胞、上皮细胞和病毒感染的细胞。
7.—种检测和计数混合细胞群体中的癌细胞的方法，包括: a)从测试受检者获得生物样品，所述样品包含怀疑含有所述癌细胞的混合细胞群体； b)制备免疫磁性样品以基本排除其它样品组分，其中所述生物样品与偶联到多特异性配体的磁性颗粒混合，所述多特异性配体与所述癌细胞特异性反应； c)使所述免疫磁性样品与至少一种标记所述癌细胞的多特异性试剂接触；以及 d)分析所述标记的癌细胞以确定所述免疫磁性样品中的任何癌细胞的存在和数目，所述样品中存在的癌细胞的数目越大，所述癌症的严重性就越大。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述磁性颗粒是胶体的，并且在分析前，将所述免疫磁性样品分离成含有标记的癌细胞的级分和未标记的级分。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述胶体磁性颗�：退鲋辽僖恢侄嗵匾煨允约劣胨錾镅匪炒位旌希⑶易魑屑洳街瑁顾雒庖叽判匝肪艽懦∫圆魑雒庖叽判匝返陌┫赴患南赴∫�。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在分析前，将所述免疫磁性样品分离成含有标记的癌细胞的级分和未标记的级分。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述含有标记的癌细胞的级分通过选自下列的方法分析:多参数流式细胞术、免疫荧光显微镜检查、激光扫描细胞术、基于亮视野的图像分析、毛细管容量测定法、光谱成像分析、手动细胞分析和自动细胞分析。
12.—种针对循环罕见细胞的存在筛选患者样品的测试试剂盒，包括:a)具有涂层的磁性纳米颗粒，其包含磁芯材料、蛋白质基底涂层材料和多于一种类型的抗体，其中每种抗体与所述罕见细胞的特征性决定簇特异性结合，所述抗体直接或间接偶联到所述基底涂层材料； b)至少一种对于所述罕见细胞的第二特征性决定簇具有结合特异性的抗体；和 c)用于从分析中排除除所述罕见细胞之外的样品组分的细胞特异性染料。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，所述试剂盒还含有对于非靶细胞具有结合亲和力的抗体、生物缓冲液、渗透化缓冲液、方案和任选的信息单。
14.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述罕见细胞选自内皮细胞、母体循环中的胎儿细胞、细菌细胞、心肌细胞、上皮细胞和病毒感染的细胞。
15.—种针对循环肿瘤细胞的存在筛选患者样品的试剂盒,包括: a)具有涂层的磁性纳米颗粒，其包含磁芯材料、蛋白质基底涂层材料和多种类型的上皮细胞特异性抗体，所述抗体直接或间接偶联到所述基底涂层材料； b)至少一种对于癌细胞决定簇具有结合特异性的抗体；和 c)用于从分析中排除 除所述肿瘤细胞之外的样品组分的细胞特异性染料。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，所述试剂盒还含有对于非肿瘤细胞具有结合亲和力的抗体、生物缓冲液、渗透化缓冲液、方案和任选的信息单。
17.根据权利要求15所述的试剂盒，所述试剂盒用于针对乳腺癌筛选患者，其中所述至少一种对于癌细胞决定簇具有结合特异性的抗体特异性结合乳腺癌细胞决定簇，所述决定簇选自MUC-1、雌激素、孕酮受体、组织蛋白酶D、p53、尿激酶型纤溶酶原激活物、表皮生长因子、表皮生长因子受体、BRCAU BRCA2、CA27.29、CA15.5、前列腺特异性抗原、纤溶酶原激活物抑制剂和Her2-neu。
18.根据权利要求15所述的试剂盒，所述试剂盒用于针对前列腺癌筛选患者，其中所述至少一种对于癌细胞决定簇具有结合特异性的抗体特异性结合前列腺癌细胞决定簇，所述决定簇选自前列腺特异性抗原、前列腺酸性磷酸酶、胸腺素b-15、p53、HPCl碱性前列腺基因、肌酸激酶和前列腺特异性膜抗原。
19.根据权利要求15所述的试剂盒，所述试剂盒用于针对结肠癌筛选患者，其中所述至少一种对于癌细胞决定簇具有结合特异性的抗体特异性结合结肠癌细胞决定簇，所述决定簇选自癌胚抗原、C蛋白质、APC基因、p53和基质金属蛋白酶(MMP-9)。
20.根据权利要求15所述的试剂盒，所述试剂盒用于筛选具有膀胱癌的患者，其中所述至少一种对于癌细胞决定簇具有结合特异性的抗体特异性结合膀胱癌细胞决定簇，所述决定簇选自核基质蛋白质(NMP22)、Bard膀胱肿瘤抗原(BTA)和纤维蛋白降解产物(FDP)。
21.根据权利要求15所述的测试试剂盒，其中所述至少一种抗体包括各自对于不同癌细胞特征性决定簇具有结合特异性的一组抗体。
全文摘要
本发明公开了高度灵敏的测定法，所述测定法组合免疫磁性富集与多参数流式细胞术或图像细胞术以检测、计数和表征血液中的恶性肿瘤细胞。本发明掺入不同抗体与相同铁磁流体的缀合。这具有就铁磁流体结合的抗原而言使得铁磁流体多特异性的效应。在相同铁磁流体上存在的多重抗体看起来不彼此封闭或另外干扰。此类铁磁流体具有能够与多于一种类型的细胞特异性结合的高度期望效应。所述测定法对于致使CTC捕获成为可能是尤其有用的，所述CTC具有低EpCAM表达，但具有其它肿瘤标记的高表达；因此，所述测定法便于恶性肿瘤细胞的生物表征和分期。
文档编号G01N33/543GK103154740SQ201180049729
公开日2013年6月12日 申请日期2011年10月13日 优先权日2010年10月14日
发明者G.C.劳, M.C.康奈利 申请人:维里德克斯有限责任公司
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