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专利名称：液相色谱分析n-对氨基苯甲酰-l-谷氨酸纯度的方法
技术领域：
本发明涉及医药中间体的分析技术，具体地说是一种液相色谱分析N-对氨基苯 甲酰-L-谷氨酸纯度的方法。
背景技术：
N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸是合成抗贫血药叶酸(folic acid)的重要中间体。 N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的纯度对于叶酸的质量和医疗效果具有重要的意义。现有技 术中没有对N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品纯度进行分析的方法，经广泛查阅国内外出 版物和检索专利文献，均未见有报道。造成国内外企业为叶酸生产提供原料合成该中间 体时，一直无法对其纯度和质量进行分析和监控；造成叶酸质量无法保证，药品的医疗 效果无法保证。发明一种方法简便、结果准确、适应性强的液相色谱分析N-对氨基苯甲 酰-L-谷氨酸的纯度的方法，对于保证和提高抗贫血药叶酸的质量和医疗效果，是一个 十分迫切需要解决的技术问题，也是医药工业的十分重要的任务。

发明内容
本发明的目的是提供一种方法简便、结果准确、适应性强的液相色谱分析N-对 氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法。本发明技术方案是液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法，步骤如下(1)设定色谱操作条件I.取H3PO4-KH2PO4缓冲溶液_甲醇体系作为流动相，缓冲溶液/甲醇体积比V 缓冲溶液/V甲醇=75/25-85/15 ；II.调节缓冲溶液pH:滴加浓磷酸至50mmol/L的KH2PO4水溶液中，调节pH = 3.4-4.4 ；III.流动相流速为 0.2-0.5mL/min ；IV.紫外检测器检测波长200-3IOnm ；V.色谱柱Agilent-Hypersil ODS 100 X 4.6mm, 5um ；VLWaters 515液相色谱仪，配Waters 2487紫外检测器；VII.进样量1-20ML ；(2)配制溶液I.配制内标液准确称取无水对氨基苯磺酸50mg，置于容量瓶中，以流动相溶 解并定容至刻度；II.配制标样与样品溶液i.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液准确称取N-对氨基苯甲酰-L-谷氨 酸标样50mg，置于容量瓶中，以流动相溶解并定容至刻度；ii.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准溶液
分别移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的N_对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备 液，并以流动相定容至IOmL ；配制成浓度分别为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL
的标准溶液；分别准确移取2.5、3.5、4.5mL的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液，并 以流动相定容至10mL，配制成浓度分别为0.25、0.35、0.45mg/mL的标准溶液；iii.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品储备液准确称取N-对氨基苯甲酰-L-谷 氨酸样品50mg，置于50mL容量瓶中，以流动相溶解，并定容至刻度；iv.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品溶液准确移取3.0mL的N_对氨基苯甲 酰-L-谷氨酸样品储备液，并以流动相定容至IOmL ；III.加内标物的混合液的配制移取步骤(2)1配制的内标液0.5mL，加入0.5mL的步骤(2)II配制的各浓度的 N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准溶液或样品溶液，配制成添加内标物的混合溶液，用于 色谱进样使用；(3)分析方法考察I.线性关系考察以内标物与N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样的峰面积比Y = A1/As对标样的质量浓度C1作图，绘制标准工作曲线，或者进行回归分析，拟合出线性方 程式；II.精密度与回收率试验以标准加入法进行回收率试验，重复进样3-6次，测 定结果的精密度；(4)N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品测定取步骤(2)ILiv配制的N-对氨基苯甲酰_L_谷氨酸样品溶液注入液相色谱仪 中，以步骤(3)所述的内标标准曲线法进行定量测定。步骤(I)I中流动相甲醇-缓冲溶液体系，体积比V 优选为20/80。步骤(I)II中缓冲溶液的pH值优选为3.7。步骤⑴III中流动相的流速优选为0.3mL/min。步骤(1) IV中紫外检测波长优选为254nm。本发明采用液相色谱仪配紫外检测器对N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的纯度进 行分析，色谱柱和检测器采用常见的C18柱和紫外检测器，色谱条件容易实现，普适性 强。该色谱条件下，样品稳定性强，分析结果的重现性好，经多次实验验证该分析方法 的准确度和准确度高。本发明采用色谱条件容易实现、通用性强的C18色谱柱配紫外检测器，紫外检 测波长设定为200-310nm，优选为254nm。由于N_对氨基苯甲酰-L-谷氨酸为易解离 化合物，故需配制合适pH值的缓冲溶液作为流动相，以抑制样品组分的解离。本发明 采用H3PO4-KH2PO4缓冲溶液-甲醇体系作为流动相，缓冲溶液的pH值为3.4-4.4，优 选为3.7，缓冲溶液与甲醇的体积比为75/25-85/15，优选80/20。流动相的流速设定为 0.2-0.5mL/min,优选为0.3mL/min。本发明采用对氨基苯磺酸作为内标物，以内标标准 曲线法对N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品的纯度进行了分析，经回收率与准确度试验测 试，该分析结果准确可靠。本发明H3PO4-KH2PO4缓冲溶液的组成和配制为公知的已有技术。本发明线性关系考察，以内标物与N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样的峰面积比Y = A1/As对标样的 质量浓度C1作图，绘制标准工作曲线，或者进行回归分析，拟合出线性方程式为本领域 技术人员的常用方法。本发明的优点是1、世界上首次提出N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的分析方法，填补现有技 术中对N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品纯度分析方法的空白。2、分析条件容易实现，普适性强。3、样品稳定性强，分析结果重现性好。4、分析结果准确度和准确度高。


图1为N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样色谱图。图2为N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样色谱图的局部放大图。图3为N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品色谱图。图4为N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品色谱图的局部放大图。图5为加入内标物对氨基苯磺酸的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品色谱图。图6为加入内标物对氨基苯磺酸的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品色谱图局部 放大图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步阐述。实施例1 一、设定HPLC操作条件1.流动相H3PO4-KH2PO4缓冲溶液_甲醇体系，缓冲溶液/甲醇体积比V纟J冲溶 液/V甲醇=80/20 ；2.缓冲溶液的组成为滴加浓磷酸至50mmol/L的KH2PO4水溶液中，小心调节 至缓冲溶液的pH = 3.7 ；3.流速0.3mL/min ；4.紫外检测器，检测波长254nm ；5.色谱柱Agilent-Hypersil ODS (100 X 4.6mm，5um)；6.Waters 515液相色谱仪，配Waters 2487紫外检测器；7.进样量1-20 μ L。二、配制溶液1、内标液配制准确称取无水对氨基苯磺酸50mg，置于50mL容量瓶中，以流 动相溶解并定容至刻度。2、标样与样品溶液的配制(I)N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液准确称取纯度为97%的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样50mg，置于50mL容 量瓶中，以流动相溶解并定容至刻度。
(2)N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准溶液分别准确移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的上述N_对氨基苯甲酰-L-谷氨 酸标准储备液，并以流动相定容至10mL，配制成浓度分别为0.10、0.20、0.30、0.40、 0.50mg/mL的标准溶液，用于标准工作曲线试验；分别准确移取2.5、3.5、4.5mL的上述N_对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液， 并以流动相定容至10mL，配制成浓度分别为0.25、0.35、0.45mg/mL的标准溶液，用于 精密度与回收率试验；(3)N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品储备液准确称取纯度为97%的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品50mg，置于50mL容 量瓶中，以流动相溶解，并定容至刻度。(4)N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品溶液准确移取3.0mL的上述N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品储备液，并以流动相定 容至IOmL。3、加内标物的混合液的配制分别移取0.5mL的内标液加入0.5mL的上述各浓度的N_对氨基苯甲酰_L_谷氨 酸标准溶液或样品溶液，配制成添加了内标物的混合溶液，用于色谱进样使用。三、分析方法的考察1.线性关系考察以内标物与N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样的峰面积比(Y = A/As)对标样的 质量浓度C1作图，绘制标准工作曲线，或者进行回归分析，拟合出线性方程式为Y = 7.27X10^+3.970,, r = 0.9999 (η = 5)。2.精密度与回收率试验表1 : N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸分析方法的精密度与回收率试验(η = 3)
加入量检出量回收率RSD^
(mg)(mg)(%)(%)2.001.9899.14 0.88
3.503.57101.9 0.18
4.004.11102.8 0.64
-\四、N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品纯度测定结果标样纯度为97%，故直接测定结果需再X97%进行校正。经测定，采用本方法 测得的某N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品的平均纯度为96.15%，相对平均偏差(η = 3) 为 0.11%。以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的 任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
权利要求
1. 一种液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法，步骤如下(1)设定操作条件I.取H3PO4-KH2PO4缓冲溶液-甲醇体系作为流动相，缓冲溶液/甲醇体积此 液/Vfe= 75/25-85/15 ；II.调节缓冲溶液pH滴加浓磷酸至50mmol/L的KH2PO4水溶液中，调节pH = 3.4-4.4 ；III.流动相流速为0.2-0.5mL/min；IV.紫外检测器检测波长200-3IOnm；V.色谱柱Agilent-HypersilODS 100 X 4.6mm，5um ；VLWaters 515液相色谱仪，配Waters 2487紫外检测器；VII.进样量1-20ML ；(2)配制溶液I.配制内标液准确称取无水对氨基苯磺酸50mg，置于容量瓶中，以流动相溶解并 定容至刻度；II.配制标样与样品溶液i.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液准确称取N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标 样50mg，置于容量瓶中，以流动相溶解并定容至刻度；ii.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准溶液分别移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液，并 以流动相定容至IOmL;配制成浓度分别为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL的标准溶液；分别准确移取2.5、3.5、4.5mL的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液，并以流 动相定容至10mL，配制成浓度分别为0.25、0.35、0.45mg/mL的标准溶液；iii.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品储备液准确称取N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸 样品50mg，置于50mL容量瓶中，以流动相溶解，并定容至刻度；iv.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品溶液准确移取3.0mL的N-对氨基苯甲酰-L-谷 氨酸样品储备液，并以流动相定容至IOmL;III.加内标物的混合液的配制移取步骤(2)1配制的内标液0.5!^，加入0.5mL的步骤(2)11配制的各浓度的N_对 氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准溶液或样品溶液，配制成添加内标物的混合溶液；(3)分析方法考察I.线性关系考察以内标物与N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样的峰面积此Y= A1/ As对标样的质量浓度C1作图，绘制标准工作曲线，或者进行回归分析，拟合出线性方程 式；II.精密度与回收率试验以标准加入法进行回收率试验，重复进样3-6次，测定结 果的精密度；(4)N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品测定取步骤(2)II.iv配制的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品溶液注入液相色谱仪中，以 步骤(3)所述的内标标准曲线法进行定量测定。
2.根据权利要求1所述的液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法，其 特征在于步骤(I)I中流动相缓冲溶液/甲醇体积此优选为80/20。
3.根据权利要求1所述的液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法，其 特征在于步骤(I)II中缓冲溶液的PH值优选为3.7。
4.根据权利要求1所述的液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法，其 特征在于步骤(I)III中流动相的流速优选为0.3mL/min。
5.根据权利要求1所述的液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法，其 特征在于步骤(I)IV中紫外检测波长优选为254nm。
全文摘要
本发明涉及医药中间体的分析技术，色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法。现有技术没有N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品纯度的分析方法，无法对其纯度和质量进行分析和监控；造成使用该原料合成的叶酸质量无法保证，医疗效果无法保证。本发明采用常见的C18柱，配紫外检测器，以H3PO4-KH2PO4缓冲溶液-甲醇体系作为流动相，流动相流速设定为0.3mL/min；采用对氨基苯磺酸作为内标物，以内标标准曲线法对N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品的纯度进行分析。本发明的优点分析条件容易实现；样品稳定性强，分析结果重现性好；分析结果准确度高。
文档编号G01N30/02GK102012408SQ20101052327
公开日2011年4月13日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者郭建宇 申请人:上海师范大学