专利名称：一种微生化检测和分析方法及仪器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生化检测与分析方法及仪器，属于先进制造与自动化
背景技术：
当前许多发达国家已把现代科学仪器当作信息的源头和基础纳入其未来发展的战略重点，分析仪器是其中最重要的组成部分之一，而微型全分析系统(Miniaturized Total Analysis Systems，μTAS)正是目前分析仪器发展的重要前沿领域。当前，分析仪器的发展正在出现一个以微型化、集成化为主要特征的、带有革命性的重要转折时期。90年代初由Manz等人提出的以多学科交叉为重要特征的μTAS正是这一转折的代表[Sensors Actuators B 1990，1p2442]，它不仅可使珍贵的生物样品与试剂消耗大大降低到微升甚至纳升级，而且使分析速度成十倍百倍地提高，费用成十倍、百倍地下降。微型全分析系统或称芯片实验室(Lab-on-a-Chip，简称LOC)是一个跨学科的新领域，其目标是通过微电子机械加工(MEMS)、分析化学、计算机、电子学、材料科学及生物学、医学的交叉实现生物和化学分析系统从试样处理到检测的整体微型化、自动化、集成化与便携化。
将MEMS技术应用于生物医学领域称为生物微机电系统(Bio-MEMS)，是微型全分析系统当前的研究热点之一，也即采用MEMS技术在数平方厘米大小的玻璃、石英和硅片等材料上加工出缩小到数毫米至数微米尺度的容器、泵、阀、管道等，将整个生化实验室的功能，包括样品处理、进样、反应、分离、检测等集成在微芯片上，用来进行DNA、蛋白质等生物样品的分析，这样不仅减少了实验耗时和样品用量，而且由于其实验装置体积小而轻便，易于控制，还适用于需要实地采样和分析的工作。由于Bio-MEMS具有功能独特、体积小、重量轻、批量生产成本低等优点，在生物医学领域将得到广泛应用。
应用Bio-MEMS技术不仅可以对现有的生物医疗器械进行改进和完善，而且可以创造出新的分析操作手段，极大地推动医疗事业和生物工程技术的发展。
微通道电泳芯片(micro-channel electrophoresis chip)是Bio-MEMS当前的热点之一，它的应用领域主要是生命科学，在多肽、蛋白质、核酸等生物大分子的分离分析上有着越来越广泛的应用，同时，微通道电泳芯片迅速扩展到其它领域，如食品化学、药物化学、医学、环境科学、法医学等领域。
目前，国际上很多大公司和科研机构在开发Bio-MEMS方面的微通道芯片检测仪器，但多基于激发荧光检测的原理，对一些难于荧光标记的样品就无能为力。
发明内容
本发明目的在于一种微生化检测和分析方法及仪器，其方法是利用紫外可见吸收检测的原理，采用MEMS技术加工微通道芯片，由计算机控制芯片操作和信号采集和处理，从而扩大了微通道芯片可检测样品的范围，并实现对不同结构的微通道芯片进行自动化的检测和分析。
仪器采用微电子机械(Micro-electromechanical Systems，MEMS)工艺加工微通道电泳芯片，并应用紫外可见双波长吸收检测的方法，由计算机控制微芯片的进样和分离并对检测到的生物信号进行采集、存储和处理。从而构建了一个技术平台，可实现对不同结构微通道电泳芯片的各种生化应用进行自动化检测和分析。
本发明提供的微生化检测和分析仪设计成子系统模块化。仪器主要由光源�？�、单色仪�？椤⑿酒捌涞缭茨？�、光路聚焦及信号采集�？�、电路滤波和放大模块、计算机信号处理及电源控制�？�、用户工作界面�？榈绕吒鲎幽？樽槌�。总系统以芯片及其电源�？槲诵模迪盅返慕头掷耄挥晒庠春偷ド翘峁┘觳庋匪璧牡ド馊肷涞窖贩掷胨诘挠镜乐校挥晒饴肪劢辜靶藕挪杉？榘丫肺蘸蟮墓庑藕呕峋酆筒杉⒆怀梢子诖淼牡缧藕牛辉倬瞬ê头糯蟮缏反砗笫淙爰扑慊挥杉扑慊荼痉⒚魉杓频淖ㄓ萌砑允淙氲牡缧藕沤写砗痛娲ⅲ笨刂菩酒缭醇拥缒Ｊ降淖唬辉偻ü押玫挠没Чぷ鹘缑媸迪侄哉鍪笛楣痰淖远刂�。
提供的微生化检测和分析方法以毛细管电泳原理为基�。米贤饪杉占觳獾姆椒ǎご砗蟮拇庋芳尤胛⑼ǖ佬酒薪械缬荆诘绯〉淖饔孟拢煌ざ鹊钠谓床煌那ㄒ坡史挚ド枪饧觳饪冢肺仗囟úǔさ墓獠辗澹偻ü饴废低辰谢峋酆凸獾绫对龉�(PMT)放大后，经光电转换�？樽涑傻缧藕牛扑慊藕糯砗蟊憧梢匀范ù庋返闹掷嗪褪�。
本发明微生化检测和分析仪中所使用的微通道芯片，其制作方法包括下列步骤(1)微通道芯片的设计根据微通道芯片的功能要求，结合相应的工艺条件，考虑以下几个参数进样泳道和分离泳道的宽度、长度、管道的形状(包括弯道、弧度、不规格形状等)和管道间的距离等进行芯片图形设计，将设计好的图形制作成掩模版；(2)微通道芯片的制作步骤是选择优质石英作为芯片的基片，利用光刻湿法腐蚀方法在基片上形成凹槽等，然后利用键合技术形成微管道网络，构成微通道芯片。其优点是湿法腐蚀过程采用铬和光刻胶双层保护，保护可靠，键合过程采用预键合和烧结过程相结合的方法，免除了复杂的升温降温程序，工艺过程更简化，工艺条件较易满足，方法具有通用性，适用范围广。
本发明微生化检测和分析仪中的光源�？橛呻坪弯逦俚扑庠醋槌桑馄追段Т�180nm到900nm，满足大多数样品特征吸收波长的需要，从而扩大了可检测样品的种类，两种光源可以依据需要进行方便的切换。单色仪�？橛扇肷湎练�、会聚凹面镜、平面反射镜、全息光栅和出射狭缝组成，光源发出的光由入射狭缝进入单色仪，经过反射和会聚后投射到全息光栅上，从而色散成单色光再经过会聚和反射后从出射狭缝聚焦到芯片的检测泳道上。本发明将单色仪设计成连续可调，以光栅竖直轴为中心，通过微齿轮传动细分机械结构对光栅进行微调，改变光栅水平方向的角度，这种调节可以使出射光精确到纳米量级。出射光经过芯片中样品吸收后由透镜会聚到光电倍增管(PMT)，然后PMT将光信号转换成电信号，送至信号处理电路，经滤波、放大等处理后，再由A/D转换电路将模拟信号变为数字信号送入计算机，由本发明设计的专用软件进一步处理。计算机信号处理及电源控制�？橹饕迪忠韵鹿δ埽訟/D转换后的数字信号进一步处理；高压电源控制根据需要，自动控制、调整加到芯片各个电极的电压变化；模式自动切换利用继电器控制各个模式间的程控切换；过流保护检测电泳时的电流值，一旦超过最大允许电流值或出现电流倒流情况，自行调整高压电源的输出电压。用户工作界面�？樘峁┤嘶换テ教ǎ没Э梢员嗉笛樗璨问袢∫瞧鞯牡鼻白刺凳毕允狙沸藕诺牡缬就夹危⒔笛槭荽娲⒌郊扑慊�。
本发明的优点是，采用紫外可见吸收检测的方法，避免了样品的荧光标记，简化实验操作，更重要的是使许多难于标记或者标记效率低的样品也能被检测和分析；采用双光源并利用精密机械调节可以提供全光谱范围的单色光，使得可以检测和分析的样品范围大大扩大。自动控制芯片的进样和分离，实现了程控化操作，信号的采集放大和处理都由计算机自动完成，提高了效率和数据的准确性，控制和信号分析软件功能强大、界面友好、操作简便。而且与激光共聚焦检测仪器相比，大大降低了制造成本，更有利于推广。
图1是本发明微生化检测和分析仪的总系统设计框图。其中，1是光源�？椋�2是单色仪�？椋�3是芯片及其电源�？椋�4是光路聚焦及信号采集�？椋�5是滤波和放大电路模块；6是计算机信号处理及电源控制模块；7是用户工作界面�？�。
图2是本发明微生化检测和分析仪的控制系统与电信号检测系统原理图。其中，8是低压电源�？椋�9是高压电源控制�？椋�10是模式自动切换模块；11是信号硬件处理�？椋�12是数/模、模/数接口�？椋�13是保护�？�(过流保护)。
图3是本发明微生化检测和分析仪的光学检测原理示意图。其中，14是微通道芯片；15是平面反射镜；16是入射狭缝；17是出射狭缝；18是凹面镜；19是全息光栅；20是光电倍增管(PMT)；21是会聚透镜。
图4是本发明微生化检测和分析仪的模式切换工作原理图。其中，22是工作电源；23是继电器，24是控制电源，25是芯片加载电极。
图5是本发明微生化检测和分析仪的信号处理原理流程图。
图6是本发明微生化检测和分析仪的用户工作界面图。
具体实施例方式
下面结合附图详细说明符合本发明主题的具体实施方式
。
本发明微生化检测和分析仪的制造，可采取分步实施的方法，先完成系统中的各个�？椋缓蠼鞲瞿？樽楹狭樱瓿烧黾觳夥治鲆堑闹圃�。其中，光源�？�1和单色仪�？�2是检测系统的独立光路机构，故可先单独制造。光源模块1由氘灯和溴钨灯双光源组成，氘灯和溴钨灯同时采用，光谱范围从180nm到900nm，两种光源之间设计制作了两个光学暗室，中间由可扳动的机械开关控制，可以依需要进行方便的切换。单色仪�？�2由入射狭缝16、会聚凹面镜18、平面反射镜15、全息光栅19和出射狭缝17组成，光源1发出的光由入射狭缝进入单色仪，经过与入射光线成45度角的平面反射镜15反射后到达会聚凹面镜18，经过其会聚后投射到全息光栅19上，全息光栅19把入射光线色散，再经过另一组会聚凹面镜18和平面反射镜15会聚和反射后从出射狭缝17聚焦成单色光投射到芯片的检测泳道上。我们设计制作一个微齿轮传动细分机械结构来调节全息光栅19在水平方向上的角度，它可以使光栅以竖直方向的轴为中心微调，这样，通过调节光栅的角度使色散出的单色光连续变化，并可依次通过出射狭缝17，这一结构可以使出射的单色光精确到纳米量级。
单色仪2上面制作了一个光滑的金属平台作为芯片台，出射狭缝17嵌入到这一平台中，距离平台上表面1毫米，出射狭缝17设计宽度200微米，出射光通过出射狭缝向上，会聚在高于出射狭缝平面2毫米的水平面上，而这一平面正是本发明设计制作的微通道芯片放置在芯片台时泳道所在的水平面。
芯片及其电源�？�3主要是由微通道芯片和各个溶液池所加电源组成，微通道芯片采用微电子技术加工石英玻璃制作而成，可以避免紫外区吸收，主要包括光刻、腐蚀、键合等工艺；各溶液池所加电源是各自独立的可控高压电源�？椋⑼ü鸬缂缪辜釉氐礁魅芤撼刂小�
光路聚焦和信号采集�？�4由透镜和光电倍增管PMT组成，单色仪2的出射光经过芯片泳道中样品吸收后，由透镜21会聚到光电倍增管PMT20，透镜21采用石英玻璃制作，避免紫外区吸收。PMT将光信号放大并转换成模拟电信号，送至电路滤波和放大�？�5，经滤波、放大等处理后再由A/D转换电路将模拟信号变为数字信号，送入PC机由我们设计的专用软件进一步处理。由于光路聚焦和信号采集�？�4检测到的生物信号通常比较微弱，通常在毫伏级，并且易受到外界噪声的干扰和影响，本发明采取了以下措施改进，加工一个全封闭的仪器外壳，将待检芯片和PMT置于其中，尽可能减少信号光强的损失及外界光照对有效信号的干扰和影响。
更重要的是本发明设计了电路滤波和放大模块5，其具体构建如下考虑到数字滤波效果比模拟滤波更好，所以模拟信号处理主要是放大低频信号、抑止50Hz的工频干扰，对信号进一步的滤波处理则由数字滤波器完成。电路设计，经过PMT转换后的模拟信号首先通过10赫兹二阶以及一阶巴特沃斯低通滤波器进行滤波处理，再经低噪声放大器进行前级放大，信号的幅度大大提高，同时低频噪声也相应地被放大，再经过低通滤波器进行滤波处理后，进行二级放大，最后将信号滤波送至A/D采集卡转换为数字信号。滤波器的设计采用巴特沃斯(Butterworth)滤波器，这是因为巴特沃斯滤波器是实因果稳定递归滤波器，对于任何阶数N，通带内有平坦的幅频增益，带外呈单调衰减特性；当阶数N增加时，幅频特性愈接近理想的矩形特性，带外的衰减愈加陡峭。本发明采用的是N＝4巴特沃斯低通滤波器。用运算放大器构成的放大电路，其放大倍数取决于电阻的比值。模/数转换接口电路，经滤波、放大后的模拟信号要通过A/D转换电路变为数字信号，才能送入计算机做进一步的处理。本发明采用了中泰工控公司的PC-6315模入模出接口卡。A/D转换利用了接口卡模入的部分。A/D转换分辨率12位；A/D非线形误差±1LSB(＝2.44mV)，考虑到与信号处理单元的输出信号相匹配，我们选取0V～10V的输入信号范围；启动方式和转换结束方式设定为程序查询；程控放大器的增益则由软件在运行过程中，根据实际情况决定。硬件的抗干扰设计，模式控制单元和信号处理单元的电源独立，减少切换时，对信号的脉冲干扰；接口电路中，模拟和数字部分的地线独立，且模拟信号的地采用悬浮方式；在系统的关键部分安放去耦电容，如在电源输入端跨接47μ的电解电容，减少空间辐射、地线干扰等。软件的抗干扰设计，模式切换完成后，延迟1秒，开始采集数据。减少切换时的脉冲干扰对有效信号的影响。
构建计算机信号处理和电源控制�？�6主要功能是实现控制微通道电泳芯片各个溶液池中所加电极的电压，并按照一定次序通以或切断高压电，实现样品的进样与分离。它由信号处理软件和继电器电路组成。选用的继电器工作电压为5V，有常闭、�？蕉砸鼋�。当加上工作电压后，�？囊诺纪�。利用计算机送出的高、低电平控制继电器的工作状态，可实现进样与分离两种模式的自动切换。根据电泳所需的电压，选用两个低压控制高压的电源�？�。分别为0～1000V(控制电压0～5V)和0～5000V(控制电压0～5V)。图4为电源�？榻涌诘缏�。Vin(输入电压)是计算机送出的经过D/A转换的模拟信号，控制高压电源的输出。Vin经过电压跟随器送入高压电源�？榈目刂剖淙攵恕out为输出的高压。24V电源提供高压电源�？榈墓ぷ鞯缪�。工作时，计算机会根据用户设定的参数，计算出当前模式各个电源控制端应加的电压，由数/模转换电路变为模拟信号送出，经过电压跟随器加到电源的控制端。电压跟随器起到隔离保护的作用。定时控制的功能由软件完成。在程序中设置一个定时器，进样或分离开始时，启动定时器工作；当进样或分离的时间到达后，定时器会触发数/模转换电路向电源控制端口送0，并触发继电器切断电源模块的工作电压，从而达到定时控制的作用。保护模块的制作，进样、分离时，微通道内的电流不能太大，否则产生的焦耳热会影响分析的结果，因此，要对整个电泳系统进行过流保护。一旦通道内电流过大，电压自动降低，将电流的大小限定在一定的范围内(一般≤50微安)。这个功能需要一个反馈回路实现。在整个回路中串联一个电阻，通过电阻将电流值变为电压值送回计算机。计算机根据电阻的阻值计算出回路中电流的大�。ü朐ど璧淖畲蟮缌髦当冉虾螅卸鲜欠裥枰髡缪梗绻缌鞴螅扑慊嵬ㄖ缭纯刂颇？榻档涂刂频缪�。再检测电流，判断是否需要调整电压。通过系统的自行调节，到达电流许可范围内，最接近用户预设的电压值。
构建用户界面�？�7全部用软件编程来实现，提供了一个人机交互的平台，通过它用户可以编辑实验所需参数；获取仪器的当前状态；电泳图谱的实时显示，进而控制整个分析流程。实验时，原始实验数据会以曲线的形式在图像检测窗口实时图形化显示，可以让检测人员监控整个样品的电泳分析过程。当连续多次对同一生物样品进行分析检测时，每次的原始电泳图谱也可以在同一个窗口平行显示，便于用户在第一时间直观地对比两次或多次的实验结果。当一次电泳结束后，经过软件处理的数据也可以以图谱形式显示。所有的图谱都会以bmp的图片格式存储，便于用户将电泳图谱插入文稿中。用户界面中的图像监测窗口可以随时实时的监控微通道中样品的分离情况各电极的理论电压值、实际电压值；微通道中的电流、进样时间、分离时间和剩余时间，便于掌控整个实验过程的每一步，以确定电泳条件的有效性。
各�？橥瓿珊螅髂？樽楹狭烧鱿低�。首先将光路系统部分安装好，仔细调节各光学器件的位置、角度。然后安装芯片台控制部件，再安装聚焦透镜和PMT，使PMT的检测口对准微管道上的检测窗口。PMT固定后，将模式切换�？橛敫哐沟缭茨？椤⑿藕糯淼ピ悠鹄矗庑┎考侠淼陌卜旁谝瞧髦校俳藕糯淼ピ氖涑�、各部件的控制器与计算机内的模/数、数/模接口相连接。最后安装用户界面，联机，安装数据处理软件，通过计算机接口与仪器控制器相连，实现计算机的自动控制。
整台仪器的使用过程中，操作人员只需将装有样品的芯片放入检测区，选择合适的光源波长，打开软件的用户界面，输入电泳条件参数，按下“Start”键，无需更多的手工操作，就可以完成对生物样品的分析。系统提供了进样、分离的自动切换，精确定时控制。仪器可以实现对同一样品的多次重复实验；也可以在不同的电泳条件下，对同一样品连续多次分析，只需在参数设置中设置每次的电泳条件即可。
权利要求
1.一种微生化检测和分析方法，包括紫外检测，其特征在于，将预处理后的待测样品加入微通道芯片中进行电泳，在电场的作用下，不同长度的片段将按不同的迁移率分开，通过单色仪光检测口，样品吸收特定波长的光产生吸收峰，再通过光路系统进行会聚和光电倍增管放大后，经光电转换�？樽涑傻缧藕牛扑慊藕糯砗螅纯扇范ù庋返闹掷嗪秃�。
2.一种微生化检测和分析仪，其特征在于，它由光源�？�(1)，单色仪�？�(2)，芯片及电源�？�(3)，光路聚焦及信号采集�？�(4)，电路滤波和放大�？�(5)，计算机信号处理及电源控制�？�(6)，用户工作界面�？�(7)七个子�？楣钩桑灰瞧饕孕酒捌涞缭茨？槲诵模迪盅返慕头掷耄挥晒庠春偷ド翘峁┘觳庋匪璧牡ド馊肷涞窖贩掷胨诘挠镜乐校挥晒饴肪劢辜靶藕挪杉？榘丫肺蘸蟮墓庑藕呕峋酆筒杉⒆怀梢子诖淼牡缧藕牛辉倬瞬ê头糯蟮缏反砗笫淙爰扑慊挥杉扑慊荼痉⒚魉杓频淖ㄓ萌砑允淙氲牡缧藕沤写砗痛娲ⅲ笨刂菩酒缭醇拥缒Ｊ降淖唬辉偻ü押玫挠没Чぷ鹘缑媸迪侄哉鍪笛楣痰淖远刂�。
3.按权利要求2所述的微生化检测和分析仪，其特征在于，所述的光源模块(1)是由氘灯和溴钨灯双光源组成，光谱范围从180nm到900nm；两种光源之间设计制作了两个光学暗室，中间由可扳动的机械开关控制。
4.按权利要求2所述的微生化检测和分析仪，其特征在于，所述的单色仪�？�(2)是由入射狭缝、会聚凹面镜、平面反射镜、全息光栅和出射狭缝组成；光源(1)发出的光由入射狭缝进入单色仪，经过与入射光线成45度角的平面反射镜(15)反射后到达会聚凹面镜(18)，经过其会聚后投射到全息光栅(19)上，全息光栅(19)把入射光线色散，再经过另一组会聚凹面镜(18)和平面反射镜(15)会聚和反射后从出射狭缝(17)聚焦成单色光投射到芯片的检测泳道上。
5.按权利要求4所述的微生化检测和分析系统，其特征在于，全息光栅(19)是通过微齿轮传动细分机械结构调节水平方向上的角度，使光栅以竖直方向的轴为中心微调，单色仪设计成连续可调，通过调节光栅的角度使出射光精确到纳米量级。
6.按权利要求2所述的微生化检测和分析仪，其特征在于，所述的芯片及其电源�？�(3)由微通道芯片和高压�？樽槌桑⑼ǖ佬酒捎梦⒌缱蛹际跫庸な⒉Ａе谱鞫桑鞲哐沟缭茨？榭煽夭⑼ü鸬缂缪辜釉氐礁魅芤撼刂�。
7.按权利要求2所述的微生化检测和分析仪，其特征在于，所述的光路聚焦及信号采集�？�(4)由透镜和光电倍增管PMT组成，置于一个全封闭外壳中；透镜(21)采用石英玻璃制作，避免紫外区吸收；PMT将聚焦后的光信号放大并转换成模拟电信号，送至电路滤波和放大模块(5)。
8.按权利要求2所述的微生化检测和分析仪，其特征在于，所述的电路滤波和放大�？�(5)由两级放大和三级滤波电路组成，模拟信号处理主要是放大低频信号、抑止50Hz的工频干扰，由数字滤波器完成模拟信号的滤波处理，滤波器的设计采用10赫兹二阶以及一阶巴特沃斯低通滤波器。
9.按权利要求2所述的微生化检测和分析仪，其特征在于，所述的计算机信号处理及电源控制模块(6)由信号处理软件和继电器电路组成，实现对A/D转换后的检测信号进行存储、处理和显示；同时通过控制继电器的工作模式改变微通道电泳芯片各个溶液池中所加电极的电压，并按照一定次序通以或切断高压电，实现样品的进样与分离。
10.按权利要求2所述的微生化检测和分析仪，其特征在于，所述的用户工作界面�？�(7)全部用软件编程来实现，提供了一个人机交互的平台，通过它用户可以编辑实验所需参数；获取仪器的当前状态；电泳图谱的实时显示，进而控制整个分析流程。
全文摘要
本发明涉及微生化检测和分析方法及仪器，方法特征在于，采用紫外检测将待测样品加入微通道芯片中进行电泳，在电场的作用下，不同长度的片段将按不同的迁移率分开，通过单色仪光检测口，样品吸收特定波长的光产生吸收峰，再通过光路系统进行会聚和光电倍增管放大后，经光电转换�？樽涑傻缧藕牛扑慊藕糯砗螅纯扇范ù庋返闹掷嗪秃�。仪器是由光源�？椋ド悄？椋酒暗缭茨？椋饴肪劢辜靶藕挪杉？椋缏仿瞬ê头糯竽？椋扑慊藕糯砑暗缭纯刂颇？椋没Чぷ鹘缑婺？槠吒鲎幽？楣钩桑灰瞧饕孕酒捌涞缭茨？槲诵模迪盅返慕头掷搿Ｐ矶嗄延谟獗昙腔虮昙切实偷难芬材芗觳夂头治�。
文档编号G01N21/33GK1556392SQ20031012288
公开日2004年12月22日 申请日期2003年12月30日 优先权日2003年12月30日
发明者赵建龙, 徐良基, 金庆辉, 贾春平, 王聿佶, 韩志勇, 庄贵生, 刘菁 申请人:中国科学院上海微系统与信息技术研究所, 中国科学院上海微系统与信息技术研究
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