专利名称：磷酸单酯化合物分子量的求得方法及质谱测定用的添加剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含于生物体试样等中的磷酸单酯化合物分子量的求得方法及在该方法中使用的质谱测定用的添加剂。
背景技术：
某种生物体内的酶，在以活性中心为代表的特定部位上具有丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基，它们的羟基由被称为激酶的酶进行磷酸化(磷酸单酯化)或脱磷酸化来调节其酶活性。也有的酶是通过赖氨酸、精氨酸、组氨酸的氮及天冬氨酸、谷氨酸的羧基被磷酸化(或脱磷酸化)来调节其酶活性。
作为上述藉由磷酸化—脱磷酸化调节的代谢系统，熟知的是糖原合成的抑制及其分解系统。该代谢系统主要由磷酸化—脱磷酸化进行级联控制及调节。
近年来，明显的是，上述磷酸化—脱磷酸化在有关疾病的代谢系统中具有重要的作用。
例如，对于细胞的癌变，磷酸化—脱磷酸化的异常被认为是一个原因。即，细胞周期的进行及停止由各种各样的酶(蛋白质)的磷酸化(或脱磷酸化)控制，上述磷酸化与周期素及依赖周期素的激酶(CDK)有关。但如果上述功能受到损伤，则磷酸化(或脱磷酸化)发生紊乱，其结果引发细胞的增殖异常。
其他，明显的是，蛋白激酶C与作为特应性皮炎(atopic dermatitis)及花粉症(pollenallergy)等过敏性疾病原因的组胺的脱颗粒(degranulation)有关，及发生于阿耳茨海默病患者的脑中的神经原纤维变化(neurofibrillary tangle)也源于磷酸化的T型蛋白质(tau protein)。
因此，若能把握生物体试样中的哪一种酶(蛋白质)被磷酸化(或脱磷酸化)，则不仅有利于对生物体组织细胞的基因的发现的探索及酶活性的评价，也可能有利于疾病的诊断、治疗。
可是，以往使用的磷酸化蛋白质(或脱磷酸化蛋白质)的检测方法存在各种缺陷。
例如，酶免疫法虽然具有即使作为对象的蛋白质试样微量也可进行分析的优点，但要获得足够量的必要的抗体却有困难，另外，对象蛋白质在几个kDa以下时，无法配制结合于蛋白质中的磷酸化部位的抗体。
又，有人考虑藉由由放射性同位素32P所标记的磷酸的使用，来检测对蛋白质的特异结合的方法，但使用该方法理所当然地必须注意放射性同位素的处理，对其废液的管理、处理等也有要求。
再有，磷酸化蛋白质和脱磷酸化蛋白质的电荷不同，因此，也有人考虑应用二维电泳法。然而，在对生物体试样进行分析的场合，试样中含有多种类的蛋白质，由此，也使得斑点的鉴定非常困难。而且，为了斑点的鉴定而使用放射性同位素，则会发生如上所述的问题。
另外，下列非专利文献1(Yashiro Morio等二人，”Preparation and Study of DinuclearZinc(II)complex for the Efficient Hydrolysis of the Phosphodiester Linkage in aDiribonucleotide″，《Journal ofthe chemical Socicty，Chemical communications》，P.1793-1794(1995年))中记载了锌的配位化合物。该锌配位化合物中的两个锌离子具有作用于二核苷酸中的磷酸根，并切断该酸根的功能。然而，非专利文献1中的该配位化合物的功能主要是用作催化剂的，有关与磷酸根的配位结合能，未作任何记载。实际上，根据本发明人的实验，该配位化合物和两个核苷之间的磷酸根(磷酸二酯基)的离解常数非常大。即，该配位化合物对磷酸二酯基的配位结合能很低。
另外，下列非专利文献2(Hidekazu Arii等六人，”A novel diiron coplex as a functionalModel for hemerythrin″，《Journal of Inorganic Biochemistry》，第82卷，P.153-162(2000年))中也记载了具有类似于上述锌配位化合物结构的铁的配位化合物。但是，所述铁的配位化合物是作为氧分子的传输蛋白质的蚯蚓血红蛋白(hemerythrin)的模型合成的。有关该铁配位化合物与磷酸单酯基的配位结合能未作任何记载，也未作任何启示，这一点如同上述非专利文献1。
本发明者们已经开发了一种鉴定具有磷酸单酯基的肽等的方法。在该技术中，利用与磷酸单酯基等的阴离子取代基特有地配位结合的配位化合物，例如对使该配位化合物作用的试样和未使该配位化合物作用的试样进行质谱比较，能够得到与磷酸单酯基结合的化合物的信息。也就是说，因为与该配位化合物结合的化合物和未与该配位化合物结合的化合物，应该只在配位化合物部分的分子离子峰的值不同，所以能够知道含有磷酸单酯基的化合物的分子量。
可是，单一试样(精制的试样)暂且不说，在含有多个化合物的混合试样的分析中，即使放大记录，也不能鉴定到目的分子离子峰。也就是，在质谱中，因为构成化合物的原子的同位体分布使离子峰的表现方式不同，所以，在与该配位化合物结合的化合物和未与该配位化合物结合的化合物之间，分子离子峰的表现方式不同，峰的鉴定困难。
发明内容
在上述状况之下，本发明所要解决的课题在于提供一种磷酸单酯化的化合物(蛋白质和糖类等)的分子量的容易的鉴定方法，根据该方法，即使是含有多个化合物的生物体试样，也能容易地从中鉴定磷酸单酯化的化合物(蛋白质和糖类等)的分子量。
并且，根据本发明，其课题也在于提供一种能使用于上述方法中的质谱测定用的添加剂。
为了解决所述课题，本发明者们对于已完成开发、显示了相对磷酸单酯基高的结合能的金属配位化合物进行进一步刻意研究，发现使配位有单一的锌同位体的配位化合物作用于受检试样，取得多个质谱测定结果，对这些进行比较的话，能够容易地鉴定磷酸单酯化合物的分子量，由此完成了本发明。
也就是，本发明有关的磷酸单酯化合物的分子量的求得方法，其特征在于，所述方法包括(1)将含有由单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物和受检试样在溶剂中混合，配成溶液后，对所述溶液进行质谱测定的工序； 式中，R1～R4表示氢原子或取代基，(2)将含有由与上述同位体不同的单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物和受检试样在溶剂中混合，配成溶液后，对所述溶液进行质谱测定的工序；(3)通过对上述质谱测定结果进行比较，求得磷酸单酯化合物的分子量的工序。
在上述方法中，在受检试样含有磷酸单酯化合物的情况下，在两个质谱中存在出现在不同位置上的分子离子峰。将其两个分子离子峰进行比较，作为化合物(1)，除锌同位体之外基本骨架相同的场合，只在使用的两个锌同位体的分子量差为2倍的值(在对于1个分子的磷酸单酯化合物存在多个磷酸单酯基的场合，该值为再乘上该多个磷酸单酯基数的值)的部分位置错移，且两峰具有大致相同的形状，由此，能够容易地鉴定磷酸单酯化的化合物的分子离子峰，且能求出分子量。
作为上述配位化合物(1)，理想的是，R1～R4全都是氢原子。因为在化合物(1)中结构最简单而容易制造，并且分子离子峰更简单化。
又，本发明的质谱测定用的添加剂，用于求出磷酸单酯化合物的分子量，其特征在于，所述质谱测定用的添加剂含有一种试剂，含有由单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物；以及另一种试剂，含有由与所述同位体不同的单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物。
式中，R1～R4表示氢原子或取代基。
作为所述配位化合物，适合的是，R1～R4全都是氢原子。这还是因为，其结构最简单，容易制造。
作为上述配位化合物，理想的是，化合物(1)与乙酸离子进一步形成配位化合物。因为其比未与乙酸离子配位的化合物稳定而易于保存，还因为若加入受检试样和该配位化合物，磷酸单酯基能够与乙酸离子进行交换配位，与未与乙酸离子配位的化合物相同，能够检测磷酸单酯化合物。
作为所述试剂，理想的是呈盐的状态。因为在保存稳定性方面优良。又，合适的是溶液状态。因为通过将其添加在试样溶液中或将试样添加在添加剂溶液中，这样就能够直接作成质谱测定用的试样。
图1是本发明的配位化合物的1H NMR测定结果；图2是本发明的配位化合物的IR测定结果；图3是受检试样和天然同位体锌配位化合物的复合体的质谱，由于多个锌同位体的存在，峰变得复杂化；图4是受检试样和64Zn锌配位化合物的复合体的质谱，因其所含的锌是单一的同位体，所以与天然同位体锌配位化合物相比，峰更简单化；图5是受检试样和68Zn锌配位化合物的复合体的质谱，与图4相同，比起使用天然同位体锌配位化合物的场合，峰更简单化；图6是受检试样和64Zn锌配位化合物的复合体的质谱；图7是受检试样和68Zn锌配位化合物的复合体的质谱，通过与图6的比较，能够求出磷酸单酯化合物的分子量。
具体实施例方式
本发明拥有的一个最大特征是，使用含有分子量分别不同的锌同位体的二个配位化合物，通过比较分别与不同的配位化合物配位的试样的质谱，能够容易地确认含于受检试样中的磷酸单酯化合物的存在，且能够求出其分子量。
即，以往，虽然大家知道各种能与磷酸根结合的金属配位化合物，但是并没有完全认识到本发明的配位化合物具有与磷酸单酯基的强的结合能。还有，本发明者们已经开发了一种使用本发明的配位化合物作为质谱测定用的添加剂(质量分析用添加剂)的发明，但本发明是对该发明进行的改良，能更容易地进行磷酸单酯化合物的确认和其分子量的鉴定。
以下，对发挥所述特征的本发明的实施形态以及其效果进行说明。
根据本发明的方法，首先，进行(1)将含有由单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物和受检试样在溶剂中混合，配成溶液后，对所述溶液进行质谱测定的工序；
式中，R1～R4表示氢原子或取代基。
首先，对“含有由单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物”进行说明。
在“用式(I)表示的化合物”中，R1～R4定义中的“取代基”只要是不阻碍化合物(1)向磷酸单酯基的配位既可，并无特别限定。例如，举例有直链或支链状的C1-6烷基、氨基、羟基、氨基甲酰基、直链或支链状的C1-6烷氧基、卤素原子、硝基、磺酸基、羧基、甲酰基、酰基、氰基、酰甲基、羟甲基等。
作为R1～R4，理想的是氢原子。因为廉价且很容易合成，并且得到的分子离子峰更简单。还有，作为R1～R4，吡啶环上的4位或6位的给电子性取代基也合适。因为，由于在适宜的取代位置导入给电子性取代基，则使吡啶氮的电性变强，对锌的配位性优良，结果使得制造容易且具有稳定性。
R1～R4可以相同，也可以互不相同，理想的是相同的。这主要是由于合成容易。
在所述式(I)中，选择锌作为配位金属的理由是，其对磷酸单酯基的配位能极高。“含有用式(I)表示的化合物的配位化合物”的意思指，配位化合物的主要部分是用式(I)表示的化合物。例如，为了使用式(I)表示的化合物更稳定化，也可以如下图所示的使乙酸离子等配位。因为，用式(I)表示的化合物对磷酸单酯基具有极高的配位能，即使配位有其它化合物，如果在溶液中存在具有磷酸单酯基的化合物，就能快速地进行交换，可以形成配位化合物和磷酸单酯化合物的复合体。
作为天然存在的锌的同位体，有其分子量为64、66、67、68、70。在工序(1)中，使用由从中选择的单一的同位体构成的配位化合物。
在工序(1)中，将该配位化合物和受检试样在溶剂中混合配成溶液。于是，因式(I)表示的化合物对磷酸单酯基的配位结合能极高，所以快速地与受检试样中的磷酸单酯化合物配位形成复合体。因此，该混合溶液无需加热或为了要形成复合体而花费时间，当然，在无损本发明目的的范围内也可以进行加热等。
还有，为了“将配位化合物和试样在溶剂中混合”，也可以向溶液中加入配位化合物和受检试样，也可以向配位化合物溶液加入受检试样或其溶液，或向受检试样溶液加入配位化合物或其溶液。
作为在这里使用的溶剂，只要是在能发挥本发明效果的范围内，能够溶解本发明的配位化合物和受检试样的话，就不作特别地限定。例如，可以举例有水(含有缓冲溶液和其他盐溶液)；甲醇、乙醇等醇类；乙氰；二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等的胺类；以及这些的混合溶液。理想的是水或水和水溶性有机溶剂的混合溶液(水系溶剂)。因其具有优异的溶解本发明的配位化合物和生物体试样等的性能。
在工序(1)中，虽要“将配位化合物和试样在溶剂中混合配成溶液”，但无需将配位化合物和受检试样完全溶解，只要在能够使受检试样所含的磷酸单酯化合物与配位化合物配位的范围内溶解即可。即无需完全“溶解”，也可残留部分的不溶成份。
其次，对含有本发明的配位化合物和磷酸单酯化合物的复合体的该溶液(混合液)进行质谱测定。质谱的测定方法，只要是使用以检测为目的、适用于化合物的方法既可，但在本发明中，因主要以求出生物体试样中所含的高分子的分子量为目的，所以理想的是采用MALDI TOF-MAS(基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法)。因为该方法也能测定蛋白质这样的巨大分子的质量。
本发明主要以鉴定磷酸单酯化肽的分子量为目的，但受检试样不限于此，例如，本发明也能够应用于磷酸化蛋白质和糖类的复合体以及磷酸化的糖类等。
其次，通过与所述工序(1)同样的手法进行工序(2)。尤其理想的是，化合物(1)，在工序(1)和工序(2)中使用的是相同种化合物。因为，用来比较的分子离子峰的形状大致相同，则分子离子峰的鉴定变得更容易。只是，必须使用由与在所述工序(1)中使用的单一的锌同位体不同的锌同位体构成的配位化合物。因为在工序(1)和(2)中使用相同种锌同位体不能发挥本发明的效果。
又，所述工序(1)和(2)也可同时进行。即，将含有由分子量相互不同的锌同位体构成的2种化合物(1)的质谱用添加剂添加到受检试样中，进行质谱测定这样的形态也包含在本发明范围内。只是，因为在含有较多化合物的受检试样的场合，对磷酸单酯化合物和化合物(1)的配位化合物的分子离子峰进行鉴定变得困难，所以理想的是在工序(1)之后实施工序(2)。
接着，作为工序(3)，通过将工序(1)和(2)得到的质谱测定结果进行比较，求出磷酸单酯化合物的分子量。
首先，比较两质谱的测定结果，找到不同的峰。在这里，由不同的锌同位体构成的式(I)的化合物或配位化合物的分子离子峰当然不同，但在受检试样中含有磷酸单酯化合物的场合，因为式(I)的化合物与磷酸单酯化合物大致定量地配位形成复合体，所以该复合体的分子离子峰的值也仅在有赖于锌同位体的分子量差而形成的部分不同。
由上述工序(1)和(2)所得到的质谱的结果，容易鉴定该复合体的分子离子峰。其原因是，两分子离子峰大致呈现为相同的形状，放大两峰进行比较的话，容易判断两者是否为由相同的磷酸单酯化合物引起的分子离子峰。又，两峰的分子量差，若使用所述工序(1)和(2)中的相同的化合物(I)的话，等于在锌同位体分子量差的2倍值上再乘整数倍，由此，也可使两分子离子峰的测定变得容易。这是因为在本发明所使用的配位化合物中配位有2个锌原子，又因为，本发明的配位化合物大致定量地与受检化合物中存在的磷酸单酯基配位，所以在某种程度上能预测两分子量差。
例如，作为化合物(I)使用相同的化合物，作为锌同位体使用64Zn和68Zn，则在工序(1)和(2)中所得的磷酸化肽等与配位化合物的复合体的分子量的差为8的整数倍(8乘以1分子化合物中存在的磷酸单酯基的个数的数)。又，通过测定的分子量差，也能知道1分子磷酸单酯化合物中存在的磷酸单酯基的数目。
还有，因为在本发明中使用单一的锌同位体，所以能抑制由多个锌同位体引起的分子离子峰复杂化，分子离子峰的“裂纹”仅限于由碳同位体引起，这也是分子离子峰的鉴定变得容易的理由之一。
接着，从鉴定的分子离子峰读取分子量，减去化合物(I)的分子量，能够鉴定磷酸单酯化合物的分子量。例如，作为化合物(I)使用如下所示的化合物(R1～R4都是氢原子，锌同位体为64Zn的化合物)时，在磷酸单酯化合物中结合的磷酸单酯基的数目为1的话，从复合体的分子离子峰的值中减去579，由此可求出磷酸单酯化合物的分子量。在这里，之所以不减去下述化合物(I)的分子量581，是因为，考虑到磷酸单酯化合物与化合物(I)配位时，从磷酸单酯基上脱去2个氢阳离子，所以需要补足其分子量。
C27H29N6O64Zn23+精确的质量581.10摩尔重量581.42本发明的质谱测定用的添加剂，是用于求出磷酸单酯化合物的分子量的添加剂，包括含有由单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物的试剂；以及含有由与所述同位体不同的单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物的试剂。
在这里，“由单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物”和“含有由与所述同位体不同的单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物”，与前述化合物具有同样的意义。
“含有配位化合物的试剂”的意思是，该试剂也可以取配位化合物的盐及溶剂合物(水合物等)的形态。在这里，作为盐的构成成分的抗衡离子，只要不妨碍本发明的效果就不作特别地限定。理想的是，以结晶态获得的含有配位化合物的试剂及可提高配位化合物的稳定性的试剂。例如，合适的是高氯酸根(ClO4-)。还有，也考虑通过特定的水合物的状态，提高对于潮湿的稳定性。
还有，本发明的质谱测定用的添加剂，也可以是溶液状态。因为，如果是溶液，可以直接加入到受检试样溶液中，或可以在溶液中加入受检试样或受检试样溶液，所以很便利。该溶液所使用的溶剂，可以使用与混合配位化合物和试样用的所述溶剂相同的。又，也可以加入提高配位化合物的稳定性的添加剂。
“包含”试剂的意思是一种组合物中可以包含二种试剂。然而，如上所述，由于本发明的工序(1)和(2)可以同时进行，但理想的是按顺序进行，所以本发明的质谱测定的添加剂理想的是分别含有各自试剂的试剂盒。
用所述式(I)表示的化合物，通过方案1能够更容易地制造。
方案1 式中，R1～R4表示氢原子或取代基。
在所述方案1中，通过使化合物(II)与单一的锌同位体化合物反应，合成式(I)的化合物。作为原料化合物的化合物(II)通过后述的方案2能够合成，作为单一的锌同位体化合物，使用金属锌或氧化锌、锌盐等。还有，化合物(II)也可以是盐。
在所述方案1中，通过在调整为中性的水系溶剂中加热，容易使锌配位在化合物(II)上。只是，因为需要充分地溶解锌化合物，所以较好的是，通过事先用超声波处理暂且溶解在盐酸里使粒子微粒化。还有，在这里，“中性”的意思并不严格，“大致中性”既可，理想的是pH调整为6.8以上。
在方案1中所使用的水系溶剂，能够溶解化合物(II)和锌化合物的既可，不作特别的限定，除纯水、蒸馏水、自来水、缓冲液之外，也可以在其中加入醇类、酰胺类、乙氰等。
作为加热温度，理想的是30～90℃，合适的是50～90℃。反应时间可以是10分～数小时。反应后，过滤除去过剩的试剂后，滤别缓慢冷却而析出的结晶，通过使用通常的再结晶法得到目的物。又，也可以通过配位乙酸离子等使配位化合物更加稳定化。
用式(II)表示的化合物，通过方案2能够制造。
方案2 (式中，R1～R4表示氢原子或取代基。)方案2是向作为原料化合物的化合物(III)(1，3-二氨基-2-丙醇)中依次导入具有R1～R4的2-吡啶甲基的反应路线。方案2所使用的化合物(III)可以使用市售的。又，化合物(IV)及其它的2-甲酰基吡啶化合物具有比较简单的结构，可以使用市售的或用技术人员知道的方法进行合成。还有，在取代基(R1～R4)为反应性基团的场合，可以用一般的保护基保护该取代基，该取代基可适宜地除去。
在方案2中，首先，化合物(III)和(IV)进行缩合反应，得到化合物(V)，依次导入2-吡啶甲基而合成化合物(II)。只是，在R1～R4为相同基团的场合，通过一次使用4当量以上的2-甲酰基吡啶化合物(IV)，进行一阶段(一步)反应也能得到化合物(II)。
在方案2中，作为缩合反应进行还原性氨基化反应。该场合所使用的溶剂只要能实质上溶解化合物(III)和化合物(IV)等的2-甲酰基吡啶化合物、不阻碍反应的既可，不进行特别地限定。例如，可以使用甲醇、乙醇、异丙醇等的醇类；(二)乙醚、四氢呋喃、二噁烷等的醚类；水；或它们的混合溶剂。
在还原性氨基化反应中，首先，将化合物(III)和2-甲酰基吡啶化合物缩合后，用一般的还原试剂还原，在缩合时作为催化剂也可以添加盐酸等。还有，作为化合物(III)也可以使用其盐酸盐。
反应温度和反应时间可以根据原料化合物的种类等采用合适的条件，例如，在20～80℃下反应12～100小时。
反应结束后，减压馏去溶剂等后，加入水，用非水溶性溶剂萃�。匏蛩崦镜雀稍镉拖嗪螅跹沽笕ト芗�。接着，用硅胶柱色谱法等公知方法精制残渣后，依次进行吡啶甲基的导入反应，由此能够得到化合物(II)。
又，得到化合物(II)的方法不限于方案2表示的方法，例如，也可以由化合物(III)和卤素化合物合成化合物(II)。又，R1～R4全都是氢原子的化合物(II)的合成方法记载于公知文献(M.Suzuki等，Bull.Chem.Soc.Jpn.，Vol.63，pp1115-1120(1990))，作为R1～R4都被导入6位(2位)的甲基的化合物(II)的合成方法也被记载于公知文献(Y.Hayashi等，J.Am.Chem.Soc.，Vol.117，pp11220-11229(1995))中。
以下，显示制造例以及实验例，对本发明进行更详细的说明，但本发明的范围不限于这些。
实施例制造例1-1本发明的锌配位化合物(盐) 在65ml水中加入902mg(1毫摩尔)的N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-羟基丙烷(以下，称作“TPAHP”)的四高氯酸盐的2.5水合物和160mg(2毫摩尔)的64ZnO，在50℃作超声波处理，使ZnO分散溶解。在该溶液中加入1.0ml的1.0M的氢氧化钠水溶液，在80℃水浴中加热30分钟后过滤，一边在80℃的水浴中加热一边搅拌，滴入2.0ml的1.0M醋酸钠水溶液。在室温缓慢冷却反应液后，用玻璃过滤器滤取析出的无色结晶，在50℃、大约10mmHg下，干燥3小时，由此得到760mg(89％)目的物。对该目的物进行1HNMR(1H核磁共振谱)测定和IR(红外吸收光谱)测定。结果分别如图1、2所示。
制造例1-2本发明的锌配位化合物(盐) 在10ml水中加入658mg(0.73毫摩尔)TPAHP的四高氯酸盐的2.5水合物和100mg(1.47毫摩尔)68Zn，在50℃作超声波处理，使68Zn分散溶解。对于68Zn，事先将其溶解在5ml浓盐酸后，减压馏去水，再进行甲醇共沸的减压干燥的前处理。在该溶液中加入36.5ml的0.1M的氢氧化钠水溶液，在80℃水浴中加热30分钟后过滤，一边在80℃的水浴中加热一边搅拌，滴入醋酸钠水溶液(160mg醋酸钠溶解于5ml的蒸馏水中)。在室温缓慢冷却反应液后，用玻璃过滤器滤取析出的无色结晶，在50℃、大约10mmHg下，干燥3小时，得到440mg(70％)目的物。
制造例1-3由天然同位体锌构成的锌配位化合物(盐)在TPAHP(4.39毫摩尔)的乙醇溶液(100ml)中加入10M氢氧化钠水溶液(1.0ep)，接着加入醋酸锌(9.66毫摩尔、2.2eq)。减压馏去溶剂，得到褐色油状残渣。往该残渣中加入10ml水，溶解，一边加热一边滴入1.0M高氯酸钠水溶液(3.0eq)，析出乳白色的结晶。滤取结晶，加热干燥，得到微黄褐色的粉末状目的物2.99g(79％)。目的物是通过1H-NMR(400MHz)、13C-NMR(13C核磁共振谱)(100MHz)和IR分析确认。
1H-NMR(DMSO-D6、400MHz)δ2.04(2H，dd，J＝12.1和12.4Hz，HC-1，3)，2.53(3H，s，HC-35)，3.06(2H，dd，J＝12.1和12.3Hz，HC-1，3)，3.74(1H，t，J＝10.4Hz，HC-2)，4.02-4.34(82H，m，HC-5，13，20，27)，7.54-7.65(8H，m，HC-10，11，18，19，25，26，32，33)，8.06-8.12(4H，m，HC-9，17，24，31)，8.58(4H，dd，J＝16.3和16.5Hz，HC-8，16，23，30)13C-NMR(DMSO-D6，100MHz)δ58.0，60.1，62.0，64.6，122.7，124.3，124.4，139.9，140.4，147.0，147.2，154.7，155.1IR(cm-1)υas(COO)1556，υ3(ClO4)1090试验例1分别将在上述制造例1-1～1-3制造的锌配位化合物(以64Zn、68Zn以及天然同位体Zn为构成成分)溶解在蒸馏水，作成1mM水溶液。作为受检试样，使用P60c-src肽521-533磷酸型的1mM水溶液。还有，该磷酸化肽的结构如以下所述。
在各个5μL的1mM锌配位化合物水溶液中加入10μL受检试样、30μL缓冲液以及5μL蒸馏水，作成总量为50μL，将此用作测定用试样对其进行质谱测定(MALDITOF-MAS)。将0.5μL该测定用试样涂敷在采样板上，作为基质快速地在其上加上0.5μL，注意涂敷端不要与采样板接触地轻轻地吸移。然后，等到溶剂风干(约5分钟)，进行测定。还有，质谱测定的条件如下所述。
MALDI TOF-MASautoflex(BRUCKER DALTONICS社)；基质40mg/mlTHAP(2，4，6-三羟基苯乙酮)(在乙氰中)；缓冲液(试样溶解用)10mM Tris-borate buffer(pH＝8.0)。
将与天然同位体锌配位化合物的复合体的结果表示于图3，64Zn锌同位体表示于图4，68Zn锌同位体表示于图5。
根据该结果，含有64Zn锌的复合体的分子离子峰为2122，含有68Zn锌的复合体的分子离子峰为2130。因而，受检试样是被磷酸单酯化的，结合的磷酸根是一个。还有，从含有64Zn锌的复合体的分子量减去配位化合物的分子量(581)等于1541。该值与所述结构式所示的值不同，我们考虑这是因为，如下述结构式所示，由配位化合物对肽中的离子化(氢阳离子)的磷酸单酯基配位所引起的。也就是说，加上脱离的2个氢阳离子的分子量，为1543，该分子量与数据一致。
又，含有天然同位体锌的复合体的分子离子峰，因多个的锌同位体而复杂化，通过使用单一的同位体的场合更简单化，且其峰的表现方式大致为相同形状。因而，根据本发明的方法，证实即使是生物体试样等的混合试样，也能容易地鉴定单磷酸酯化合物的分子离子峰。
实验例2使用所述制造例1-1，1-2制造的锌配位化合物(以64Zn以及68Zn为构成成分)，用与所述实验例1同样的方法进行质谱测定。只是，作为受检试样，使用如下述结构所示的P60c-src肽基质(Substrate)II磷酸化型，作为测定机器使用Voyager RP型(PE Biosystem社) C33H45N6O12P精确的质量748.28摩尔重量748.7264Zn锌配位化合物的质谱结果表示于图6中，68Zn锌配位化合物的质谱结果表示于图7中。
由该结果可以明白与实施例1相同，使用本发明方法，受检试样被单磷酸化，结合的磷酸根是1个。又，两分子离子峰大致为相同形状，明显地，即使是在混合试样中也能容易地坚定磷酸单酯化合物的分子量。又，从含有64Zn锌的复合体的分子量减去配位化合物的分子量(581)等于747。该值与所述结构式所示的值不同，但如同上述实验例1的结果，可认为是磷酸单酯基离子化的结果。加上脱离的氢阳离子的部分为749。
根据本发明的方法，即使是含有多个化合物的生物体试样等，也能从中确认磷酸单酯化合物(磷酸化肽等)的存在，且能够容易地鉴定其分子量。因此，通过对生物体试样等合适地使用本发明方法，可应用于疾病的诊断。本发明在这一点上非常有用。
又，本发明的质谱测定用的添加剂，作为能够在上述方法中使用的添加剂，在产业上非常有用。
权利要求
1.一种磷酸单酯化合物分子量的求得方法，其特征在于，所述方法包括(1)将含有由单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物和受检试样在溶剂中混合，配成溶液后，对所述溶液进行质谱测定的工序； 式中，R1～R4表示氢原子或取代基，(2)将含有由与所述同位体不同的单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物和受检试样在溶剂中混合，配成溶液后，对所述溶液进行质谱测定的工序；(3)通过对所述质谱测定结果进行比较，求得磷酸单酯化合物的分子量的工序。
2.如权利要求1所述的磷酸单酯化合物分子量的求得方法，其特征在于，作为所述配位化合物使用的是R1～R4全部是氢原子的配位化合物。
3.一种质谱测定用的添加剂，用于求出磷酸单酯化合物的分子量，其特征在于，所述质谱测定用的添加剂含有一种试剂，所述试剂含有由单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物；以及另一种试剂，所述另一种试剂含有由与所述同位体不同的单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物， 式中，R1～R4表示氢原子或取代基。
4.如权利要求3所述的质谱测定用的添加剂，其特征在于，作为配位化合物，其R1～R4全部是氢原子。
5.如权利要求3或4所述的质谱测定用的添加剂，其特征在于，所述配位化合物是由式(I)表示的化合物和乙酸离子进一步配位形成。
6.如权利要求3～5中的任一项所述的质谱测定用的添加剂，其特征在于，所述试剂为盐的状态。
7.如权利要求3～5中的任一项所述的质谱测定用的添加剂，其特征在于，所述试剂为溶液的状态。
全文摘要
本发明提供一种用于分子量鉴定的方法及在该方法中使用的质谱测定用的添加剂，上述方法即使是对于含有多个化合物的生物体试样等，也能从中确认磷酸单酯化合物(磷酸化肽等)的存在，且能够容易地鉴定其分子量。本发明的方法，系使用一种具有对于磷酸单酯基非常高的配位能的、且由单一的锌同位体构成的配位化合物，取得多个质谱数据，然后对这些质谱进行比较的方法。
文档编号G01N27/62GK1756954SQ200380110118
公开日2006年4月5日 申请日期2003年12月24日 优先权日2003年3月7日
发明者小池透, 南则雄, 川崎昭彦 申请人:株式会社纳德研究所
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