专利名称：一种肝吸虫抗体IgG4生物素-亲和素酶联免疫检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种肝吸虫抗体IgG4生物素-亲和素酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，属于寄生虫病免疫检测领域。
背景技术：
肝吸虫病是严重�：θ颂褰】档囊恢秩耸薰不疾。苫ж何�、麝猫后睾吸虫和猫后睾吸虫等引起，主要分布于远东，如中国、日本、朝鲜、越南和中南亚国家。我国除青海、宁夏、新疆、内蒙古、西藏等尚无报道外，已有24个省、市、自治区有不同程度流行，人群感染率在1% 30%之间。而保虫宿主动物感染的地区范围更广，感染率与感染度多比人体 感染高，对人群的感染具有潜在的威胁。我国的肝吸虫病主要是华支睾吸虫感染所致，至少已有2300年以上的流行历史。由于肝吸虫寄生于人的肝胆管内，其占位性机械挤压作用和排泄分泌物的长期刺激作用所引起的肝、胆组织炎性病变，可引起严重的肝脏功能损害，甚至癌变。一些地区长期以来形成的食生或半生淡水鱼和虾的饮食习惯，是引发肝吸虫病的重要原因，我国肝吸虫病的流行呈东高西低趋势，主要流行于广东、广西、黑龙江、吉林、江苏等省。经过50多年的积极防治，我国肝吸虫病的防治工作取得了显著的成绩，各地区人群感染率均有不同程度的下降。但随着我国经济社会的发展，生活水平的提高，人们开始追求饮食方式的多样化，生鱼片、火锅和烧烤等饮食方式又重新流行，进食未完全煮熟的鱼制品，或居民烹饪生鱼时不注意厨具的卫生等均会导致肝吸虫病的发生。肝吸虫病的发病率又有上升之势，全年肝吸虫病的发病人数可高达1000-1500万，是当前我国最严重的食源性寄生虫病之一，严重�：ξ夜嗣竦慕】岛蜕缁峋梅⒄�。肝吸虫因寄生在宿主的胆道中，临床症状不明显，由于缺乏特异性症状和体征，给临床诊断带来了一定的困难。华支睾吸虫病的诊断主要依靠实验室诊断。目前实验室诊断方法主要有如下几种
病原学检测
(I)粪便查虫卵法，主要有盐酸乙醚离心沉淀法，细筛定量透明法，小杯稀释计数法，检测病人粪便中是否存在肝吸虫虫卵。由于肝吸虫虫卵�。帕可伲诜啾阒械姆植疾痪菀茁┘欤绕涫窃缙诟腥菊哐粜月实�。(2)十二指肠引流液查虫卵法，胆汁中含虫卵较多，阳性率高，但只适合于部分住院病人检查。病原学检测法具有确诊价值，但因操作复杂，不易被检验人员及病人所接受，易漏检，难以满足应用的需要。B超检测
肝吸虫寄生于肝胆管中，引起肝实质、肝胆管及胆囊的组织病变，如肝组织硬化，肝胆管、胆囊壁组织增厚，纤维化，引起胆道及胆囊扩张。在B超及CT检测时出现不同的组织病变特征，表现为肝脏型，肝实质点状回声增强，增粗，有短棒状、索状或网状回声，肝内光点密集不均匀；胆管型，胆管扩张，管壁粗厚，回声增强，扩张的胆管内有点状、索状、斑块状或线形回声；胆囊型，胆囊壁增厚、粗糙，囊内有点状、棒状、索状、飘带状、条形或斑块形回声，有时伴有小结石或胆泥；混合型，可同时出现上述2种以上类型。由于其它肝胆管病变同样可以出现类似病变体征，B超检测没有特异性，只能作为临床诊断的一个辅助手段。CT 检测
患者均有不同程度的肝内弥漫性胆管扩张，多为肝被膜下小胆管呈囊状或杵状扩张，近肝门侧肝内胆管向被膜侧均匀扩张。少数病例的胆囊内可见团块状或不规则似软组织密度的条状物漂浮在胆汁中，个别病例胰管轻度扩张。CT检测可作为临床诊断的参考。免疫学检测
肝吸虫的排泄分泌物可以刺激宿主免疫系统，产生抗肝吸虫抗原免疫反应。检测肝吸虫抗原特异性免疫反应或免疫反应的产物，如肝吸虫抗原特异性抗体IgG(IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亚型)具有辅助诊断价值。常用的方法有皮内试验，是检测肝吸虫感染诱导的抗肝吸虫抗原变态反应，曾经是一种常用的肝吸虫感染筛查方法，但因存在假阳性，使用中可 能会引起过敏反应，存在生物安全风险，现已被停止使用。抗体检测试验，有间接血凝试验、对流免疫电泳试验、酶联免疫吸附试验、间接荧光抗体试验等均是检测肝吸虫感染刺激产生的抗肝吸虫抗原抗体IgG，由于这些方法均使用粗制肝吸虫成虫抗原，但检测病人结果出入较大，且与其它寄生虫感染(尤其是肺吸虫、血吸虫及旋毛虫类感染)有较明显的交叉反应，不能用作确诊，仅作为流行病学调查初筛之用。为了提高肝吸虫抗体检测的特异性，人们发展了多种重组抗原，如Cs7P、Cs28CP、Cs26GST、Cs28GST,现场研究其用于检测肝吸虫病人血清抗体IgG的敏感性分别是 r7P(47. 3%)、r28CP(30. 9%)、r26GST(21. 8%)和 r28GST(14. 5%)，特异性分别是 94. 5%、96. 7%,94. 5%和98. 9%，显示纯化重组抗原用于肝吸虫病的诊断具有高度的特异性，但敏感性太低，不能满足应用的需要。本发明的研究结果表明，以肝吸虫成虫抗原检测肝吸虫抗体IgG4具有高度的特异性，达到98. 2%，可以弥补检测总IgG抗体特异性不足的缺点，但其不足之处在于敏感性偏低，只有86%。进一步采用亲和素-生物素信号放大方法，可以将肝吸虫抗体IgG4检测方法的敏感性提高到90%，特异性仍保持在98. 2%，诊断效率达到96. 3%，可满足肝吸虫病临床诊断的需要。
发明内容
本发明提供一种检测肝吸虫抗原特异性抗体IgG4的生物素-亲和素酶联免疫检测试剂盒及检测方法，可以提高肝吸虫病免疫学诊断的敏感性、特异性。为达到上述目的，本发明采用的策略如下
肝吸虫感染人体过程中，其排泄分泌抗原刺激人体免疫系统产生一组抗肝吸虫抗原的抗体IgG，其中包括肝吸虫抗原特异性的抗体IgG4。肝吸虫抗原特异性抗体IgG4的特征是当患者体内有肝吸虫存在时，其血清中肝吸虫抗原特异性抗体IgG4维持一个较高水平。当患者经过有效治疗清除体内肝吸虫时，其血清中肝吸虫抗原特异性抗体IgG4水平迅速下降，呈抗原依赖性。检测患者血清中是否存在抗肝吸虫抗原特异性IgG4抗体可以判断是否存在肝吸虫感染，具有诊断与疗效考核价值。抗肝吸虫抗原特异性抗体IgG4具有高度的特异性，它与其它吸虫类寄生虫抗原之间的交叉反应率低，以肝吸虫抗原特异性抗体IgG4为检测靶标可以提高诊断方法的特异性。为提高肝吸虫抗体抗原特异性抗体IgG4的检测敏感性，本发明在构建IgG4酶联免疫检测方法时采用了生物素-亲和素信号放大系统，可使检测方法的信号增强10倍以上。肝吸虫抗原特异性抗体IgG4检测方法(生物素-亲和素酶联免疫法)具有高度的特异性和敏感性。本发明的技术方案一种肝吸虫抗原特异性抗体IgG4检测试剂盒，由包被有肝吸虫成虫抗原的酶标条1，生物素标记的抗人IgG4特异性单克隆抗体2，辣根过氧化物酶标记的链亲和素3，显色液A 4，显色液B 5，肝吸虫抗体IgG4阳性对照品6，肝吸虫抗体IgG4阴性对照品7，样品稀释液8，抗体稀释液9，浓缩洗涤液10，反应终止液11和外包装盒与说明书12组成。本发明提供一种肝吸虫成虫抗原的制备方法，具体地将肝吸虫虫体用生理盐水反复洗涤数次，洗尽肝吸虫虫体表面的附着物，直到洗涤液完全变澄清。用玻璃匀浆器在冰上将洗涤后肝吸虫虫体匀浆，加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为1禮，置于_80°C冰箱，反 复冻融后超声破碎后，高速离心，上清液即为肝吸虫成虫可溶性抗原。本发明提供一种包被有肝吸虫成虫抗原的酶标条的制备方法。具体如下用PH9. 6碳酸缓冲包被液将肝吸虫成虫抗原稀释成O. 5-10 μ g/mL的溶液，按每孔100 μ L的量包被酶标条，4°C放置过夜后，将酶标条孔的包被液倒出，用稀释洗涤液洗板三次,再用牛血清白蛋白封闭液进行封闭2h，倒去封闭液后用稀释洗涤液洗板三次，真空抽干，4°C储存备用。本发明提供一种生物素标记抗人IgG4特异性单克隆抗体，具体制备方法如下
(1)将分泌抗人IgG4单克隆杂交瘤细胞注射到小鼠体内，产生腹水；
(2)收集腹水,采用ProteanA亲和层析法纯化抗人IgG4特异性单克隆抗体；
(3)将单克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素，制备生物素标记的抗人IgG4单克隆抗体。本发明提供一种辣根过氧化物酶(HRP)标记的链亲和素(Streptavidin),具体制备如下
(I)辣根过氧化物酶在过碘酸钠(NaIO4)作用下，使HRP分子上的糖基氧化成醛基。透析去除化学试剂。(2)加链亲和素Str印tavidin，HRP醛基即可与链亲和素的氨基共价结合，形成Streptavidin-HRP 结合物。显色液A为市售品。显色液B为市售品。肝吸虫抗体IgG4阳性对照品6 由纯化的粪检虫卵阳性的肝吸虫病人抗体IgG配制而成，用本试剂盒进行检测其0D450nm吸光值大于O. 5 ；
肝吸虫抗体IgG4阴性对照品7 :由纯化的粪检确定为非肝吸虫感染的健康人群抗体IgG配制而成，使用本试剂盒进行检测其0D450nm吸光值小于O. I ；
样品稀释液8为含有牛血清白蛋白、Tween-20的磷酸缓冲液；
抗体稀释液9为含有牛血清白蛋白、Tween-20的磷酸缓冲液；浓缩洗涤液10为含Tween-20的磷酸缓冲液；
反应终止液11为硫酸。本发明提供一种肝吸虫抗原特异性抗体IgG4检测试剂盒(生物素-亲和素酶联免疫法)，其由以下成分组成
I、预包被肝吸虫成虫抗原的微孔板(96孔，浓度为I μ g/孔)。2、生物素标记的抗人IgG4特异性单克隆抗体(IOOyLXl瓶，工作浓度为I :5000稀释)。3、辣根过氧化物酶标记的链亲和素(100 μ LX I瓶，工作浓度为I : 5000稀释)。4、显色液A，5mLXl瓶，市售品，如南京金斯瑞生物科技有限公司产品。
5、显色液B，5mLX I瓶，市售品，如南京金斯瑞生物科技有限公司产品。6、肝吸虫抗体IgG4阳性对照品(100 μ LXl瓶，抗肝吸虫的抗体IgG，浓度为I μ g/mL)。7、肝吸虫抗体IgG4阴性对照品(100 μ LX I瓶，纯化的健康人IgG，浓度为I μ g/Π Τ,)η8、样品稀释液(12mLX I 瓶)，含 2%BSA 的 PBST。9、抗体稀释液(25mLX I 瓶)，含 2%BSA 的 PBST。10、浓缩洗涤液(20倍)(50mLXl瓶)，20XPBST浓缩液(Tween-20的终浓度为
O.05%)。11、反应终止液(6mLXl 瓶)，2M H2S04。12、外包装盒与说明书。按照上述方案，所述的阳性对照品由纯化的粪检虫卵阳性的肝吸虫病人抗体IgG配制而成，用本试剂盒检测其0D450nm吸光值大于O. 5。按照上述方案，所述的阴性对照品由纯化的粪检确定非肝吸虫感染健康人群抗体IgG配制而成，使用本试剂盒方法进行检测为阴性，其0D450nm吸光值小于O. I。按照上述方案，所述的样品稀释液为含有牛血清白蛋白、Tween-20的磷酸缓冲液。按照上述方案，所述的抗体稀释液为含有牛血清白蛋白、Tween-20的磷酸缓冲液。按照上述方案，所述的浓缩洗涤液为含Tween-20的磷酸缓冲液。按照上述方案，所述的终止液为硫酸。本发明提供一种检测肝吸虫抗体IgG4的方法，具体如下
I、试剂盒在室温平衡30min。浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水进行20倍稀释，得稀释洗涤液。2、取所需要使用的孔数(包括样本检测孔，阳性对照孔，阴性对照孔，空白孔)的酶标条，每次检测设阳性对照孔一个，阴性对照孔一个，空白孔二个，剩余的酶标条放入密封袋中保存。3、将酶标条固定于板架上，检测孔加入100 μ L样品稀释液，再加入I μ L待检测样品血清(或直接加入I : 100稀释的血清样本)，对照孔分别直接加入相应的对照样本。在37°C温箱温育45 min。4、甩尽孔中液体，加入稀释洗涤液到满孔(约350 μ L)，震荡30s后室温静置30s，甩�。偌尤胂∈拖吹右合吹樱绱酥馗�5次。
5、各孔加入100 μ L用抗体稀释液按1:5000稀释的生物素标记的抗人IgG4单克隆抗体，在37°C温箱温育45 min。6、用稀释洗涤液洗板5次后，加入100 μ L用抗体稀释液按1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的链亲和素，在37°C温箱温育45 min。7、用稀释洗涤液洗板5次，吸干各孔残留液体，将显色液A、B液等体积混匀后，各孔均加入A、B混合显色液50 μ L，室温避光显色5 min,各孔加入终止液50 μ L，轻微振荡混匀。8、以空白对照孔调零，用酶标仪测定各孔450nm的吸光值。本发明提供一种检测肝吸虫抗原特异性抗体IgG4的结果判断方法。具体如下，判读前所有对照与样本孔的A450nm值均应减去空白对照孔的A450nm值。·阳性样本孔的A450nm值彡阴性对照孔A450nm值的2. I倍,肝吸虫抗体IgG4阳性。 阴性样本孔的A450nm值彡阴性对照孔A450nm值的2. I倍。肝吸虫抗体IgG4阴性。本发明的有益效果提供一种对肝吸虫现症感染进行检测，或对肝吸虫病治疗效果进行评估的有效手段，敏感性达到90%，特异性达到98. 2%，阳性预测值PPV和阴性预测值NPV分别达到93. 8%和97. 0%。
具体实施例方式实施例I肝吸虫成虫抗原的制备
将肝吸虫虫体,用生理盐水反复洗涤虫体数次,洗尽虫体表面的附着物,直到洗涤液完全变澄清。用玻璃匀浆器在冰上匀浆，Imin/次，重复3-5次。向悬液加入蛋白酶抑制剂PMSF，置于-80 °C冰箱，反复冻融后超声破碎，4 °C条件下离心15 000 g离心30min，上清液即为肝吸虫成虫可溶性抗原。用BCA法测定抗原蛋白浓度，分装后于-80°C保存备用。实施例2肝吸虫包被酶标条的制备
用PH9. 6碳酸缓冲包被液(碳酸钠I. 59g，碳酸氢钠2. 93g，β -巯基乙醇lmL，蒸馏水定容至1L)将肝吸虫成虫抗原稀释到O. 5-10 μ g/mL,按每孔100 μ L的量包被酶标条，4°C放置过夜；将酶标条孔的包被液倒出，用稀释洗涤液洗板三次，再加入封闭液(5%牛血清白蛋白磷酸缓冲液)350yL，37°C封闭2h (或4°C封闭过夜)；将酶标条中的封闭液倒出，用稀释洗涤液洗板三次，真空抽干后封入装有干燥剂的铝箔纸中，4°C储存。实施例3生物素标记抗人IgG4单克隆抗体的制备 (O特异性抗人IgG4单克隆抗体的制备
I)免疫
取BALB/c雌鼠，6周龄，3-4只。将人IgG4 (SIGMA公司产品)与完全福氏佐剂I : I的体积比例充分混匀乳化，经颈背部皮内多点注射，免疫6周龄BALB/c小鼠(50 μ g/只)，第2，3次将佐剂换成不完全福氏佐剂，其余同第I次免疫，每隔2到3周免疫一次。第4次为加强免疫(30 μ g/只)，不加佐剂，腹腔注射。2)骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备
复苏Sp2/0细胞株，用含15%胎牛血清的RPMI1640培养液进行培养，使融合时细胞处于活性较佳的对数生长期。取周龄较长的BALB/c小鼠，腹腔注入37°C预温的RPMI1640培养液，用手指弹击小鼠腹部数次，再小心抽出腹腔中的培养液，离心收集腹腔细胞，计数，再按2 X 104/孔接种入96孔细胞培养板，在37°C进行体外培养，备用。3)细胞融合
融合前先将HAT完全培养液，基础培养液和PEG溶液置于37°C预温备用。无菌取免疫小鼠的脾脏，过200目钢丝网制备单个脾细胞。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:5的比例混合，悬液混合于50mL离心管中，洗涤3遍，将上清尽量弃�。檬种傅鞴艿祝沽街窒赴浞只煸�。用ImL的吸管吸取已经37°C预温的50%的PEG溶液lmL，深入管底轻轻搅动，Imin内加完，静置90s后，立即滴加预温的基础培养液，先后加入lmL，3mL, 5mL,时间都为lmin，继续补加培养液至40mL，静置5min，整个过程在37°C水浴中完成，离心，弃上清。加入HAT完全培养液，滴板。 4)杂交瘤细胞筛选
细胞培养至12天时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量，使用人IgGl，IgG2，IgG3，IgG4分别包板4°C过夜，5%BSA 37°C封闭2h，加入待检测的杂交瘤细胞培养上清，同时以免疫后小鼠血清作为阳性对照，并设置空白对照，洗涤后，加入与人血清预先吸附过的HRP标记的羊抗鼠二抗(由于人与小鼠免疫球蛋白的同源性很高，而未预先吸附的羊抗鼠二抗可识别人免疫球蛋白导致空白对照OD值升高，影响阳性孔的判断)，加入底物显色，2M H2SO4终止，波长450nm读板，选择阳性克隆，特异性识别IgG4且吸光度大于空白对照2. I倍时，判断为阳性。将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔I个细胞的数目接种在96孔培养板中进行亚克�。赴鲋澈蟪晌タ寺∠赴�。第一次克隆化(HT培养)时加一定量的饲养细胞。连续几次亚克隆后获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，及时冻存。( I)单克隆抗体的制备，纯化，效价的测定
取6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，腹腔注入降植烷(Pristane) O. 5mL/只。I周后腹腔注射杂交瘤细胞IX 106/只，轻轻按摩小鼠腹部，使杂交瘤细胞分散于腹腔中。7-10 d后收获腹水，离心取上清分装于_80°C保存。(2)单克隆抗体的纯化和效价的测定
将腹水解冻，离心去除凝块，取上清按50%饱和度加入等体积饱和(NH4) 2S04溶液，混匀后置4°C 4-6 h，离心弃上清，取沉淀加pH7.4、0.01mol/L的PBS复溶。透析去除(NH4)2SO4,按照Pharmacia公司提供的单抗纯化方案,样品于FPLC系统上Protein G亲和层析柱,甘氨酸-盐酸(PH2. 8)洗脱。收集第二个特异性蛋白峰流出液，及时用pH9. O的Tris溶液矫正pH至7. O。PBS透析后用BCA方法测定抗体蛋白的含量，产品除菌过滤后分装于-80°C长期保存。将10μ g/mL人IgG4包被酶标板，4°C过夜，封闭后加入一系列稀释度的单抗，37°C反应l_2h，洗板去除未结合的抗体，然后加入一定稀释倍数的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，37°C反应30min-lh，洗板加入TMB底物显色5_10min，用硫酸终止反应。在酶标仪上用450nm波长测定各孔的吸光度。以吸光度与空白对照孔吸光度之比大于2. I倍(P/N>2. I)的最闻稀释度为抗体效价。
(3)生物素标记特异性抗人IgG4单克隆抗体
将ImL浓度不低于lmg/mL的待标记单克隆抗体,移入透析袋中，用O. 01mol/L,pH大约9. 6的碳酸盐缓冲液透析平衡过夜，移入2mL EP管中。称Img活化生物素(BNHS)溶于ImLDMSO中。加浓度lmg/mL的BNHS-DMS0溶液40 μ L至单抗溶液中37°C避光震荡4h，再于4°C下在O. 01mol/L pH7. 2 PB中透析72h，约8_12h换液一次，除去游离BNHS，分装，-20°C保存。实施例4 HRP标记的链亲和素制备
Cl) 2. 5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于O. 6mL蒸馏水，加O. lmol/L过碘酸钠(NaIO4)
O.2mL,搅拌20min,加乙二醇O. ImL,搅拌IOmin,辣根过氧化物酶在过碘酸钠(NaIO4)作用下，使HRP分子上的糖基氧化成醛基，lmmol/L醋酸钠缓冲液(pH4. 4)，4°C透析过夜。(2)加链亲和素(Streptavidin)2mg,滴加pH9. 5, lmol/L碳酸钠缓冲液使pH上升 到9. O以上，振荡3h，加NaHB4 (4mg/mL) 60 μ L，4°C搅拌2h，则醛基即可与链亲和素的氨基共价结合，PBS透析过夜，加等量甘油，分装，_20°C保存。实施例5肝吸虫抗原特异性抗体IgG4检测试剂盒构建 肝吸虫抗体IgG4检测试剂盒(生物素-亲和素法)的组成如下
I、预包被肝吸虫成虫抗原的微孔板(96孔，浓度为I μ g/孔)。2、辣根过氧化物酶标记的链亲和素(100 μ LX I瓶，工作浓度为I : 5000稀释)。3、生物素标记的抗人IgG4特异性单克隆抗体(IOOyLXl瓶，工作浓度为I :5000稀释)。4、显色液A,5mLX I瓶,市售品。5、显色液B，5mLX I瓶，市售品。6、瓶肝吸虫抗体IgG4阳性对照品(100 μ LXl瓶，抗肝吸虫的抗体IgG，浓度为I μ g/mL)。7、肝吸虫抗体IgG4阴性对照品(100 μ LX I瓶，纯化的健康人IgG，浓度为I μ g/Π Τ,)η8、样品稀释液(12mLX I 瓶)。含 2%BSA 的 PBST。9、抗体稀释液(251111^1瓶)。含 2%BSA 的 PBST。10、浓缩洗涤液(20倍)(50mLX I瓶)。20XPBST浓缩液(Tween-20的终浓度为
0.05%)。11、反应终止液(6mLXl 瓶)。2M H2SO4。12、外包装盒与使用操作说明书。实施例6敏感性和特异性研究
使用试剂盒按操作说明书对50份粪检阳性肝吸虫病人血清进行检测，阳性率为90%，检测50份粪检阳性血吸虫病人血清，阳性率为0%，24份肺吸虫病人血清阳性率为12. 5%。对照试验使用常规ELISA检测IgG和IgG4，50份粪检阳性肝吸虫病人血清的检测阳性率分别为94%和86%。50份粪检阳性血吸虫病人血清检测阳性率分别为8%和0%，24份肺吸虫病人血清阳性率分别为54. 2%和12. 5%。与粪检结果相比，本试剂盒的检测敏感性和特异性分别为90%和98. 2%，阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)分别为93. 8%和97%，而相比较IgG的检测敏感性虽然能达到94%，但特异性仅为88. 1%，PPV和NPV分别为70. 1%和98%。常规ELISA检测IgG4的特异性虽能达到98. 2%，但其敏感性仅为86%，PPV和NPV分别为93. 5%和95. 9% (表1)，故本试剂盒在诊断上有较明显的优势。表I常规ELISA检测IgG、IgG4和生物素-链亲和素ELISA检测IgG4的肝吸虫病诊断特异性和敏感性的比较β
权利要求
1.一种肝吸虫抗原特异性抗体IgG4检测试剂盒，其特征在于由包被有肝吸虫成虫抗原的酶标条(I )，酶标条(I)为96孔微孔板，浓度为I μ g/孔； 生物素标记的抗人IgG4特异性单克隆抗体(2)，100 μ LX I瓶，工作浓度为I : 5000稀释； 辣根过氧化物酶标记的链亲和素(3)，100 μ LX I瓶，工作浓度为I : 5000稀释； 显色液A (4)，5mLXl瓶，市售品； 显色液B (5)，5mLXl瓶，市售品； 肝吸虫抗体IgG4阳性对照品(6)，100 μ LX I瓶，抗肝吸虫的抗体IgG，浓度为I μ g/mL ； 肝吸虫抗体IgG4阴性对照品(7)，100 μ LX I瓶，纯化的健康人IgG，浓度为I μ g/mL ； 样品稀释液(8)，12mLX I瓶，含2%BSA的PBST ； 抗体稀释液(9)，25mLX I瓶，含2%BSA的PBST ； 浓缩洗涤液(10)，50mLXl瓶，工作浓度为I : 20稀释； 反应终止液(11)，61^父1瓶，21 H2SO4 ； 和外包装盒与说明书(12)组成； 所述肝吸虫成虫抗原的制备将肝吸虫虫体用生理盐水反复洗涤数次，洗尽肝吸虫虫体表面的附着物，直到洗涤液完全变澄清；用玻璃匀浆器在冰上将洗涤后肝吸虫虫体匀浆，加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟PMSF至终浓度为ImM，置于-80°C冰箱，反复冻融后超声破碎后，4°C条件下高速离心，上清液即为肝吸虫成虫可溶性抗原，分装后于-80°C保存备用； 包被有肝吸虫成虫抗原的酶标条(I)的制备用PH9. 6碳酸缓冲包被液将肝吸虫成虫抗原稀释成O. 5-10 μ g/mL的溶液,按每孔100 μ L的量包被酶标条,4°C放置过夜后,将酶标条孔的包被液倒出，用稀释洗涤液洗板三次，再用牛血清白蛋白封闭液进行封闭2h，倒去封闭液后用稀释洗涤液洗板三次，真空抽干，4°C储存备用； 生物素标记的抗人IgG4特异性单克隆抗体(2)的制备 (a)将分泌抗人IgG4单克隆杂交瘤细胞注射到小鼠体内，产生腹水； (b)收集腹水,采用ProteanA亲和层析法纯化抗人IgG4特异性单克隆抗体； (c)将单克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素，得到生物素标记的抗人IgG4特异性单克隆抗体； 辣根过氧化物酶标记的链亲和素(3)的制备 Cd)辣根过氧化物酶HRP在过碘酸钠NaIO4作用下，使HRP分子上的糖基氧化成醛基，透析去除化学试剂； Ce)加链亲和素Streptavidin, HRP醒基与链亲和素的氨基共价结合，形成Streptavidin-HRP 结合物； 显色液A (4)为市售品； 显色液B (5)为市售品； 肝吸虫抗体IgG4阳性对照品(6)，由纯化的粪检虫卵阳性的肝吸虫病人抗体IgG配制而成，用本试剂盒进行检测其0D450nm吸光值大于O. 5 ； 肝吸虫抗体IgG4阴性对照品(7):由纯化的粪检确定为非肝吸虫感染的健康人群抗体IgG配制而成，使用本试剂盒进行检测其0D450nm吸光值小于O. I ； 样品稀释液(8)为含有牛血清白蛋白、Tween-20的磷酸缓冲液； 抗体稀释液(9)为含有牛血清白蛋白、Tween-20的磷酸缓冲液； 浓缩洗涤液(10)为含Tween-20的磷酸缓冲液； 反应终止液(11)为硫酸。
2.用权利要求I所述肝吸虫抗原特异性抗体IgG4检测试剂盒检测肝吸虫抗体IgG4的方法，其特征在于步骤为 (1)试剂盒在室温平衡30min，浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水进行20倍稀释，得稀释洗涤液； (2)取所需要使用的孔数的酶标条，包括样本检测孔，阳性对照孔，阴性对照孔，空白孔，每次检测设阳性对照孔一个，阴性对照孔一个，空白孔二个，剩余的酶标条放入密封袋中保存； (3)将酶标条固定于板架上，检测孔加入IOOyL样品稀释液，再加入Iμ L待检测样品血清或直接加入I : 100稀释的血清样本，对照孔分别直接加入相应的对照样本，在37°C温箱温育45min ； (4)甩尽孔中液体，加入稀释洗涤液到满孔350μ L，震荡30s后室温静置30s，甩干后，再加入稀释洗涤液洗涤，如此重复5次； (5)各孔加入100μ L用抗体稀释液按1:5000稀释的生物素标记的抗人IgG4单克隆抗体，在37°C温箱温育45min ； (6)用稀释洗涤液洗板5次后，加入100μ L用抗体稀释液按1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的链亲和素，在37°C温箱温育45min ； (7)用稀释洗涤液洗板5次后，吸干各孔残留液体，将显色液A、B液等体积混匀后，各孔均加入A、B混合显色液50 μ L，室温避光显色5 min,各孔加入终止液50 μ L，轻微振荡混匀； (8)结果判断以空白对照孔调零，用酶标仪测定各孔450nm的吸光值， 判读前所有对照与样本孔的A450nm值均应减去空白对照孔的A450nm值； 阳性样本孔的A450nm值彡阴性对照孔A450nm值的2. I倍，肝吸虫抗体IgG4阳性； 阴性样本孔的A450nm值彡阴性对照孔A450nm值的2. I倍，肝吸虫抗体IgG4阴性。
全文摘要
一种肝吸虫抗体IgG4生物素-亲和素酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，属于寄生虫病免疫检测领域。本发明提供一种基于检测抗肝吸虫抗原特异性抗体IgG4的肝吸虫感染检测试剂盒及检测方法，可以区分肝吸虫感染患者与非肝吸虫感染患者。本试剂盒以肝吸虫抗原特异性IgG4为检测靶标，提高肝吸虫病检测方法的特异性；采用生物素-亲和素信号放大系统，可以增强酶联免疫检测方法的信号强度，提高了肝吸虫病检测方法的敏感性。与常规检测总IgG方法相比，本发明具有更好的特异性、敏感性与检测效能，有更好的临床应用价值。
文档编号G01N33/558GK102830231SQ20121033818
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者余传信, 王玠, 沈双, 宋丽君, 殷旭仁, 许永良 申请人:江苏省血吸虫病防治研究所
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