专利名称：胞内劳森氏菌培养、抗该菌的疫苗和诊断试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗胞内劳森氏菌(Lawsonia.intracellularis)疫苗以及防治和诊断LI感染的方法。本发明的产品和方法部分是由我们发现的大规模培养胞内劳森氏菌的改良方法所导致的结果。
背景技术：
胞内劳森氏菌是猪增殖性肠病(porcine proliferative enteropathy，PPE)的致病原，它影响几乎所有动物，包括人、兔、白鼬、仓鼠、狐狸、马和其他各种不同动物如鸵鸟和美洲鸵等。
胞内劳森氏菌是猪群中造成损失的特别重要的原因。在美国对PPE的发生率和感染率的估计是，高达20％的猪群被感染并且每年损失$2000万。
PPE的一个固定特征是在被感染的肠部分的肠细胞中存在细胞质内的、非膜结合的弯曲杆菌。与PPE相关的细菌已被称为“弯曲杆菌样生物(Campylobacter-likeorgansims)”S.McOrist et al.，Vet.Pathol.，Vol.26，260-64(1989)。随后，致病细菌被鉴别为一种新的分类属和种，在本国语中被称为“Ilealsymbiont(IS)intracellularis”(胞内回肠共生生物，ISi)。C.Gebhart et al.，Int’l.J.of Systemic Bacteriology，Vol.43，No.3，533-38(1993)。最近，这些新细菌被赋予分类名Lawsonia(L.)intracellularis。S.McOrist et al.，Int’lJ.ofSystemic Bateriology，Vol.45，No.4，820-25(1995)。这3种名称可互换使用，都指此处描述和进一步鉴别的相同生物体。我们尽量在本发明的论述中使用分类名胞内劳森氏菌(L.intracellularis)。
胞内劳森氏菌是一种专性的、细胞内的细菌，它不能在常规的无细胞的培养基中用通常的细菌学方法培养，而且一直认为需要附着在上皮细胞才能生长。S.McOrist etal.在Infection and Immunity，Vol.61，No.10，4286-92(1993)和G.Lawson et al.在J.of Clinical Microbiology，Vol.31，No 5，1136-42(1993)中论述，用IEC-18大鼠的肠上皮细胞单层在常规组织培养瓶中培养胞内劳森氏菌。此外，H.Stills在Infection and Immunity，Vol.59，No.9，3227-36(1991)中论述，在常规组织培养瓶中使用肠407人胚胎肠细胞单层和GPC-16豚鼠结肠腺癌细胞单层。这些已有的培养方法费力而且不适合大规模培养。
由于在体外培养胞内劳森氏菌需要苛刻的生长条件，所以目前对胞内劳森氏菌感染的认识以及对该疾病的治疗和有效控制都受到阻碍。因此目前需要一种改良的培养胞内劳森氏菌的方法。还需要抗胞内劳森氏菌疫苗和诊断胞内劳森氏菌感染的有效工具。
发明内容
本发明的一个目的是提供抗胞内劳森氏菌疫苗。
本发明的另一目的是提供在生物样品中检测抗胞内劳森氏菌抗体存在与否的方法。
本发明的另一目的是提供一种改良的培养方法，它能大规模地培养胞内劳森氏菌以用于生产疫苗和诊断试剂。
为了实现这些和其他目的，以及与本文广泛描述和体现的本发明意图相一致，本发明提供了一种培养胞内劳森氏菌的方法并用该方法得到大量的细菌原料。根据该方法，胞内劳森氏菌细菌在氧浓度为约0-18％下孵育，同时搅拌细菌以培养胞内劳森氏菌并维持细菌悬浮。
根据另一例子，提供了一种培养胞内劳森氏菌细菌的方法，即通过用含胞内劳森氏菌细菌的接种物接种HEp-2、McCoys或IEC-18细胞单层(其汇合度约为30％)，使细菌感染细胞。接着感染的细胞在约36-38℃温度，氧浓度为约0-8.0％下孵育，直至细胞得到汇合。然后将感染细胞和生长培养基置于发酵器、生物反应器、旋转瓶(spinner flask)或其他适合维持细胞处于悬浮状态的容器中。感染细胞在孵育时应搅拌细胞，以便培养胞内劳森氏菌细菌并维持感染的细胞悬浮。一部分培养的胞内劳森氏菌再传代至新鲜的培养细胞以增加胞内劳森氏菌细菌的产量。
本发明提供抗胞内劳森氏菌疫苗和产生针对胞内劳森氏菌的疫苗的方法。通过将培养的胞内劳森氏菌细菌传代足够多次数并选择减毒菌株，或者通过将培养的细菌进行化学减毒，从而产生无毒力的胞内劳森氏菌细菌。用本发明的培养方法还可制备灭活的胞内劳森氏菌疫苗。根据一个特别优选的实施例，细菌被连续培养至少6-8月，同时被传代至少约7-12次以产生可用作疫苗的减毒菌株。然后将减毒细菌与药学上可接受的载体混合，并以有效量施用给动物以产生免疫应答。我们已经将目前的优选减毒菌株(N343NP40wk)保藏在美国典型培养基保藏中心(ATCC)。
本发明还提供了一种确定在生物样品中是否存在与胞内劳森氏菌细菌特异性反应的抗体的方法，即通过收获至少一部分培养的胞内劳森氏菌细菌，用收获的胞内劳森氏菌细菌或其组份与来自动物的生物样品在生物样品中存在的抗体会与胞内劳森氏菌或组份反应的条件下进行接触，以及确定是否发生抗体-抗原反应。
本发明的其他特征和优点将在下面的描述中给出，它们在描述中很明显或者可以通过实施本发明而领悟。
具体实施例方式
如本文所用，术语“胞内劳森氏菌”指由C.Gebhart et al.，Int’l.J.of SystemicBacteriology，Vol.43，No.3，533-38(1993)和S.McOrist et al.，Int’l J.of SystemicBateriology，Vol.45，No.4，820-25(1995)(这两篇文献的全部内容在此引用作为参考)详细描述的细胞内的、弯曲的、革兰氏阴性细菌，它包括但并不限于在美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)保藏的ATCC55672细菌；在国立典型培养物保藏中心(NCTC，Colindale，London)保藏的NCTC12656和12657细菌；依据本领域的知识和此处的讲授内容，可以从世界范围内被PPE感染的猪或其他动物中获得的致病细菌；以及任一上述细菌的自发的或人工诱变的突变体或变异体。
如本文所用，术语“减毒菌株”指任何这样的胞内劳森氏菌菌株，它通过此处所讲授的培养和传代技术而制备从而使其达到无毒力，同时当其施用给宿主动物时又维持其免疫原性特征。如下所述，根据本发明，各种不同的胞内劳森氏菌菌株被培养和减毒，从而获得了减毒免疫原性菌株。这些减毒菌株可有效地作为猪或其他易患胞内劳森氏菌感染的动物的疫苗。
本发明的减毒菌株预期可作为动物的抗微生物疫苗中的免疫原，这些动物包括鸟、鱼、牛、猪、马、哺乳动物和普通的灵长动物以及人。在获得此处讲授的内容后，这些疫苗可用本领域中技术人员已知的技术进行制备。这种疫苗可含有免疫有效量的减毒菌株和药学上可接受的载体。疫苗可以单剂量或多剂量地进行施用。在此处讲授内容的基础上，免疫有效量可用本领域已知的方法加以确定而不必进行过多的实验。无毒力的细菌的数量应足以在易患病的动物中激发免疫应答同时仍然是无毒力的。这取决于特定的动物、细菌和所涉及的疾病。施用于易感动物的建议剂量优选为约103-109细菌/千克体重，最佳为约105-107细菌/千克体重。载体是本领域技术人员熟知的，并且包括稳定剂和稀释剂。这种疫苗还可以含有适当的佐剂。本发明的疫苗可与其他疫苗例如另一种冻干疫苗的稀释液组合使用，或者在冻干之前与其他疫苗组合。疫苗制剂还可进行干燥，例如冻干，以便于储藏或为了以后配制成液态疫苗。
因此，本发明还包括一种在动物宿主中诱导针对毒性的、野生型胞内劳森氏菌细菌的免疫应答从而保护该宿主免受该细菌侵害的方法。这种方法包括向宿主施用免疫有效量的本发明的减毒细菌或杀死的细菌，较佳地是向宿主施用本发明的疫苗。
如本文所用，术语“大规模培养”指胞内劳森氏菌的培养水平大于约2.0-3.0升而且包括产量规模大于100升或更大。如本文所用，“培养”指促进胞内劳森氏菌的生长、再生和/或增殖的过程。
在实施本发明的培养方法中，培养细胞首先用含胞内劳森氏菌细菌的接种物进行接种以使细菌感染细胞。多种细胞系可用于实施本发明，其中包括但并不限于IEC-18(ATCC1589)-鼠肠上皮细胞、HEp-2(ATCC23)-人表皮样瘤细胞、McCoys(ATCC1696)-鼠(非特异的)细胞、MDCK(ATCC34)-Madin-Darby狗肾细胞、BGMK(Biowhittaker#71-176)-布法罗绿猴肾细胞和猪肠上皮细胞。优选的培养细胞是HEp-2、McCoys或IEC-18细胞。或者，细菌可以在无细胞的系统中培养，只要细菌被维持在此处所教授的合适的溶解氧浓度下。
如果使用培养细胞，那么在接种之前细胞最好(但不一定)处于单层形式。为了形成单层，可将细胞接种于常规的瓶中。每个瓶一般的接种量为约1×105-10×105细胞/25平方厘米瓶，并与生长培养基混合。生长培养基可以是任何用于细胞培养的介质，它含有氮源、选定的培养细胞所需的生长因子和碳源如葡萄糖或乳糖。优选的培养基是添加2-5％胎牛血清的DMEM，尽管也可使用各种其他市售的培养基并获得良好的结果。
我们发现，通过将培养细胞维持在稳定的生长状态下，可以更好地成功培养胞内劳森氏菌。因此，在接种时培养细胞单层应约有20-50％汇合度。更佳地，在接种时细胞汇合度应为约30-40％，最佳汇合度为约30％。
接种物可以是纯胞内劳森氏菌培养物，例如从ATCC保藏号55672、NCTC保藏号12656或12657、或从感染的猪或其他动物身上用此处所述的分离和纯化技术而获得的纯培养物。
根据一个例子，用于实施本发明的接种物是通过刮下感染PPE的猪或其他动物的回肠粘膜而制备的肠道组织匀浆。制备肠道组织匀浆时，选择用于培养的回肠部分应显示出严重的损伤并带有明显的增厚。由于细菌天性脆弱，所以在尸体解剖后最好应尽快将样品保藏在-70℃下。最好在接种物中加入胞内劳森氏菌已产生抗性的抗生素以抑制污染细菌同时又可允许胞内劳森氏菌的生长，为了例举，此类抗生素有万古霉素、两性霉素B或氨基糖苷类抗生素成员如庆大霉素和新霉素。无论接种物是纯培养物还是肠道组织匀浆，给出此处的讲授内容后，对培养细胞接种可用本领域中的各种技术进行。
然后，细菌和/或接种的培养细胞在减少溶解氧浓度条件下进行孵育。当溶解氧浓度大于18％时，胞内劳森氏菌生长比最佳情况低并且在氧浓度超出该范围下最终停止生长。较佳地，接种的培养细胞在溶解氧浓度为约0-10％下进行孵育。更佳地，细胞在在溶解氧浓度为约0-8％下孵育，最佳地，氧浓度为约0-3.0％。
二氧化碳的适当浓度对胞内劳森氏菌的合适生长也是至关重要的。当二氧化碳的浓度大于10％或小于4％时，发生的是非最佳生长并且在二氧化碳超出该范围情况下最终生长停止。较佳地，二氧化碳的浓度为约6-9％，最佳地，二氧化碳的浓度为约8.8％。
此外，细胞优选在氢气浓度为约73-94％下孵育。可使用氮气以替换部分或全部氢气。根据一个特别优选的例子，细胞在约0-8.0％氧气、约8.8％二氧化碳和约83.2％氢气下孵育。
接种细胞可在双气体孵育器(incubator)或其他含有适当浓度氧气和二氧化碳并允许细胞在孵育过程中悬浮的气体腔中进行孵育。该腔应含有将接种细胞维持在悬浮状态的装置、气体监视器以及提供并维持适当气体浓度的供应源。孵育温度应为30-45℃，较佳为36-38℃。最佳地，温度为约37℃。在给出此处的讲授内容后，本发明的培养和减毒方法所需的设备对于本领域的一般技术人员而言是可轻易获得的。适于实施本发明的设备的一个例子是双气体孵育器，例如可从Lab-Line，MelrosePark，Illinois获得的480型，并与旋转瓶结合以维持细胞处于悬浮状态。目前优选的设备包括发酵器、生物反应器或旋转摇床，它们含有至少约2升培养基并且能通过喷入适当浓度的气体或通过其它机械搅拌手段将培养细胞维持于悬浮状态，并且能够连续监测培养基中溶解氧的水平。New Brunswick，Braun和其他公司制造用于该目的的合适发酵器和生物反应器。
通过在孵育过程中将接种细胞维持于悬浮状态，就可以通过增加每个细胞暴露于生长培养基以及氧气和二氧化碳混合物的程度，实现细胞的最大生长，进而实现胞内劳森氏菌的最大生长。可以用本领域中的各种方法搅拌培养细胞并维持于悬浮状态，其中包括例如，培养瓶、滚动瓶(roller bottle)、膜培养器或旋转瓶。通过在双气体孵育器或类似设备内旋转瓶中孵育细胞，可以使细胞在孵育过程中保持悬浮状态。如此处所用，术语“旋转瓶”指这样的瓶子或其他容器，它们采用桨、螺旋桨或其他装置来搅拌培养物并将所含的细胞维持于悬浮状态。
在本发明的一个特别优选的例子中，孵育接种细胞直至细胞达到汇合，然后将细胞置于含有生长培养基的旋转瓶中并在双气体孵育器中孵育同时使旋转瓶旋转。较佳地，将接种细胞刮入旋转瓶中。这可以用本领域中已知的各种方法实现，例如使用细胞刮削器来解离细胞。一旦细胞被引入旋转瓶，旋转瓶的桨典型地以约30-60rpm的速度机械旋转，将感染细胞维持于悬浮状态。
一部分培养的胞内劳森氏菌接着被传代至新鲜的培养细胞，以增加胞内劳森氏菌细菌的产量。术语“传代”或类似词语指将一部分培养的胞内劳森氏菌转移至新鲜培养细胞以便用该细菌感染新鲜细胞的过程。如此处所用，术语“新鲜”指没有被胞内劳森氏菌感染的细胞。较佳地，这种细胞是平均不超过约1天的细胞。
在悬浮培养物中胞内劳森氏菌的传代，可以通过取出一部分原始培养物并将其加入至含新鲜培养细胞的新瓶中而实现。如果原始培养物的细菌数目/毫升值较高，例如大于约104细菌/毫升，则优选将被感染的瓶子中约1-10％(体积比)的培养物加入新的含新鲜细胞的瓶子中。最好在50-100％细胞被感染时进行该操作。如果被感染的细胞低于50％，则最好通过将培养物一分为二加入新瓶，然后添加新培养基至所需体积刻度而实现传代。在任何情况下，都不需要细胞裂解和其他步骤，这与已有技术中单细胞层培养物的传代正好相反。
在培养细胞充分生长和随后用胞内劳森氏菌以大于约70％细胞感染率感染(用IFA、TCID50或其他类似方法测定)之后，收获至少一部分培养的胞内劳森氏菌细菌。在给出此处的讲授内容后，可以用本领域一般技术人员已知的各种技术，通过从悬浮液中分离细菌而进行收获步骤。较佳地，胞内劳森氏菌细菌的收获是通过离心全部或部分悬浮液所含物质，使培养细胞沉淀，然后再悬浮形成的细胞沉淀，再裂解感染细胞。典型地，将至少一部分内含物在约3000×g下离心约20分钟，使细胞和细菌形成沉淀。沉淀再悬浮于例如蔗糖-磷酸盐-谷氨酸(SPG)溶液中，然后通过25规格(gauge)的针头约4次以使细胞裂解。如果还需要进一步纯化，样品可在约145×g下离心约5分钟，以除去细胞核和碎片。上清液在约3000×g下离心约20分钟，形成的沉淀物再悬浮于合适的稀释剂中，如含胎牛血清的SPG(以制备适于冷藏或用作接种剂的收获细菌)或生长培养基(以制备更适合传代至新鲜细胞的收获细菌)。
如上所述，用于大规模生产的胞内劳森氏菌的有效生长可以通过使组织细胞活跃地生长而提高。对于单层，当培养物汇合时，细胞分裂的速度显著下降。使胞内劳森氏菌在单层组织培养物上生长的尝试只能获得有限的成功，而且不可能进行大规模生产。然而，用悬浮培养可大大便于使细胞活跃地生长，并允许连续的培养物的增加和规模扩大。用发酵器和上述的约0-3％溶解氧，我们已经可以使其生长至108细菌/毫升。我们还已经使培养的细菌活跃地生长许多月并且预期可以无限制地继续下去。
在本发明之前，普遍认为细胞必须附着于表面才能被胞内劳森氏菌感染。本发明的细胞悬浮液是独特的，并与该理论相反。在使用McCoys或IEC-18细胞时，优选与生长培养基一起添加明胶、琼脂糖、胶原蛋白、丙烯酰胺或二氧化硅珠例如HyCloneLaboratories(Logan，UT)制造的Cultisphere-G(培养球-G)多孔微载体(microcarries)。然而，根据本发明方法，HEp-2细胞和其他细胞不需要微载体。这对于大规模培养提供了特别有利和经济的途径。
对于HEp-2培养，为了维持培养的目的，最好每周取出25-50％培养物并以新鲜培养基替换。对于带微载体或珠的细胞培养，优选每周1-2次取出25-50％培养物并以新鲜微载体或珠和新鲜培养基替换。为了扩大规模，可向培养物中再加入25-50％培养基或带微载体的培养基。
依据培养细胞被感染的速度，通常每隔约2-5周进行一次向新鲜细胞的传代。假设在2-3周内培养细胞中至少70％被感染，那么优选在约3-4周进行传代。
本发明还提供了抗胞内劳森氏菌的疫苗和生产该疫苗的方法。根据一个特别优选的例子，在长时间(例如6-8个月)维持感染细胞于悬浮状态后，至少一部分培养的胞内劳森氏菌细菌被收获并监测潜在的减毒效果。这种监测优选通过宿主动物或动物模型的免疫激发而完成，以选择减毒菌株。这种减毒菌株可用于此处所述方法中的疫苗。本发明的减毒的胞内劳森氏菌疫苗已经显示出可在各种动物中有效地抗胞内劳森氏菌感染，并且预期在人中也是有效的。
本发明允许快速地培养扩增，如产量增加100-1000倍，并且降低了成本。结果，用本发明培养方法产生的充足的胞内劳森氏菌细菌原料可轻易地被减毒以用于疫苗生产。在单层培养物中进行减毒是困难的，因为用传统的单层生长技术产生的细菌产量低。相反，本发明的胞内劳森氏菌生长方法提高了简易度、速度和用于减毒的细菌数目。细胞及细胞分裂得越多，发生的突变水平越高，这对疫苗开发是有利的。在本发明的悬浮液中进行生长增加了受环境调控的基因控制的重要免疫原的表达及其表达产物。
得到的减毒菌株可在如下面实施例1中所述的组织培养单层中培养，但是优选在本发明的悬浮培养物中进行培养。其他的减毒方法包括化学减毒例如通过使用N-甲基亚硝基胍以及其他本领域中已知的减毒物质进行减毒。无论是通过多次传代或用化学方法，都可产生减毒胞内劳森氏菌并加以选择以制备疫苗。
根据本发明的一个疫苗例子，通过上述的离心或微过滤收获抗原。然后根据最佳宿主动物免疫应答，通过在宿主动物物种中的剂量效价而确定一水平，并在该限定的水平上对抗原进行标准化。细菌可以通过长时间例如一周暴露于环境氧气浓度，或者通过用0.3％福尔马林或其他失活剂而使其失活以制备杀死的疫苗。然后，将抗原掺入合适的佐剂例如氢氧化铝或矿物油中以增强免疫应答。接着，通过肌内或皮下注射，将抗原用于免疫宿主，对于约3-4周的小猪，如果需要可用加强剂量。
或者，根据一个特别优选的、使用上述培养方法的疫苗例子，细菌被连续地传代以诱导和选择减毒的、无毒力的活培养物。在宿主动物中测试该培养物(最好在悬浮培养中生长至少6-8月之后)的减毒情况。如前所述收集培养物并稀释。例如，猪可用口服1×105-1×106细菌而进行免疫。在免疫28天后，猪再用1×107个传代次数较少(约30至40天)、有毒力的胞内劳森氏菌培养物口服接种。感染动物在免疫激发后21天进行尸体解剖，在小肠观察到大的损伤和微小的损伤。还应进行PCR和荧光抗体(FA)分析。约80％对照动物有大或微小的损伤，并且用PCR或FA测试方法显示，在肠的粘膜细胞中胞内劳森氏菌的存在呈阳性测试结果。免疫的动物通过组织学观察确定具有正常的粘膜表面，而且在PCR测试中呈阴性。
一般，减毒的免疫原性胞内劳森氏菌菌株是通过连续培养至少约150-250天且其间培养物传代至少约7-12次而产生的。也可改变这些参数而产生其他的减毒培养物，只要采用此处所述的监测和选择方法。
然后制备疫苗，它含有免疫有效量的减毒胞内劳森氏菌和药学上可接受的载体。合并后的免疫原和载体可以是水溶液、乳化剂和悬浮液。在给出此处的讲授内容后，免疫有效量可以用本领域的已知方法确定而不需要过多的试验。一般，免疫原的数量为50-500微克，而且当使用纯化细菌时为107-109TCID50。
本发明的疫苗一般单剂量或多剂量地施用给易患动物(较佳为猪)。按2周间隔，可施用活的或灭活的疫苗1或2次。对于减毒的活疫苗，优选单剂量。活的减毒菌株的优选给药途径是口服或鼻内给药，但也可以通过肌内或皮下注射。对于灭活疫苗，肌内和皮下注射途径是最佳的。
PPE的有效诊断也被培养致病细菌所需的时间所阻碍。作为本发明的结果，现在可以开发出快速和准确地分析来自猪或其他可能患PPE的动物的生物样品中是否存在胞内劳森氏菌的诊断工具。
根据本发明方法生长的胞内劳森氏菌细菌或来自该细菌的组份，可在ELISA或其他免疫分析如免疫荧光抗体试验(immunofluorescent antibody，IFA)中用作抗原，以检测在可能被该细菌感染的动物的血清或其他体液中的抗胞内劳森氏菌的抗体。目前优选的免疫分析是在下面实施例中描述的IFA。或者，用本发明方法生长的细菌被用于Western Blot分析。
根据本发明例子的优选的ELISA方案如下1.加入0.1毫升/孔稀释于包被缓冲液中的抗原。在4℃孵育18小时。
2.用PBS洗涤3次。
3.向板上每孔加入0.25毫升封闭(blocking)缓冲液。在37℃孵育1-2小时。
4.用洗涤缓冲液洗涤3次。
5.在封闭缓冲液中稀释血清，并向板的第一排孔中加入0.1毫升。在板上进行一系列1∶2的稀释。在37℃孵育1小时。
6.用洗涤缓冲液洗涤3-5次。
7.在封闭缓冲液中稀释共轭物，向板的各孔中加入0.1毫升。在37℃孵育1小时。
8.用洗涤缓冲液洗涤3-5次。
9.加入底物。
12.用分光光度计测量吸光度。
13.没有加入抗原的孔用作空白对照。
14.在每次试验中都应使用阳性和阴性对照。
优选的Western印迹方案如下1.在12％SDS-PAGE对抗原进行电泳，然后将其转至硝酸纤维素膜。
2.将膜置于封闭缓冲液中2小时。
3.去除封闭剂并用PBS漂洗1分钟。
4.在封闭缓冲液中稀释血清，并加入膜。在室温下孵育2小时。
5.用洗涤缓冲液洗涤3次(每次5分钟)。
6.在封闭缓冲液中稀释共轭物，并加至膜上。在室温下孵育1小时。
7.用洗涤缓冲液洗涤3次。
8.加入底物10分钟直至发生强结合。
9.用PBS漂洗。
10.空气中干燥并储藏在黑暗中。
本发明还结合下列实施例进一步描述。这些实施例的提供只用于阐述目的，不能理解为起限制作用。
实施例1从患猪增殖性肠病的美国猪的肠道中分离胞内劳森氏菌材料和方法接种样品的选择在衣阿华州的一个农场的兽群中获得样品N24912，在300只5个月育肥猪(finisher pig)中观察到有15只一直有血便，尽管用青霉素进行了治疗。对猪进行尸体解剖后，发现肠(回肠)有厚粘膜。用银染进行组织病理学检查显示，存在弯曲的、细胞内细菌和隐窝(crypt)肠上皮细胞增生，从而证实PPE的诊断。样品N72994是从明尼苏达州的一个农场上的1.5岁的二胎SPF母猪中获得的。兽群大小为70-80只母猪，而所用的抗生素治疗未知。尸体解剖发现，回肠粘膜增厚并有些出血。对粘膜进行Giminez染色显示，存在许多弯曲细菌。样品N1014 94是从印第安那州一个农场(具600犁农地饲养母猪)的年龄为12周的猪中获得。该猪在发生血痢疾后用Tylan注射物进行治疗，但是在治疗后不久该动物就死亡。
制备来自猪的接种物肠样品在-70℃保藏。剖开肠，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤。将1克粘膜刮入谷氨酸钠钾(sodium potassium glutamate，SPG)中，然后用4.0毫升0.1％Trypsin(JRHBioscience s，Lenexa，KS)在SPG中均化30秒。悬浮液在37℃孵育35分钟。加入10毫升SPG/10％胎牛血清(FCS)(JRH Biosciences，Lenexa，KS)，然后在组织研磨器上研磨1分钟。加入10毫升SPG/10％FCS，然后用过滤纸(Whatman 113V；WhatmanLabsales，Hillsboro，OR)过滤一次，随后在5.0、1.0和0.65微米过滤膜上过滤。将滤液分成数份，按1.0毫升一份储藏于-70℃。将粘膜涂于载玻片上以便Giminez染色。滤液的各涂片通过IFA法，用抗胞内劳森氏菌的特异性单克隆抗体(S.McOristet al.，Vet.Rec.121421-422，该文献的全部内容在此引用作为参考)进行染色。
细胞培养在含L-谷氨酰胺和10％FCS的DMEM(JRH Biosciences，Lenexa，KS)中使IEC-18(鼠肠上皮细胞，ATCC CRL 1589)生长，并每周用胰蛋白酶进行常规传代。细胞单层在37℃于含5％二氧化碳的空气中生长。
细胞培养物的感染IEC-18细胞以1.25×105细胞接种于25cm2的瓶中，并以可比和比率接种于腔玻片(chamberslide)(Nunc，Inc.，Naperville，Il)，孵育24小时，然后移去培养基。快速融化冰冻的来自猪的细菌分离物，并在含万古霉素(100μg/ml)和两性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/7％FCS中稀释，稀释比例为1.0毫升组织匀浆对15毫升培养基，然后加至单层。单层和细菌悬浮液在2000g离心30分钟，转移至厌氧罐中。排空罐，空气被氢气和二氧化碳替换从而得到8.0％氧气、10％二氧化碳和82％氢气构成的混合物。培养物在37℃孵育3小时，然后再供给含L-谷氨酰胺、万古霉素(100μg/ml)、新霉素(50μg/L)和两性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/7％FCS。培养物再放回厌氧罐中，孵育6天，每2天换一次培养基。
胞内劳森氏菌的传代按以前G.Lawson et al.在J.Clin.Microbiol.，311136-1142(1993)(该文献全部内容引用作为参考)中所述的方法，用氯化钾裂解细胞而使胞内劳森氏菌细菌传代，然后将其加至新鲜的IEC-18单层。将培养基从单层上倾倒掉，加入0.1％氯化钾，然后细胞在37℃孵育10分钟。移去氯化钾，加入SPG/10％，然后用细胞刮削器将单层解离下来。通过带21规格(gauge)针头的注射器3次使细胞裂解。在100×g离心5分钟而除去细胞核，将上清液中的细菌悬浮液加至新鲜的1天IEC-18细胞单层。
监测细胞培养物的感染用冷丙酮/甲醇将细胞固定于腔玻片上5分钟，监测感染。用免疫荧光和免疫过氧化物酶方法进行染色。两种方法都采用鼠单克隆抗体(如S.McOrist et al.在Vet.Rec.121421422(1987)中所述)作为第一抗体，以及抗-鼠免疫球蛋白G-荧光团共轭物(异硫氰酸氟化荧光素；Organon Teknika Corporation，Durham，NC)或过氧化物共轭物(羊抗-鼠免疫球蛋白G；Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.，Gaithersburg，MD)。通过对每个玻片上细胞中被特异性染色的细菌数目的计数，完成对细菌的定量分析。
聚合酶链反应将样品接种物和传代细菌合并作为模板DNA，用于使用PCR，其中所用的样品制备方法、引物和循环参数如Jones et al.在J.Clin.Microbiol.，312611-2615(1993)和McOrist etal.在Vet.Microbiol.1-8(1994)中所述(这两篇文献内容全部引用作为参考)。循环参数中第一个循环为93℃，5分钟；55℃，45秒；和72℃45秒。33个循环是在上述各温度下各进行45秒，以及一个如下循环93℃，45秒；55℃，45秒；和72℃2分钟。阳性接种物仅用于接种IEC-18细胞。也进行PCR监测传代物质以证实感染。用PCR产生的DNA被送至Iowa S tate University Nucleic AcidFacility进行测序。将测序结果与Gary F.Jones得到的、在其博士论文(Universityof Minnesota，Minneapolis，MN(1993年6月))中报道的序列进行比较。
结果选择接种物样品猪编号N24912和N72994患严重的PPE，并有带血的肠内含物和增厚的粘膜。N101494患严重的PPE和严重的腹泻，导致在肠内腔中形成大血块。对粘膜涂片的Giminez的染色显示有大量的弯曲或S形的细菌。IFA染色揭示，在来自猪的接种物中存在大量发出强荧光的细菌。
监测细胞培养物的感染在生长过程中通过光学显微镜监测被接种的单层，并观察到细胞形态的稍许变化。在较低氧浓度(8％O2)下生长的未感染单层具有类似的形态。
被免疫荧光和免疫过氧化物酶染色的感染培养物显示，在细胞中明显有大量弯曲或S形的细菌。单层没有汇合感染。感染细胞常常紧密相连，中心为1-10个细胞。还看到，重感染的细胞(即带30个或更多的细菌)也与带菌数小于30的细胞相连。细菌数目在6天左右达到峰值。感染取决于特定的生长条件。细菌通过此处所述的裂解程序成功地进行传代。对新接种细胞进行离心并不需要，但是这样做可增加感染细胞的数目。离心还可减少污染的可能性，即将暴露于在无抗生素培养基中进行感染的细胞再放入含抗生素的培养基中3小时。为了降低IEC-18细胞的生长速度从而使细菌在单层汇合之前能繁殖到更高数目，将培养基中的FCS浓度从10％降至7％是必要的。
聚合酶链反应对染色体DNA进行PCR，对所有分离物都产生一个319bp的片段(包括引物)。将大小合适的片段通过肉眼与已知的McOrist等人(1994)用PCR产生的阳性样品进行比较。对N24912、N72994和N101494的PCR产物进行序列分析，证实与Jones(1993)测得的p78序列有密切的同源性(97-99％)。
实施例2胞内劳森氏菌在HEp-2细胞的悬浮培养物中的生长制备用于接种的肠组织匀浆通过从实施例1的肠样品中的6.0-8.0厘米的回肠上刮下粘膜而制备肠组织匀浆。向刮下的粘膜加入胰蛋白酶(1％)，样品简短地进行均化，然后在37℃孵育35分钟。再加入10毫升SPG/10％FBS，样品在组织研磨器中研磨。再加入10毫升SPG/10％FBS。匀浆用Whatman113V过滤纸过滤，随后在5.0、1.0和0.65微米过滤膜上过滤。将滤液分成每份1.0毫升，储藏于-70℃。
细胞培养物的感染方法A组织细胞以1×107细胞接种于含50毫升DMEM/10％FBS的100毫升旋转瓶中。培养物孵育24小时，然后加入万古霉素和两性霉素B。将一瓶冷冻的肠匀浆快速融化，在3.0毫升DMEM/5％FBS(含万古霉素(100μg/ml)和两性霉素B(2.0μg/ml))中稀释。样品通过0.65μm过滤器，然后加入瓶中。将培养物置于空气罐中，排空，再充入氢气和二氧化碳得到由8.0％氧气、8.8％二氧化碳和83.2％氢气构成的混合物。培养物在37℃孵育3小时，然后再加入新霉素和庆大霉素。接着再在24小时内供给培养物含L-谷氨酰胺、万古霉素(100μg/ml)、新霉素(50μg/L)、庆大霉素(50μg/L)和两性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/5％FBS。
方法B将HEp-2细胞以1.25×105细胞接种于含DMEM/10％FBS的25cm2常规瓶中，孵育18-24小时。接种时细胞汇合度为30％。接种物在DMEM/5％FBS中稀释。当接种物来自肠匀浆时，培养基也含有万古霉素(100μg/ml)和两性霉素B(2.0μg/ml)。将培养物置于空气罐中，排空，再充入氢气和二氧化碳得到由8.0％氧气、8.8％二氧化碳和83.2％氢气构成的混合物。培养物在37℃孵育3小时，然后再加入新霉素和庆大霉素。接着再在24小时内供给培养物含L-谷氨酰胺、万古霉素(100μg/ml)、新霉素(50μg/L)、庆大霉素(50μg/L)和两性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/5％FBS。当接种物是纯培养物时不需要抗生素。培养物孵育6天或直至汇合。从瓶上刮下细胞并加至含50毫升DMEM/10％FBS的100毫升旋转瓶中。
培养物每周按1∶2比例进行稀释，这可通过收集一半培养物并加入新鲜培养基，或者通过将培养物移至更大的旋转瓶然后加入更多培养基。
培养物的传代将新鲜HEp-2细胞按1×107细胞接种于DMEM/5％FBS，从而将培养物传代至新鲜HEp-2细胞。新培养物在8.0％氧气、8.8％二氧化碳和83.2％氢气中孵育过夜。新培养物然后用感染培养物接种并在上述的较低氧浓度下孵育。接种物的数量取决于原始培养物的感染程度。
培养物的收获和储藏收集所需数量的培养物，在3000×g上离心20分钟，从而收获培养物。将沉淀再悬浮于蔗糖-磷酸盐-谷氨酸(SPG)溶液中，然后通过25规格(gauge)的针头4次。将培养物分成若干份，在-70℃冷冻。对于进一步纯化，样品可在145×g下离心约5分钟以除去细胞核和碎片。上清液在3000×g下离心20分钟，沉淀物再悬浮于稀释剂中。
对组织培养中活胞内劳森氏菌的估计对活胞内劳森氏菌的定量是通过确定组织培养感染剂量(50％)(TissueCultureInfectious Dose 50 percent，TCID50)而完成的。做法是取出2.0毫升待测试的培养物，通过25规格(gauge)的针头4次使细胞裂解。样品在含万古霉素(100μg/ml)和两性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/5％FBS中进行一系列1∶10的稀释。将稀释液按每孔0.1毫升加至96孔微量滴定板。用HEp-2细胞按1250细胞/孔接种于微量滴定板，并且在感染前生长18-24小时。每个稀释浓度使用3-6孔。板在8.0％氧气、8.8％二氧化碳和83.2％氢气中孵育6天。用冷的50％丙酮和50％甲醇固定细胞2分钟。向各孔中加入0.03毫升/孔抗-IS intrace llularis单克隆抗体(McOrist，1994)，该抗体已按1∶2000稀释于PBS中。板在37℃孵育30分钟，然后用PBS洗涤3次。按0.03毫升/孔加入已1∶30稀释的抗-鼠FITC，在37℃孵育30分钟。板用双蒸水洗涤3次，让其干燥。用荧光显微镜观察样品，确定TCID50/ml。
结果TCID50结果显示，培养物可含有高达1×106细菌/毫升。这是在45天内实现的。在同样时间内培养体积被扩大至3.0升。
实施例3胞内劳森氏菌在McCoys细胞的悬浮培养物中的生长制备用于接种的肠组织匀浆按实施例2所述方法，制备肠组织匀浆。用下面实施例方法培养的胞内劳森氏菌样品按照布达佩斯条约，于1995年5月19日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland U.S.A 20852)，保藏号为55672。
细胞培养物的感染将McCoys细胞以1.25×105细胞接种于两个含DMEM/10％FBS的25cm2常规瓶中，孵育18-24小时。细胞在接种时达到30％汇合度。接种物在DMEM/5％FBS中稀释。当接种物来自肠匀浆时，培养基也含有万古霉素(100μg/ml)和两性霉素B(2.0μg/ml)。将培养物置于空气罐中，排空，再充入氢气和二氧化碳得到由8.0％氧气、10％二氧化碳和82％氢气构成的混合物。培养物在37℃孵育3小时，然后再加入新霉素和庆大霉素。接着再在24小时内将含L-谷氨酰胺、万古霉素(100μg/ml)、新霉素(50μg/L)、庆大霉素(50μg/L)和两性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/5％FBS供给培养物。当接种物是纯培养物时不需要抗生素。培养物孵育6天直至汇合。从瓶上刮下细胞并加至含50毫升DMEM/2％FBS和0.05克Cultisphere-G微载体的100毫升旋转瓶中。按40-50rpm搅拌瓶。
培养物每隔2-3天按1∶2比例进行稀释，这可通过收集一半培养物并加入新鲜培养基和Cultisphere-G珠，或者通过将培养物移至更大的旋转瓶然后加入更多培养基和Cultisphere-G珠。培养物中珠的最终浓度约0.001克珠/毫升。
培养物的传代将新鲜McCoys细胞按1×107细胞接种于DMEM/5％FBS和0.05克Cultisphere-G珠中，从而将培养物传代至新鲜McCoys细胞。新培养物在8.0％氧气、8.8％二氧化碳和83.2％氢气中孵育过夜。新培养物然后用25毫升感染培养物接种，并在上述的较低氧浓度下孵育。
培养物的收获和储藏收集所需数量的培养物，在3000×g上离心20分钟，从而收获培养物。将沉淀再悬浮于SPG中，然后通过22规格的针头4次。将培养物分成若干份，在-70℃冷冻。对于进一步纯化，样品可在145×g下离心约5分钟以除去珠、细胞核和碎片。上清液在3000×g下离心20分钟，沉淀物再悬浮于稀释剂中。
对组织培养中活胞内劳森氏菌的估计对活胞内劳森氏菌的定量按实施例2所述方法进行，不同点在于用22规格的针头使细胞裂解，以及用McCoys细胞按1250细胞/孔接种于微量滴定板。
结果TCID50结果显示，培养物含有高达1×106细菌/毫升。这是少于1个月的时间内实现的。在同样时间内培养体积被扩大至3.0升。
实施例4确定胞内劳森氏菌纯培养物在宿主动物中的感染剂量概要通过用来自样品N72994的胞内劳森氏菌纯培养物感染6周大小的普通猪，完成了对31头猪的研究。这些猪被随机地分成4组，各组被单独地围起来。第1组含有7头猪，并作为阴性对照组(用未感染的组织培养物感染或不感染)。第2组含有8头猪，感染剂量为107细菌/猪。第3组含有8头猪，感染剂量为106细菌/猪。第4组含有8头猪，感染剂量为105细菌/猪。
在第0、7、14、21和24天收集粪便样品用于PCR试验。在第24天，对猪进行解剖，收集回肠、空肠和结肠用于PCR试验、组织病理学分析和FA染色，方法如上所述。
对回肠粘膜的PCR试验揭示，在高剂量组中100％、中剂量组中75％以及低剂量组中50％存在胞内劳森氏菌。组织病理学分析数据显示，在高剂量组中88％、中剂量组中75％以及低剂量组中88％发生粘膜固有层和粘膜下层中单核细胞数目增加。在高剂量组中50％、中剂量组中63％以及低剂量组中50％观察到隐窝增生。FA染色揭示，在高剂量组中88％、中剂量组中63％以及低剂量组中63％的回肠、空肠和结肠组织切片存在胞内劳森氏菌。对照动物对PCR、FA和银染分析都呈现胞内劳森氏菌存在的阴性结果。
总而言之，纯培养物可成功地用于感染并导致PPE损伤。Koch的假设通过从感染动物中分离胞内劳森氏菌并加以鉴定而证实。
在免疫激发的动物中，高剂量组中100％的动物通过银染法、FA和PCR而证实痊愈和种类。
材料和方法接种物的生长将3.75×105HEp-2细胞接种于一个含DMEM/10％FBS的75cm2常规瓶中，在5％二氧化碳和37℃下孵育18-24小时。(细胞在接种时汇合度为30％)。将一瓶N72994在15毫升DMEM/5％FBS中稀释。将培养物置于空气罐中，排空，再充入氢气和二氧化碳得到由8.0％氧气、8.8％二氧化碳和83.2％氢气构成的混合物。再在24小时内将DMEM/5％FBS供给培养物。
培养物孵育6天，然后从瓶上刮下细胞并加至含50毫升DMEM/5％FBS的100毫升旋转瓶中。每周通过使培养基体积加倍而扩大瓶中培养物的规模。培养物在旋转瓶中生长3周。
培养物的收获通过在3000×g离心20分钟而收获培养物。将沉淀再悬浮于含10％FBS蔗糖-磷酸盐-谷氨酸(SPG)溶液中，然后通过25规格(gauge)的针头4次。接种物在SPG/10％FBS中稀释成终体积，并作1∶10稀释。
用于对照的接种物，由活细胞浓度被稀释成与感染培养物相同浓度的未感染HEp-2细胞构成。按与感染细胞相同方法收获细胞。对照组的猪接受于高剂量组相当的剂量。
胞内劳森氏菌的定量对活胞内劳森氏菌的定量是通过确定50％组织培养感染剂量(TCID50)而完成的。做法是取出2毫升待测试的培养物，通过22规格(gauge)的针头4次使细胞裂解。样品在含万古霉素(100μg/ml)和两性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/5％FBS中进行一系列1∶10的稀释。将稀释液按每孔0.1毫升加至96孔微量滴定板。用HEp-2细胞按2500细胞/孔接种于微量滴定板，并且在感染前生长18-24小时。每个稀释浓度使用12孔。板在在8.0％氧气、8.8％二氧化碳和83.2％氢气的气体浓度下孵育6天。用冷的50％丙酮和50％甲醇固定细胞2分钟。向各孔中加入0.03毫升/孔抗-胞内劳森氏菌单克隆抗体(McOrist，1987)，该抗体已按1∶2000稀释于PBS中。板在37℃孵育30分钟，然后用PBS洗涤3次。按0.03毫升/孔加入已按1∶30稀释的抗-鼠FITC，在37℃孵育30分钟。板用双蒸水洗涤3次，让其干燥。用荧光显微镜观察样品，确定TCID50/ml。
动物31头6周大小、各种性别的PIC x Lieske母猪和大白公猪有Kent Schwartz博士提供。在第0天，猪按重量被随机地分配入4个猪栏中。
设备使用一个小看护所的4个猪栏来安置猪，各猪栏至少隔开3英尺。猪栏有金属丝制地板和固体隔离物。用炉子供热并且局部用放热灯泡补充供热。在研究过程中，温度维持在78-85之间。
饲料和水将不含抗生素、蛋白质含量为19％的磨细的玉米-大豆饲料，通过不锈钢供料器随意地供应。水通过供水喷嘴随意地供给。
猪的感染在第0天，对猪称重，并通过毛细血管在眼眶后窦(retroorbital sinus)采集血样。收集血清，储藏于-20℃。还收集排泄物样品用于PCR。用胃管，通过胃内方式给猪服用10毫升接种物。
在第0、10、17和24天，对猪称重并采集血样。
聚合酶链反应用Jones(1993)所描述的循环参数和引物的PCR，监测猪的感染。在第0、7、14、21和24天收集的排泄物样品以及肠粘膜用PCR检查。
组织病理学回肠、空肠和结肠的切片用福尔马林固定，用常规方法加工，用苏木精和曙红染色以及银浸渍，并且加以评估。切片还用对胞内劳森氏菌特异的单克隆抗体染色。
结果临床症状在3天，在高剂量组观察到包括稀大便等临床症状。在14天时达到高峰，随后有所减轻。
体重增长情况计算每日的平均体重增长情况，结果显示与对照组相比，高剂量和中剂量组的体重增长减少。在比较各组时，在体重增长中有剂量效价效应。
PCR直到14天才观察到粪便的滴下。在21天，高剂量组的猪中37.5％的粪便呈PCR阳性。解剖后，回肠粘膜用PCR检查，阳性率为高剂量组100％，中剂量组75％，低剂量组50％和对照组0％。
严重损伤在高剂量组中发现2头猪有严重损伤(#50和#202)。这2头猪在回肠中有约3英尺的增厚部分，而且在#202中出现坏死。
组织病理学FA回肠、空肠和结肠的切片的FA染色揭示在高剂量组87.5％，中剂量组和低剂量组62.5％，和对照组0％中存在胞内劳森氏菌。
微损伤在高剂量组100％，中剂量组75％，低剂量组87.5％和对照组14％中观察到损伤。这是通过观察粘膜固有层和粘膜下层中单核细胞数目增加而确定的，这种情况常常与Peyer’s Patchers增生有关。还观察到隐窝增生。
银染还对切片进行了银染以检查是否存在细胞内的、弯曲的细菌。结果表明，在高剂量组87.5％，中剂量组62.5％，低剂量组87.5％和对照组0％中存在细菌。
讨论用纯胞内劳森氏菌培养物可成功地感染猪。在107剂量的细菌下，用PCR和显微镜观察损伤确定100％猪被感染。在组织切片中损伤的严重程度和细菌数量相当较低。该研究是令人满意的胞内劳森氏菌免疫激发模型，因为在猪中存在胞内劳森氏菌而且有微损伤。在第一次剂量后7天再给予第二剂量的话，可增加损伤。
实施例5仓鼠疫苗有效性试验目的评估实验室动物模型，以确定无毒力的活胞内劳森氏菌疫苗在仓鼠中的安全性和有效性。
概要用高传代次数的胞内劳森氏菌菌株的纯培养物接种3周大小的仓鼠，然后在接种后22天用低传代次数的有毒力的材料进行免疫激发，从而完成对40只仓鼠的研究。仓鼠被分成3组。A组在第0天用1剂量胞内劳森氏菌菌株N72994接种。B组作为对照组，不使用疫苗培养物。在接种后22和25天，用2剂量的胞内劳森氏菌菌株N343纯培养物激发该两组。C组使用激发菌株N101494以便与菌株N343比较相对的毒力。A和B组各有15只仓鼠，C组有10只仓鼠。50％组织培养感染剂量(TCID50)数据揭示，用105TCID50/一剂接种仓鼠。N343免疫激发含有105.5TCID50/一剂。C组的激发剂量为102.75 TCID50/一剂。在第0、7、14、21、29、36和43天收集排泄物样品用于PCR试验。在第5天，对A组和B组解剖5头动物，用于PCR检查粘膜并进行肠切片的FA、苏木精和曙红染色、以及银染，以确定在接种的仓鼠中细菌移生的持续性。剩余动物在激发后21天进行解剖并进行类似试验。
PCR数据显示，在接种后21天，A组仓鼠100％的肠粘膜上存在胞内劳森氏菌。B组在接种后21天都呈阴性。在激发后21天，在A组的仓鼠中50％呈PCR阳性，在B组的仓鼠中100％呈阳性。切片的组织病理学分析显示，在激发后21天，A组的50％动物中有轻度至严重的损伤，B组的50％动物中有轻度损伤。没有动物在接种21天显现出损伤。C组动物在激发后21天没有损伤。FA和银染都不能显示在切片中存在胞内劳森氏菌。
总之，PCR显示，用高传代的胞内劳森氏菌菌株接种仓鼠时，可观察到感染下降50％。肠被少量胞内生物(指胞内劳森氏菌)移生，因为在FA和银染切片中观察不到该生物体。C组仓鼠在整个研究过程中不显示感染，这很可能是由于细菌剂量低造成的。
材料和方法仓鼠的情况使用来自Harlan Sprague Dawley的40只3周大小的雌性仓鼠。
接种物的生长疫苗培养物使用在HEp-2细胞中生长29周的胞内劳森氏菌连续培养物。该培养物按在激发培养物章节中所述的类似方式进行生长，不同点在于每2-3周将培养物传代至新的HEp-2细胞。
激发培养物将3.75×105的McCoys细胞接种于含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基)的75cm2常规组织培养瓶中，在37℃和5％二氧化碳下孵育18-24小时。将培养基与细胞分开，再将一瓶稀释于14毫升DMEM/2％FBS中的N343 MSC X加入瓶中。将培养物置于空气罐中，排空，再充入氢气和二氧化碳得到由8.0％氧气、8.8％二氧化碳和83.2％氢气构成的混合物。培养物生长6天，从瓶上刮下细胞加至含90毫升DMEM/2％FBS和0.01克Cultispere-G珠的100毫升旋转瓶中。培养物在上述的气体浓度下生长。每周通过使培养基体积加倍而扩大瓶培养体积。培养物在旋转瓶中生长25天直至终体积为250毫升。
菌株N10494按与菌株N343相同方式进行生长。
收获培养物疫苗培养物通过在3000×g离心20分钟而收获培养物。将沉淀再悬浮于含10％FBS的蔗糖-磷酸盐-谷氨酸(SPG)溶液中，然后通过25规格(gauge)的针头4次。接种物在SPG/10％FBS中稀释到终体积(15毫升)。
激发培养物通过在3000×g离心20分钟而收获培养物。将沉淀再悬浮于含10％FBS的蔗糖-磷酸盐-谷氨酸(SPG)溶液中，然后通过25规格(gauge)的针头4次。接种物在SPG/10％FBS中稀释到终体积(N343菌株为20毫升，N101494菌株为10毫升)。
仓鼠的剂量疫苗在第0天，A组的所有仓鼠都口服接种1毫升制备的疫苗。
激发在接种后21天，A组的10只仓鼠和B组的10只仓鼠口服0.5毫升激发培养物菌株N343。C组用0.5毫升激发培养物菌株N101494进行免疫激发。
ISi的定量对活ISi的定量是通过确定50％组织培养感染剂量(Tissue culture InfectiousDose 50 percent，TCID50)而完成的。做法是取出2毫升待测试的培养物，通过22规格的针头4次使细胞裂解。样品在含万古霉素(100μg/ml)和两性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/5％FBS中进行连续1∶10的稀释。将稀释液按每孔0.1毫升加至96孔微量滴定板。在感染前，该板已用McCoys细胞按1250细胞/孔接种，并且在37℃和5％二氧化碳下生长18-24小时。每个稀释浓度使用12孔。板在8.0％氧气、8.8％二氧化碳和83.2％氮气中孵育6天。用冷的50％丙酮和50％甲醇固定细胞2分钟。向各孔中加入0.03毫升/孔抗-ISi单克隆抗体，该抗体已按1∶2000稀释于PBS中。板在37℃孵育30分钟，然后用PBS洗涤3次。按0.03毫升/孔加入已1∶30稀释的抗-鼠FITC，在37℃孵育30分钟。板用双蒸水洗涤3次，让其干燥。用荧光显微镜观察样品，确定TCID50/ml。
仓鼠感染的监测用Gary Jones所描述的循环参数和引物的PCR，监测仓鼠的感染。在接种后第0、7、14、21、29、36和43天收集排泄物样品。在杀死仓鼠后，其肠粘膜也用PCR检查。
组织病理学回肠和结肠的切片用福尔马林固定，用常规方法加工，用苏木精和曙红染色以及银浸渍，并且加以评估。切片还用对胞内劳森氏菌特异的单克隆抗体染色。
平均每日体重增加情况在接种后21、28、35和42天对仓鼠进行称重，以确定平均每日体重增加情况。结果参见下表。
TCID50TCID50数据显示，疫苗组(A组)接受104.86 TCID50/仓鼠。A组和B组的仓鼠用菌株N343进行激发，接受量为105.5 TCID50/仓鼠。用菌株N101494激发的C组仓鼠的接受量为102.75 TCID50/仓鼠。
PCRPCR测试显示，在接种后21天解剖的接种过的仓鼠中100％存在胞内劳森氏菌。在接种43天后的试验显示，对照仓鼠100％和接种过的仓鼠50％被胞内劳森氏菌感染。用N101494激发的仓鼠中没有一只呈PCR阳性。在该项对仓鼠的研究中没有观察排泄物滴落的情况。
组织病理学苏木精和曙红染色(H&E染色)揭示，在接种后21天被解剖的仓鼠的所有切片中没有组织损伤。在接种后43天后收集的切片中，疫苗组的50％有轻度至严重的淋巴细胞肠炎，对照组50％有轻度淋巴细胞肠炎。在N101494激发组中没有发现损伤。
FA染色不能显示在接种后43天的仓鼠中存在胞内劳森氏菌。
讨论PCR显示，在用高传代的胞内劳森氏菌菌株接种的仓鼠中，观察到感染率下降50％。
排泄物 排泄物 排泄物 排泄物 排泄物 排泄物 排泄物 粘膜微损伤粘膜PCR H&E染色 FAPcRPCRPCRPCRPCRPcRPCRPCR 银染ID0天7天14天 21天 29天 36天 43天 21天 43天A-1 - - - - - - - NA + 轻度肠炎 - -A-2 - - - - - - - NA - -- -A-3 - - - - - - - NA + 轻度肠炎 - -A-4 - - - - - - - NA - -- -A-5 - - - - - - - NA + -- -A-6 - - - - - - - NA - -- -A-7 - - - - - - - NA + 重度肠炎 - -A-8 - - - - - - - NA + 中度肠炎 - -A-9 - - - - - - - NA - -- -A-10 - - - - - - - NA - 轻度肠炎 - -A-11 - - - - NA NA NA +NA --A-12 - - - - NA NA NA +NA -- -A-13 - - - - NA NA NA +NA -- -A-14 - - - - NA NA NA +NA -- -A-15 - - - - NA NA NA +NA -- -B-1 - - - - - - - NA + 最低程度肠炎 - -B-2 - - - - - - - NA + 最低程度肠炎 - -B-3 - - - - - - - NA + -- -B-4 - - - - - - - NA + 最低程度肠炎 - -B-5 - - - - - - - NA + 最低程度肠炎 - -B-6 - - - - - - - NA + 最低程度肠炎 - -B-7 - - - - - - - NA + -- -B-8 - - - - - - - NA + -- -B-9 - - - - - - - NA + -- -B-10 - - - - - - - NA + -- -B-11 - - - - NA NA NA -NA -- -B-12 - - - - NA NA NA -NA -- -B-13 - - - - NA NA NA -NA -- -
B-14 ----NA NA NA - NA ---B-15 ----NA NA NA - NA ---C-1-------NA----C-2-------NA----C-3-------NA----C-4-------NA----C-5-------NA----C-6-------NA----C-7-------NA----C-8-------NA----C-9-------NA----C-10 -------NA----实施例6猪疫苗有效性试验目的该研究的目的是评估胞内劳森氏菌的无毒力的活分离物和杀灭的分离物在2-3周大小的猪中的安全性、移生持续性和有效性。进行宿主动物研究，在该研究中，接种3周龄的猪，然后将其用胞内劳森氏菌菌株N343进行有毒力的免疫激发，以比较疫苗间保护的差异。
方法在1995年12月11日，从H&K农场购得总计45头3周龄的猪。它们被运至Veterinary Resources，Inc.，这是一个位于Cambridge，Iowa的研究机构，在这里猪被打上标记以区分每头猪。在进行研究之前，猪在该机构关2天以便适应环境，在研究过程中给猪喂养的是无抗生素的饲料。
在12月13日，所有的猪都称重、抽血采集血清、临床打分并收集直肠化验样品。猪被随机地分成5组，并置于盆中。20头猪被置于一间单独的房间，用作对照和严格对照组。15头猪被置于第二间房间，进行ISi-1疫苗试验。第三间房间有10头猪，用于ISi-2疫苗试验。
活疫苗在NOBL Laboratories Research and Development机构进行制备，被称为试验系列ISi-1。ISi-1(菌株N343)是从猪中分离出并在纯培养物中连续生长29周。疫苗在旋转瓶中的McCoys细胞上，于低氧浓度下生长直至观察到约100％感染。用于ISi-1的高传代N343菌株旋转瓶再传代11周(“N343NP40wk”)，按照布达佩斯条约，于1996年5月22日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC，12301 ParklawnDrive，Rockville，Maryland U.S.A 20 852)，保藏号为55783。通过在3000×g上离心20分钟而收获培养物。将沉淀再悬浮于蔗糖-磷酸盐-谷氨酸(SPG)溶液中，然后通过25规格的针头4次。裂解液在500×g下离心约5分钟形成沉淀以除去碎片和微载体珠。收集上清液，储藏于-70℃，直到接种前1小时才取出，置于冰上以供施用。
灭活的疫苗(ISi-2)按上述类似方式生长、传代12.5周并收获，然后用percol梯度进行纯化。纯化的细菌接着储藏于-70℃，直到接种前1小时才取出，将其储藏在4℃和一般的大气氧浓度下，这种氧浓度对胞内劳森氏菌是有毒性的。将氢氧化铝加入细菌至最终混合物含有10％氢氧化铝。用Biurett法测定蛋白质浓度。
活ISi的定量对活胞内劳森氏菌的定量是通过确定50％组织培养感染剂量(TCID50)而完成的。做法是在感染前，96孔微量滴定板用McCoys细胞按1250细胞/孔接种，然后生长18-24小时。样品在含万古霉素(100μg/ml)和两性霉素B(2.0μg/ml)的DMEM/5％FBS中进行连续1∶10的稀释。将稀释液按每孔0.1毫升加至96孔微量滴定板。每个稀释浓度使用12孔。板于37℃，在8.0％氧气、8.8％二氧化碳和83.2％氮气中孵育6天。用冷的50％丙酮和50％甲醇固定细胞2分钟。向各孔中加入0.03毫升/孔抗-胞内劳森氏菌单克隆抗体(由Dr.Steven McOrist开发)，该抗体已按1∶2000稀释于PBS中。板在37℃孵育30分钟，然后用PBS洗涤3次。按0.03毫升/孔加入已1∶30稀释的抗-鼠免疫球蛋白G-荧光团共轭物(FITC)，在37℃孵育30分钟。板用双蒸水洗涤3次，让其干燥。用荧光显微镜观察样品，用Reed-Meunsch计算法确定TCID50/ml。
TCID50数据显示，ISi-1有1.8×105细菌/毫升。第四种接种物是安慰剂，它来自用与疫苗相同方式加工的组织培养细胞。
用Biurret法测定灭活的疫苗的总蛋白质含量，为0.311毫克/毫升。
在1995年12月13日给猪接种。活疫苗的剂量为2毫升IN，每个鼻孔1毫升。ISi-2(灭活的)疫苗以肌肉注射方式施用，为1.5毫升/每头猪，并在14天后再进行一次。所有的对照动物都按与活疫苗相同方式使用未感染的细胞。
观察和样品在研究过程中，每隔7天收集排泄物样品和血清。对排泄物样品进行PCR试验以扩增DNA，所用引物对为5’-TATGG CTGTC AAACA CTCCG-3’和为5’-TGAAG GTATT GGTATTCTCC-3’。循环的第一个循环为93℃，5分钟；55℃，45秒；和72℃45秒。33个循环是在上述各温度下各进行45秒。最后一个循环为93℃，45秒；55℃，45秒；和72℃2分钟。引物由Jones等人确定。
免疫激发所有的动物，除了严格对照之外，都在接种后26和27天给予激发培养物，该激发培养物由胞内劳森氏菌菌株N343和N72994的低传代培养物(连续生长8-12周)构成。通过在3000×g上离心20分钟而收获培养物。将沉淀再悬浮于含10％胎牛血清的蔗糖-磷酸盐-谷氨酸(SPG)溶液中，然后通过25规格的针头4次。部分收获的培养物储藏于-70℃直到用于激发，而其他继续生长直到免疫激发当天，然后收获。混合激发接种物，测定培养物的TCID50。样品储藏于冰上以供施用。
96年1月8日的激发培养物含有4×104细菌/毫升，而96年1月9日的激发培养物含有3×104细菌/毫升。这两天都通过洗胃给猪施用15毫升激发疫苗。因此，动物在96年1月8日和96年1月9日分别接受6×105细菌/猪和4.7×105细菌/猪。
结果安全性排泄物PCR结果用PCR检测胞内劳森氏菌显示，没有猪在研究开始时排泄细菌。在接种后7天，所有的猪呈阴性。在接种后14天，在ISi-1组中3头猪呈阳性。在接种后21天，在ISi-1组中2头猪呈阳性，其他所有的猪呈阴性。用PCR检测显示，没有动物在接种后26天排泄细菌。在接种后26天，解剖ISi-1组中的5头猪和ISi-2组中的4头猪。收集的样品是回肠、结肠、肠系淋巴结和扁桃体以及肺样品(来自可能有肺炎损伤的猪)。
对各回肠和肺样品进行PCR试验。按各处理组混合扁桃体、结肠和淋巴结，并进行PCR。PCR结果如下。
对回肠组织切片进行染色，其中使用对胞内劳森氏菌特异的单克隆抗体作为第一抗体，使用抗-鼠免疫球蛋白G-荧光团共轭物作为第二抗体。在5头来自ISi-1的猪中有3头观察到胞内劳森氏菌。用荧光抗体染色检测，其他所有的猪都呈阴性。
剩余的猪在激发后21天解剖，收集相同的样品用于评估。PCR结果如下。
如上对回肠进行FA染色，在对照组的10只动物中有7只为阳性。对于是否存在胞内劳森氏菌，其他所有动物都呈阴性。
还测试了血清，以确定猪暴露于胞内劳森氏菌后产生的IgG抗体产量。该试验是这样进行的在感染前，将McCoys细胞按1250细胞/孔接种于已用组织培养物处理过的Terasak i板，然后生长18-24小时。将胞内劳森氏菌纯培养物在含5％胎牛血清的DMEM中稀释至1000-3000细菌/毫升，按每孔0.1毫升加至各孔中。板在8.0％氧气、8.8％二氧化碳和83.2％氮气中孵育6天。用冷的50％丙酮和50％甲醇固定细胞2分钟。猪血清按1∶75稀释于无菌PBS。将稀释的血清按每孔0.01毫升加至各孔中。板在37℃孵育30-60分钟，然后用无菌PBS洗涤5次。按0.01毫升/孔向各孔加入抗-猪免疫球蛋白G-荧光团共轭物，板在37℃孵育30分钟。板用双蒸水洗涤5次，让其干燥。样品用双蒸水洗涤5次，让其干燥。用荧光显微镜观察样品，观察到细菌的孔被记为阳性，没有观察到细菌的孔被记为阴性。
结果
在第0天呈阳性的动物每周再次测试。结果显示，在接种后14天血清都呈阴性。这是预料之中的，因为在第0天时猪仅3周大�。谡庵帜炅湎碌难粜钥赡苁怯赡柑宓目固逶斐傻�。
测试血清时所用的阳性对照血清是通过用在纯培养物上生长的胞内劳森氏菌高剂量地免疫猪而获得的。使用的阴性对照血清是从South Dakota State University的无菌猪上采集的。
上述描述和实施例仅用于阐述可实现本发明目的、特征和优势的优选例子，不可理解为本发明局限于此。在所附权利要求书主旨和范围之内的本发明的任何变动形式都被认为是本发明的一部分。
权利要求
1.一种产生减毒胞内劳森氏菌菌株的方法，其特征在于，包括获得用胞内劳森氏菌细菌感染的培养细胞，在氧浓度为0-18％下孵育该感染细胞，搅拌该感染细胞，从而培养胞内劳森氏菌，同时维持该细胞处于悬浮状态，使至少一部分该培养细菌传代，收获至少一部分该培养的细菌，选择减菌株以提供减毒的胞内劳森氏菌细菌。
2.采用权利要求1所述的方法制得的减毒菌株，其特征在于，所述菌株在连续培养至少150-250天后获得，在此期间，培养物至少传代7-12次。
3.一种用于在动物中诱导针对胞内劳森氏菌细菌的免疫应答的疫苗，其特征在于，含有减毒的胞内劳森氏菌细菌和药学上可接受的载体，其中该减毒菌株的数量能有效地产生免疫应答，所述疫苗含有50-500微克的免疫原，且使用纯化的细菌。
4.如权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗含有107-109TCID50的免疫原。
5.如权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述载体选自水性溶液、乳液或悬浮液。
6.如权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗含有权利要求2所述的减毒菌株。
7.如权利要求3所述的疫苗，其特征在于，该减毒菌株是用权利要求1所述的方法产生的。
8.如权利要求3所述的疫苗，其特征在于，该被胞内劳森氏菌感染的培养细胞是通过用胞内劳森氏菌感染动物的肠组织匀浆而制备的。
9.如权利要求3所述的疫苗，其特征在于，该减毒菌株是菌株ATCC 55783。
10.权利要求3所述的的疫苗的用途，其特征在于，用于制备治疗劳森氏菌感染用的药剂。
全文摘要
本发明公开了一种大规模培养胞内劳森氏菌下部并使其减毒的方法，它包括用胞内劳森使菌细菌接种细胞以感染细胞，将感染细胞在较低氧浓度下培养并维持感染细菌处于悬浮状态。用悬浮液中生长的培养物制备抗胞内劳森氏菌疫苗。还公开了诊断试剂。
文档编号G01N33/53GK1519311SQ200310116358
公开日2004年8月11日 申请日期1996年11月12日 优先权日1996年6月4日
发明者J·P·克尼特尔, J P 克尼特尔, M·B·鲁夫, 鲁夫 申请人:诺博实验室股份有限公司
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