专利名称：同时分析烟用香原料山楂酊中三种低聚原花青素的方法
技术领域：
本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种同时分离分析烟用香原料山楂 酊中三种低聚原花青素(_)-Epicatechin, Procyanidins B2 和 Procyanidins Cl 的新方法。
背景技术：
山楂又名“红果”、“山里红”，蔷薇科，落叶乔木。果实味酸稍甜，富含维生素C、多种 有机酸和黄酮等。原花青素(procyanidins )属于缩合单宁，主要由儿茶素和表儿茶素聚 合而成的，广泛分布于植物界，也存在于一些水果和山楂中，与人类生活和健康密切相关。
山楂酊是用乙醇浸提成熟的山楂果实，加热连续循环回流萃�。厥杖芗梁蠡竦�。 对于山楂酊的化学成分(如山楂酊中的原花青素)，仍然存在着许多有待揭示的问题，其中 之一就是原花青素(_)-Epicatechin, Procyanidins B2 和 Procyanidins Cl 在山楂酊中 的含量测定。目前，有关烟用香原料山楂酊中原花青素的测定方法尚无统一标准，文献报道 的有正丁醇一盐酸法、香草醛一盐酸法、铁盐催化比色法及流动注射一抑制化学发光法等。 对于正丁醇一盐酸法、香草醛一盐酸法和铁盐催化比色法等分光光度法，由于存在其它高 聚原花青素的显色干扰，严重时可对分析结果产生较大的正误差；对于流动注射-抑制化 学发光法，由于其不具有分离能力，只能测定单个的低聚原花青素。高效液相色谱法具有良 好的精密度和准确度，在植物活性成分分析方面应用广泛，被许多国家政府列为药品、食品 等领域的规定检测手段。然而由于山楂酊中的低聚原花青素成分存在多种聚合方式和聚合 度，使其各成分的分离和测定要复杂得多。因此，对于烟用香原料山楂酊中三种低聚原花青 素(-)-Epicatechin, Procyanidins B2 和 Procyanidins Cl 的准确分析，需要建立一种分 离测定新方法来解决这一问题。
发明内容
本发明的目的正是针对以往分析山楂中低聚原花青素时存在的问题而提供的一 种解决方法，即以甲酸作为流动相添加剂，通过梯度洗脱，实现山楂酊中三种低聚原花青素 (-)-Epicatechin, Procyanidins B2 禾口 Procyanidins Cl 的同时分离测定。本发明的目的是通过以下具体技术方案来实现的
本发明的同时分析烟用香原料山楂酊中三种低聚原花青素的方法如下
(1)样品制备取山楂酊剂，用移液管准确移取山楂酊1.0mL，用甲醇稀释5倍后，经 0. 45 μ m有机相滤膜过滤后使用；
(2)制备好的样品用液相色谱-二极管阵列检测器分析，分析条件如下 色谱柱waters symmetry C18 柱(4. 6mmX250mmX5 μ m)
流动相A 甲醇含0. 5 mL/L甲酸，流动相B 30%乙腈含0. 5 mL/L甲酸 洗脱梯度 时间(min) 0 10 30 40 45 流动相 A (V/V) 100% 100% 60% 45% 100%进样体积=IOyL 流速0. 8mL/min 柱温30°C 检测波长280nm。 本方法与原有的山楂酊中三种低聚原花青素(-)-Epicatechin，Procyanidins B2和Procyanidins Cl的分析方法相比，实现了烟用香原料山楂酊中三种低聚原花青素 (-)-Epicatechin, Procyanidins B2 和 Procyanidins Cl 的同时测定；本方法通过采用 甲酸作为流动相添加剂，避免了色谱峰的托尾，缩短了样品的分析时间，并且实验的重复性 好、回收率高，适合卷烟企业大批量烟用样品的分析。
图1三种低聚原花青素标样色谱图。图中1, Procyanidins B2,2> (-) -Epicatechin, 3> Procyanidins Cl。图2山楂酊中三种低聚原花青素色谱图。图中1> Procyanidins B2, 2> (-) -Epicatechin, 3> Procyanidins Cl。
具体实施例方式下面通过实施实例对本发明进行进一步说明 实例1
精确称取一定量的 Procyanidins B2、(-)-Epicatechin 和 Procyanidins Cl 分别 置于不同的IOmL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，其浓度分别为0. 70mg/mL、 1.16mg/mL 禾口 2. 20mg/mLo液相色谱分析条件
色谱柱waters Symmetry C18 柱(4. 6mmX 250mmX 5 μ m) 流速0. 8mL/min 柱温30°C 检测波长280 nm 进样量10yL
流动相A 10%甲醇含0. 5 mL/L甲酸，流动相B 30%乙腈含0. 5 mL/L甲酸 洗脱梯度 时间(min) O 10 30 40 45
流动相 A (V/V) 100% 100% 60% 45% 100% 此色谱条件下，三者能够得到很好分离的色谱图如图1所示。1. Procyanidins B2, 2. (-) -Epicatechin, 3. Procyanidins Cl 实例2
取山楂酊样品lmL，用甲醇稀释5倍后经0. 45 μ m有机相滤膜过滤后，进样分析。液相色谱分析条件
色谱柱waters Symmetry C18 柱(4. 6mmX 250mmX 5 μ m)流速0. 8mL/min 柱温30°C 检测波长280 nm 进样量10yL 流动相A 10%甲醇含0. 5 mL/L甲酸，流动相B 30%乙腈含0. 5 mL/L甲酸 洗脱梯度 时间(min) 0 10 30 40 45
流动相 A (V/V) 100% 100% 60% 45% 100% 此色谱条件下，山楂酊样品的色谱图如图2所示。
1. Procyanidins B2, 2. (-) -Epicatechinj 3. Procyanidins Cl
对同一山楂酊样品进行平行5次测定，结果表明，方法的重现性和稳定性良好，山楂酊 中三种低聚原花青素 Procyanidins B2, (-) -Epicatechin,和 Procyanidins Cl 含量测 定值的RSD小于5%。方法加标回收率均在93. 3-98. 9%之间，说明本方法能够较为可靠地 测定山楂酊中三种低聚原花青素Procyanidins B2, (-)-Epicatechin, Procyanidins Cl。
权利要求
一种同时分析烟用香原料山楂酊中三种低聚原花青素的方法，其特征在于以甲酸作为流动相添加剂，通过梯度洗脱，实现山楂酊中三种低聚原花青素( ) Epicatechin, Procyanidins B2和Procyanidins C1的同时分离测定，具体步骤如下样品制备取山楂酊剂，用移液管准确移取山楂酊1.0 mL，用甲醇稀释后，经有机相滤膜过滤后使用；制备好的样品用液相色谱 二极管阵列检测器分析，分析条件如下色谱柱waters symmetry C18柱(4.6mm×250mm×5μm)流动相A10％甲醇含0.5 mL/L甲酸，流动相B30%乙腈含0.5 mL/L甲酸洗脱梯度时间(min) 0 10 30 40 45 流动相A(V/V) 100％ 100％ 60％ 45％ 100％进样体积10μL流速0.8mL/min柱温30℃检测波长280nm。
2.根据权利要求1所述的同时分析烟用香原料山楂酊中三种低聚原花青素的方法，其 特征在于山楂酊稀释5倍后经0. 45 μ m有机相滤膜过滤后使用。
全文摘要
一种同时分析烟用香原料山楂酊中三种低聚原花青素的方法，包括下述步骤1、将山楂酊样品用甲醇稀释、过滤；2、以甲酸为流动相添加剂，采用液相色谱-二极管阵列检测器分析，经梯度洗脱，实现烟用香原料中三种低聚原花青素(-)-Epicatechin,ProcyanidinsB2和ProcyanidinsC1的同时分离测定。本发明的方法与现有技术相比实现了烟用香原料山楂酊中三种低聚原花青素(-)-Epicatechin,ProcyanidinsB2和ProcyanidinsC1的同时测定；通过采用甲酸作为流动相添加剂，避免了色谱峰的托尾，缩短了样品的分析时间，并且实验的重复性好、回收率高，适合卷烟企业大批量烟用样品的分析。
文档编号G01N30/02GK101936966SQ20101028910
公开日2011年1月5日 申请日期2010年9月22日 优先权日2010年9月22日
发明者刘惠民, 刘绍锋, 张晓兵, 胡斌, 谢复炜, 郭军伟, 郭吉兆 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院
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