专利名称：看麦娘对拿捕净产生抗药性的鉴定方法
技术领域：
本发明看麦娘对拿捕净产生抗药性的鉴定方法，属于杂草植物对除草剂的抗药性测定方法，专用于看麦娘对拿捕净产生抗药性的监测。
二、技术背景拿捕净属于环己烯酮类除草剂(Cyclohexanedione，CHD)，其作用靶标酶为乙酰辅酶A羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylase，)。
CHD类除草剂同以乙酰乳酸合成酶(ALS)为作用靶标酶的磺酰鹩脲类除草剂一样，由于作用靶标单一，连续使用易造成杂草的抗药性。在玉米细胞培养中，拿捕净或盖草能存在的情况下，已筛选出几种抗药性品系。在敏感性品系中，与未筛选品系比，拿捕净或盖草能对ACCase活性的抑制能力明显下降(Wyse等1992)。据Cotterman.(1992)报道，禾草灵在澳大利亚的南澳洲连续使用4年后，瑞士黑麦草对其产生了抗药性，这种抗药性生物种很快遍布整个澳大利亚的小麦产区，并且对其他ACCase类抑制剂存在交互抗性。黑麦草在连续使用骠马6年后，就会产生抗性，同时，约95％的该黑麦草居群对吡羧嘧黄隆产生交互抗性(Letouze A.等，2001)。在美国小麦田连续使用4-5年，黑麦草、多花黑麦草等产生抗性生物型。根据Gressel(1996)按作用靶标、持效期、选择压、使用历史等分成的3个风险级中，ACCase抑制剂类除草剂属于抗性风险分级的高风险级别(马晓渊，2002)，一般连续使用该类除草剂6-10年，就会产生抗性(Devine Malcolm D，1997)。由于ACCase抑制剂类除草剂的抗性基因位点发生多于1个功能突变码，故其抗性发展速度很快，而且极易发生交互抗性和多抗性，一旦杂草产生抗药性，治理难度将高于ALS抑制剂类除草剂。
虽然在我国抗ACCase抑制剂类除草剂的杂草至今尚未有报道，随着该类除草剂在油菜田，小麦田，大豆田的广泛而连续的使用，野燕麦、硬草、罔草，看麦娘，牛筋草等对ACCase抑制剂类除草剂能否产生抗性必须引起高度警惕，否则必将严重影响作物的产量(李宜蔚，1999)。为了防止耐药性杂草的发生和蔓延，必须对田间杂草进行监测，及选取恰当合理的方法对抗性杂草进行鉴定。开展抗药性杂草种群的监测工作，研究防除抗药性杂草的方法，及早鉴定、控制、消灭抗性杂草，将抗ACCase抑制剂类除草剂控制在初发阶段，具有重要意义。由于除草剂的一些弊病仍存在，须将这一措施综合进杂草治理体系。
目前，对ACCase抑制剂类除草剂产生抗性的鉴定方法主要有整株植物测定法、幼苗实验法、花粉粒的检测、酶联免疫测定(ELISA)法、PCR检测法等。其中使用最广的是整株植物测定法，一直是鉴定和选择抗药性杂草生物型的有效方法。该方法在于实验技术简单易行，还可进行大批量的植株实验工作，适用于绝大多数除草剂抗药性生物型的鉴定。但是这种方法的缺陷是难以保证除草剂和植物之间具有同样药剂的可利用性(唐正辉等，1991)，另外耗时长达约50天，工作量大，占温室空间大。因此有必要选择一种快速、简单、可靠的方法来鉴定抗药性的发生。
发明内容
技术问题本发明的目的在于克服现有技术中整株植物测定抗药性方法的一些弊端，提供一种看麦娘对拿捕净产生抗药性的鉴定方法，用该方法鉴定看麦娘对拿捕净产生抗性速度快，成本低，操作简单，不占空间，适应大面积种子鉴定的需要。
技术方案 实现本发明所提供的看麦娘对拿捕净产生抗性的室内鉴定法的步骤如下1)破除看麦娘休眠将看麦娘种子于4℃条件下800-1000ppm浓度的GA3或0.2％(m/v)KNO3为浸种液浸种5天；2)抗拿捕净适宜浓度的筛选将浸种后的种子播在直径为9cm，铺有滤纸的塑料培养皿中，加入浓度梯度为0，0.0625，0.125，0.25，0.5，1，2，4，8mg/L的除草剂7mL，4次重复，放入18℃培养箱中暗培养，每两天加入1ml蒸馏水；3)抗药性鉴定六天后测量幼苗的苗长或根长、胚芽鞘的长度，用SAS或SPSS统计软件非线形回归得出抑制中浓度GR50，根据非线形回归方程得出抗性比R/S即抗性居群抑制中浓度RGR50/敏感性居群抑制中浓度SGR50；4)抗药性判断抗性比R/S＞10为高抗，3＜R/S＜10为中抗，R/S＜3为敏感。
有益效果 本方法所提供的室内种子对拿捕净产生抗性方法除了鉴定结果准确外，还具有如下优点1)方法简便，结果可靠。一般工作人员即可操作；种子鉴定与整株测定及生理指标的反映一致。
2)速度快，检测居群样品多，占空间�。慌分恍�10天即可拿出抗性鉴定结果。
3)成本低廉，不需购置特殊仪器设备，只需一个培养箱，不需光照。每处理浸种4天，6天18℃暗培养幼苗，一次可测定所有提供的样品。比整株测定法大大节约人力、物力。
4)季节、温度、光照的限制，适合于大面积看麦娘对拿捕净产生抗性的鉴定，及时监控抗性杂草产生，为田间管理提供有效依据。
由于刚采收的看麦娘存在1-3月的休眠期，而且普遍存在发芽不齐，时间长，所以有必要首先研究快速破除休眠或者使对已解除休眠的种子发芽一致。实验结果表明打破休眠不仅与处理物质有关也与处理时间有很大的关系。
在看麦娘对拿捕净产生抗性的鉴定方法确定后，又进行了整株测定，，表1，图3，图4，图5说明种子鉴定出的JXRI，JXRII表现为高抗，HFRI，HFRII，LYR为中抗，JJSI，JJSII，NAU，HFS为敏感，与整株测定结果反映一致。
四
本发明不仅可用于看麦娘，也可用于日本看麦娘，罔草等其他禾本科杂草。
图1为看麦娘对拿捕净产生抗性的室内鉴定法步骤图2为不同处理对看麦娘发芽率的影响1 GA200，2 GA400，3 GA800，4 0.2％KNO3冷冻，5 0.2％KNO3常温，6水冷冻，7水常温。
图3为拿捕净处理与幼苗长度的关系图4为拿捕净处理15天后对不同居群看麦娘的药效图5为拿捕净处理15天后对不同居群看麦娘的鲜重防效的影响五具体实施方式
2003年春季，对新采集的看麦娘种子进行种子鉴定，共6个居群。将所取种子样本在4℃条件下用800ppm浓度的GA3浸种5天后，将浸种后的种子播在铺有2层滤纸，直径9cm的塑料培养皿中。每皿加入7ml的拿捕净水配溶液，浓度梯度为0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2mg/L的拿捕净除草剂范围内。18℃暗培养，6天后测定苗长，用SAS或SPSS统计软件非线形回归，非线形回归方程Y＝k/(1+ebxc)，其中x除草剂剂量(ml/l)；y苗长(cm)；b，c曲线的参数；k对照的苗长(cm)；GR50＝e-g(g＝b/c)。进而得出抗性比(R/S)，结果见表1。JXRI(R/S＝32.9)，JXRII(R/S＝40.8)表现为高抗，HFRI(R/S＝8.7)，HFRII(R/S＝9)，LYR(R/S＝4.55)为中抗，JJSII(R/S＝1.14)，NAU(R/S＝1.02)，HFS(R/S＝1)为敏感。图3。
同时选取了JXRI，HFRI，JJSI进行了整株测定。即采集的JXRI，HFRI，JJSI种子进行催芽，分别移入直径9cm的花盆中，每盆40株，配12.5％拿捕净梯度剂量100，300，900，2700ml/ha，于杂草三叶期茎叶喷雾处理，重复4次，约15天统计其死亡率，计算株防效，其中JJSI在300ml/ha剂量下株防效达到50％以上，较为敏感；HFRI在900ml/ha剂量下株防效达到40％，为中抗；而JXRI在2700ml/ha剂量下株防效达到18％，表现为高抗，见图4。
2003年11月，对采集的看麦娘种子月居群JXRII，NAU，JJSII进行了整株测定，分别移入直径9cm的花盆中，每盆40株，配12.5％拿捕净梯度剂量300，600，1200，2400，4800ml/ha于杂草四叶期茎叶喷雾处理，重复4次，约15天称量地上部分的鲜重，计算鲜重防效，其中NAU、JJSII在600ml/ha剂量下鲜重防效就已达到70％以上，较为敏感；而JXRII在4800ml/ha剂量下鲜重防效才到15％左右，表现为高抗，见图5。
表1，图3，图4，图5说明种子鉴定出的JXRI，JXRII表现为高抗，HFRI，HFRII，LYR为中抗，JJSI，JJSII，NAU，HFS为敏感，与整株测定结果反映一致。
以上测量苗长技术的实施，本领域技术人员也可相应通过测量幼苗根长或胚芽鞘的长度，用SAS或SPSS统计软件非线形回归得出抑制中浓度GR50，根据非线形回归方程得出抗性比R/S，即抗性居群抑制中浓度RGR50/敏感性居群抑制中浓度SGR50，判断抗药性抗性比R/S＞10为高抗，3＜R/S＜10为中抗，R/S＜3为敏感。
表1 幼苗长度与除草剂剂量非线形方程参数
Y＝k/(1+ebxc)表中括号为标准差
权利要求
1.看麦娘对拿捕净产生抗药性的鉴定方法，包括1)破除看麦娘休眠将看麦娘种子于4℃条件下800-1000ppm浓度的GA3或0.2％(m/v)KNO3为浸种液浸种5天；2)抗拿捕净适宜浓度的筛选将浸种后的种子播在直径为9cm，铺有滤纸的塑料培养皿中，加入浓度梯度为0，0.0625，0.125，0.25，0.5，1，2，4，8mg/L的除草剂7mL，4次重复，放入18℃培养箱中暗培养，每两天加入1ml蒸馏水；3)抗药性鉴定六天后测量幼苗的苗长或根长、胚芽鞘的长度，用SAS或SPSS统计软件非线形回归得出抑制中浓度GR50，根据非线形回归方程条得出抗性比R/S即抗性居群抑制中浓度RGR50/敏感性居群抑制中浓度SGR50；4)抗药性判断抗性比R/S＞10为高抗，3＜R/S＜10为中抗，R/S＜3为敏感。
全文摘要
本发明看麦娘对拿捕净产生抗药性的鉴定方法，属于杂草抗药性测定方法，将看麦娘种子于4℃条件下800－1000ppm浓度的GA
文档编号G01N33/00GK1544936SQ20031010627
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月13日 优先权日2003年11月13日
发明者王庆亚, 张守栋, 黄世霞, 董立尧 申请人:南京农业大学
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