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专利名称：坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷含量的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种海洋生物有效成分的定量检测方法，具体指一种坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷含量的方法。
背景技术：
红藻糖苷，英文名为O-α-D-galactopyranosylglycerol,其分子式为 C9H18O8,分子量为254，是一类半乳糖甘油类糖苷异构体，目前存在三种异构形式，分别为红藻糖苷(a -D-半乳糖基-(I — 2) -D-甘油，f loridoside)、D型异红藻糖苷(a -D-半乳糖基- (I — I)-D-甘油，D-1sof loridoside)和L型异红藻糖苷(a -D-半乳糖基-(I — I) -L-D-甘油,L-1sof loridoside)。
红藻中一般缺少大多数光合自养生物累积的游离单糖和寡糖，而以一种特殊的低分子红藻苷糖游离状态存在。上个世纪初，Kylin首次报道分离出这种糖苷类物质，此后Colin等证明其结构为α -氧-甘油-D-半乳卩比喃糖苷。依据Majak等和Cra] gie等报道，在以红藻为材料的放射性同位素标记试验中，红藻糖苷标记得快，标记量大，说明红藻糖苷是红藻重要的光合同化产物，所以分析红藻中的红藻糖苷，对于研究红藻的光合作用、碳代谢及其它生理生化过程具有重要意义。此外，Reed和Kasten等报道了红藻糖苷在调节渗透压方面重要作用，特别在高渗条件下，这类糖苷的浓度会急剧增加。另外Kirst等经过多年研究发现大多数红藻中都含有红藻糖苷，并起到调节渗透压的作用，除了仙菜目(海人草素起类似作用)。紫菜是我国最重要的经济海藻之一，近年来随着全球气候变暖等自然和人为因素的影响，致使紫菜幼苗烂苗或成菜烂菜、减产，严重威胁着紫菜养殖业的持续发展。因此为适应我国海藻，特别是紫菜的生理和生态研究发展，建立红藻糖苷的分析方法是十分必要的。
目前关于这种红藻糖苷和异红藻糖苷的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和气相色谱质谱联用法(GC-MS)。Colin等利用液相色谱研究在不同盐度培养条件下鲂生蜈蚣藻中的红藻糖苷含量变化情况。范晓等利用衍生气相色谱法对龙须菜中红藻糖苷进行定性定量研究。Reed等采用GC-MS和核磁共振(NMR)方法分析鉴定了红藻中的红藻糖苷的结构。上述方法不仅检测时间长，而且样品检测前处理步骤复杂。发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种样品进行处理简单且检测用时短的检测坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷的方法，其利用液相色谱-三重四级杆串联质谱联用技术选择反应监测模式(HPLC-QqQ-SRM-MS)，对坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷能够操作简便、快速且灵敏度高的进行定量检测。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:该利用液质联用方法检测坛紫菜中红藻糖苷含量的方法，其特征在于:包括以下步骤:
(一)、样品处理过程:
取Ig坛紫菜粉和4 6ml纯度为65 75wt%的乙醇于反应瓶中，用铝箔纸封口 ；置于水浴摇床，在110 130转/分、65 75°C下水浴5 7小时，取出；
过滤得到的固相用热乙醇(60 70°C)冲洗2 4次,每次10 20mL ；
过滤所得冲洗液，过滤得到的液相在4500 5500转/分下离心8 12分钟，取液相置于烧瓶中，旋转蒸干后，用0.4 06ml乙腈和0.4 06ml水溶解，得到的溶液用0.40 0.50 μ m滤膜过滤，得到的液相部分即为待测样品。
(二 )、检测:
液相色谱和质谱条件:
(I)所用仪器:TSQ Quantum Access液相色谱_三重四极杆质谱联用分析系统；
(2)液相条件:固定相为 Waters XBridgeTM Amide 柱(IOOmmX 3.0mm, 3.5 μ m);流动相为体积比为90:10的乙腈-0.1%乙酸铵水溶液等度洗脱；进样量10 μ L，柱温40°C ；
(3)质谱条件:采用电喷雾电离源负离子电离模式，喷雾电压2.5KV，鞘气流量25L/min,辅助气流量5L/min，离子传输毛细管温度350°C，扫描采用选择反应监测SRM模式，母尚子为[M-H]-尚子m/z277,子尚子m/zll9和89,碰撞能量分别为20eV和2IeV,米集时间均为0.2s,碰撞气采用気气,碰撞气压力1.5mTorr ；Q1和Q3分辨率均设定为半峰宽0.7Da ；
权利要求
1.一种利用液质联用方法检测坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷含量的方法，其特征在于:包括以下步骤: (一)、样品处理过程: 取Ig坛紫菜粉和4 6ml纯度为65 75wt%的乙醇于反应瓶中，用铝箔纸封口 ；置于水浴摇床，在110 130转/分、65 75°C下水浴5 7小时，取出； 过滤得到的固相用热乙醇(60 70°C )冲洗2 4次，每次10 20mL ； 过滤所得冲洗液，过滤得到的液相在4500 5500转/分下离心8 12分钟，取液相置于烧瓶中，旋转蒸干后，用0.4 06ml乙腈和0.4 06ml水溶解，得到的溶液用0.40 0.50 μ m滤膜过滤，得到的液相部分即为待测样品。
(二)、检测: 液相色谱和质谱条件: (O所用仪器:TSQ Quantum Access液相色谱-三重四极杆质谱联用分析系统； (2)液相条件:固定相为Waters XBridgeTM Amide 柱(IOOmmX 3.0mm, 3.5 μ m);流动相为体积比为90:10的乙腈-0.1%乙酸铵水溶液等度洗脱；进样量10 μ L，柱温40°C ； (3)质谱条件:采用电喷雾电离源负离子电离模式，喷雾电压2.5KV，鞘气流量25L/min，辅助气流量5L/min，离子传输毛细管温度350°C，扫描采用选择反应监测SRM模式，母离子为[M-H]-离子m/z277，子离子m/zll9和89，碰撞能量分别为20eV和21eV，采集时间均为0.2s，碰撞气采用氩气，碰撞气压力1.5mTorr ；Q1和Q3分辨率均设定为半峰宽0.7Da ； (三)、绘制标准曲线绘制； (四)、按步骤(二)的条件测定待测样品，记录待测样品的峰面积，和峰面积-浓度标准曲线比对； (五)、结果计算: 红藻糖苷和异红藻糖苷的含量X=C*V*n/m, 式中: X一样品中红藻糖苷和异红藻糖苷的含量，单位μ g/mg; C 一将液质方法检测到的峰面积代入相应的标准曲线，即可计算得到测液中红藻糖苷和异红藻糖苷浓度，单位为μ g/mL ; V—待测液体积，单位为mL ； η—待测液稀释倍数 m一样品质量，单位为mg。
2.根据权利要求1所述的利用液质联用方法检测坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷含量的方法，其特征在于所述标准曲线的绘制方法如下: 红藻糖苷标准品为红藻糖苷和异红藻糖苷混合物，其中异红藻糖苷的纯度为8.1%，红藻糖苷的纯度为91.9% ;分别称取1.0 μ g、5.0 μ g、10.0 μ g、50.0 μ g和100.0yg该混合标准品，分别用ImL体积比为1:1的乙腈/水溶液配置，得到异红藻糖苷浓度分别为0.0Syg/mL、0.4 μ g/mL、0.8 μ g/mL >4.1 μ g/mL 和 8.I μ g/mL,红藻糖苷浓度分别为 0.92 μ g/mL、.4.6 μ g/mL,9.2 μ g/mL,45.9 μ g/mL和91.9 μ g/mL的标准溶液，然后在步骤(二)中的色谱和质谱条件下测定，记录峰面积，绘制峰面积-浓度标准曲线，即得到所述的标准曲线。
全文摘要
本发明涉及一种利用液质联用方法检测坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷含量的方法，其特征在于包括以下步骤样品处理、液相色谱和质谱检测条件设置、标准曲线绘制、测定待测样品、结果计算等步骤。与现有技术相比，本发明用于坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷的定量检测，样品处理和检测方法简单、快速，准确度和灵敏度高，重复性好；红藻糖苷和异红藻糖苷的标准溶液在0.08μg/mL～91.9μg/mL之间线性良好。
文档编号G01N30/88GK103207256SQ20131008125
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月13日 优先权日2013年3月13日
发明者李薇, 陈娟娟, 陈海敏, 严小军, 徐继林, 杨锐 申请人:宁波大学