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专利名称：用于循环性巨噬细胞的性质确定和/或分类的方法以及施行该方法的分析安排的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过非细胞自身抗原的用于循环性巨噬细胞的性质确定和/或分类的方法，以及施行这样的方法的分析安排。
从Sinha，Wilson，GleasonImmunoelectron microscopiclocation of prostatic-specific antigen in human prostate by theprotein A-gold complex，Cancer，1987，60，1288-91中已知，来自前列腺组织的细胞的电子显微镜检查的实施，其中根据所引用的文献将前列腺的正常组织、前列腺癌组织和前列腺增生组织与金标记的PSA抗体进行温育。检查表明金颗粒存在于细胞质、细胞内颗粒、RES和溶酶体中。随着增加的肿瘤的终末分化，更多的金颗粒出现在膜结构中。这认为是下列情况的标志，即PSA(前列腺特异性抗原)随着增加的肿瘤细胞的终末分化而存留于膜结构中。该检查的另一个方面为在粒细胞和巨噬细胞中同样检测出金颗粒。
在流式细胞计量术检查中，在循环血中发现PSA阳性的细胞。但是在之前已知的检查中，只有巨噬细胞的表面因PSA而被染上颜色。
在巨噬细胞中没有发现PSA分子的mRNA这一事实导致这样的单一结论，即只吸收了PSA分子，而不涉及消除微转移。参见Brandt，Griwatz，BrinkmannCirculating prostate-Specific antigen/CD14-double-positive cells；a biomarker indicating low risk for hematogeneousmetastasis of prostate cancer，J.Natl.Cancer Inst.1997；89，174。
众所周知，聚集在较有序或较无序的细胞群中的组织组成细胞的恶性变化称为肿瘤。这些肿瘤细胞无视组织的排列，无限制地生长，和通过大小的增加以及浸润入其他的周围组织、器官中而扩张，或者跨越组织界限而进入血管系统或淋巴系统中。
一旦肿瘤到达血管系统或淋巴系统，那么此处的单个细胞或细胞群会通过这些系统游离开，并作为子肿瘤即转移灶而在身体的其他部位附着。在此存在这样的危险，即转移灶继续生长并掠夺身体的能量，直至身体衰亡和被其疾病所击倒。
在这种肿瘤的形成期间，肿瘤细胞产生用于促进其生长的物质。另外，可作为肿瘤生长指示物的物质可被释放出来。后者称为肿瘤标记。但是这些标记对于肿瘤不是特异的，而只有血液中所测量的浓度的数量，因为健康的细胞也能够释放这些物质。因此，肿瘤标记不能用于检测肿瘤，而只能用于疾病或治疗过程的监测。肿瘤的一个特殊标记为前列腺特异性抗原(PSA)，从血液中的一定浓度开始其就表明有前列腺癌。但是，前列腺的良性增大也可以引起血液中PSA值的升高。
迄今，肿瘤疾病主要通过给出图像的方法来诊断，例如超声波或计算机断层摄影术、乳腺造影法等等。可是，只有根据含有肿瘤的组织样品才能作出最终的确定，并确定治疗过程。
肿瘤疾病引起人体自身的免疫系统的对抗。这种免疫系统由一系列执行不同任务的不同细胞类型组成。其中，巨噬细胞具有这样的任务，即识别某些病样物质，吞噬之，并将其分解成其组分。随后，将被吞噬的细胞的片段呈递在其他免疫细胞的表面上，因此这使得能够识别应当进攻的结构。
存在迫切的需求以在早期阶段施行循环性巨噬细胞的性质确定，而无须进行人体的直接检查。
本发明的任务在于提供使得能够施行循环性巨噬细胞(PBMC)的性质确定和/或分类的方法以及分析安排。
根据本发明，由于能够在循环性巨噬细胞中检测被吞噬的肿瘤细胞的抗原或片段，因此能够施行直接和特异的肿瘤检测。
根据本发明，抽取全血样品，随后进行梯度离心以分离巨噬细胞。然后将巨噬细胞穿孔，并施行使用至少一种经挑选的抗体的细胞内染色。
随后，使用本身已知的流式细胞计量术以在单一水平上记录细胞性质。
流式细胞计量术使得能够在液体流中进行细胞计数和分析细胞的物理和分子性质。具体地而言，借助于荧光染料标记的试样如抗体而在单一水平上测定细胞或细胞群体的性质并记录。
在此，使用荧光染料标记的抗体的抗原-抗体反应是基础。为了分析，将单个悬浮液的细胞通过流体动力聚焦(hydrodynamischeFokussierung)导向具有合适波长的激光束。在通过单色激光束相应地激发荧光染料的电子时，这些电子跃迁至较高的能量水平。在激光脉冲之后，电子返回其初始水平，同时以光子的形式释放出能量。用光检测器记录下的所述发射出的光子密度与每个细胞所结合的抗体数量成比例。另外，通过光衍射和散射可进一步获得关于细胞大小和内部结构即细胞质的颗粒性以及细胞核大小的信息。
使用前列腺特异性抗原、细胞角蛋白抗体和/或上皮膜抗原作为经挑选的抗体。
然后根据本发明，通过在巨噬细胞中进行PSA抗体染色就能够确定被吞噬的物质是否与前列腺相关。
用于施行该方法的分析安排包括用于肝素化所抽取的血液的试剂、用于分离巨噬细胞的梯度离心机、用于细胞穿孔的试剂、用于使用荧光染料标记的抗体对经预处理的细胞进行细胞内染色的装置和用于测定各自分离并经预处理的细胞的细胞内结构并且具有计算机支持的评价单元的流式细胞计量仪，该分析安排用于早期发现肿瘤的目的。
在下文中将依靠实施例更详细地解释本发明。
在血液抽取和染色的步骤中，从例如6ml全血开始进行肝素化。借助于梯度离心分离单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞。
在下一步骤中，进行细胞的甲醛固定和皂草苷处理以达到穿孔的目的。
随后是使用例如下表中的经挑选的抗体进行细胞内染色的步骤。
PSA抗体Ab-1(Clone ER-PRS)全细胞角蛋白-FITC
上皮膜抗原(Clone E 29)同型对照IgG1(Clone DAK-GO1)第二抗体FITC山羊抗小鼠(DAKO)然后，将相应的直到分析才再次固定的细胞通过流式细胞计量术进行更详细的检查。选通单核细胞和巨噬细胞，即只有一部分测量结果用于评价，并进行预选择。
然后，通过柱状图分析来评价同型对照和染色，并给出例如以百分比表示的阳性细胞数量。
其表明，对于患有扩散型前列腺瘤的患者，当用细胞角蛋白进行巨噬细胞的染色时，在相应的人的循环免疫细胞中发现组织细胞的组成结构部分。因为这些组成成分不是免疫细胞的原始内容物，所以他们一定是通过吞噬作用而被纳入的。由于细胞角蛋白的纳入曲线过程明显与同型的不同，因此可以排除非特异的作用。
巨噬细胞中的PSA染色证明，经吞噬的物质一定与前列腺组织相关，因为该特异性标记也是可检测的。
总之，通过使用所述的方法和附属的分析安排，能够得到用于循环性巨噬细胞的性质确定和分类的新型方法，其中分类使得能够指出可能的前列腺相关内容物。
权利要求
1.用于循环性巨噬细胞和/或外周血液单核细胞的性质确定和/或分类的方法，其具有下列步骤-抽取全血以及进行梯度离心以分离巨噬细胞，-将巨噬细胞穿孔，-用至少一种经挑选的抗体进行所述细胞的细胞内染色，以及-进行所述经预处理的细胞的流式细胞计量分析，并随后对于更多的细胞进行统计学评价，
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，使用前列腺特异性抗原(PSA)、细胞角蛋白和/或上皮膜抗原作为所述经挑选的抗体。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，在施行流式细胞计量术之后进行同型对照和染色的柱状图分析。
4.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其用于在人体外检测通过吞噬作用而纳入的扩散型前列腺瘤的组织细胞部分。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于，通过所述巨噬细胞中的所述PSA染色确定被吞噬的物质是否与前列腺相关。
6.用于施行根据前述权利要求中任何一项所述的方法的分析安排，其包括用于肝素化所抽取的血液的试剂、用于分离巨噬细胞的梯度离心机、用于细胞穿孔的试剂、用于使用荧光染料标记的抗体对所述经预处理的细胞进行细胞内染色的装置和用于测定各自分离并经预处理的细胞的细胞内结构并且具有计算机支持的评价单元的流式细胞计量仪，该分析安排用于早期发现肿瘤的目的。
全文摘要
本发明涉及用于循环性巨噬细胞的性质确定和/或分类的方法以及分析安排。将抽取的全血进行梯度离心以分离巨噬细胞。然后将巨噬细胞穿孔，并施行使用至少一种经挑选的抗体的细胞内染色。然后，经预处理的细胞的流式细胞计量术分析使得能够进行随后的细胞内容物的统计学评价。选择PSA、细胞角蛋白和/或上皮膜抗原作为抗体。
文档编号G01N33/48GK1668922SQ03816702
公开日2005年9月14日 申请日期2003年6月2日 优先权日2002年6月26日
发明者拉尔夫·赫维希 申请人:拉尔夫·赫维希