专利名称：细胞核插入诱变选育高产光合制氢莱茵衣藻的方法
技术领域：
本发明涉及生物制氢技术，具体地说是细胞核插入诱变选育高产光合制氢莱茵衣 藻的方法。
背景技术：
生物光合制氢是未来清洁能源可持续生产的重要途径之一，包括莱茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)在内的许多微型绿藻和蓝藻可以在缺氧的条件下诱导细胞 核内的氢酶(H2ase)基因表达，氢酶被运到叶绿体中，将光合作用中产生的H+和e_合成H2， 释放到细胞外，是利用太阳能持续生产氢气的理想模式。莱茵衣藻生长速度快，培养成本 低，氢酶活性高，是很有开发潜力的微藻光合制氢藻种。氢酶对氧气敏感而导致莱茵衣藻产 氢率低，是限制这一技术产业化的重要原因。现有技术已经对莱茵衣藻产氢代谢的过程和 培养条件有了比较深入的研究，但是莱茵衣藻的产氢代谢过程与光合电子传递、非光合电 子传递、淀粉代谢、呼吸代谢、发酵代谢和光合作用等多个代谢过程关系密切，其产氢量很 大程度上受这些代谢的影响，所以一直无法解决莱茵衣藻产氢率低的技术难题。现有的莱茵衣藻产氢率低，限制了生物光合制氢技术的应用和发展。为了减轻环境污染、促进人类社会长久持续发展、开发新的清洁能源，发明一种生 物制氢产量高的莱茵衣藻——细胞核插入诱变选育高产光合制氢莱茵衣藻的方法是十分 重要的。为了获得具有应用价值的高产氢莱茵衣藻工程藻种，本发明利用线性化的 PSP124S质粒DNA对莱茵衣藻细胞核进行随机插入诱变，在世界上首次获得了一个产氢量 提高约7倍的高产氢莱茵衣藻突变株，而且该高产氢莱茵衣藻生长未受到抑制。本发明方 法得到的高产氢莱茵衣藻突变株是世界生物制氢领域长期寻求的目标，同时该莱茵衣藻突 变株为利用其深入研究莱茵衣藻产氢代谢机理和进一步利用基因工程手段提高莱茵衣藻 产氢效率提供了良好的实验材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞核插入诱变选育高产光合制氢莱茵衣藻的方法。本发明的目的是这样实现的一种细胞核插入诱变选育高产光合制氢莱茵衣藻的方法，步骤如下(1)莱茵衣藻培养A、选取细胞壁缺欠型莱茵衣藻藻种cc849 ；B、培养莱茵衣藻藻种(a)莱茵衣藻培养条件温度25 士 1°C ；日光灯光照强度100 200微摩尔光量子 /平方米 秒；50 100ml三羟甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸盐TAP培养基液体培养，初始 PH7. 2，水平摇床转速100 130rpm，每5 6天接种继代培养；(b)固体平板TAP培养基琼脂粉1. 5% ；挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法接种在平板上保存和纯化藻种，每3周继代一次；C、莱茵衣藻产氢培养条件使用氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌制备缺硫TAP培 养基；将生长至对数期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用缺硫培养 基洗3次，悬浮在缺硫培养基内，分别装入培养瓶，培养瓶上方留100ml的空间，用翻口橡皮 塞密闭；黑暗条件下培养24小时；然后放在光照强度50 100微摩尔光量子/平方米 秒 连续光照件下培养，温度25士 1°C ；每24小时进行气体成分和含量检测一次；用气相色谱仪测定氢气和氧气含量分子筛型号5X1/8，柱长2m，内径3mm，热导 检测器TCD，以氩气作为载气，柱温50°C，进样温度200°C，热导检测温度300°C;测气体的组 成和含量；(2)莱茵衣藻细胞核转化载体和玻璃珠的准备A、取过夜培养的含有载体pSP124S质粒的大肠杆菌菌液，4°C下12000rpm离心 lmin收集菌细胞；进行载体pSP124S DNA的提取和纯化，_20°C冰箱保存备用；B、质粒pSP124S的线性化用限制性内切酶Kpnl酶切上述提取纯化的质粒 PSP124S DNA,使pSP124S质粒DNA线性化，酶切后的质粒DNA用DNA凝胶回收试剂盒回收 纯化；分光光度计法测量浓度和纯度；C、玻璃珠的准备取直径0.45 0.52 iim玻璃珠，超净台中用无菌去离子水冲洗 三次，250°C烘干2h;分装于1.5毫升离心管中，121°C高温灭菌20min，密封备用；(3)莱茵衣藻细胞核转化和转化子筛选A、莱茵衣藻细胞核的转化取对数生长期中后期的莱茵衣藻，25°C下4000rpm离 心5min收集藻细胞，用新鲜三羟甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸盐TAP洗三次；再用新鲜TAP 重悬藻细胞使细胞浓度为2X108个细胞/ml ；吸取衣藻悬浮液到内装已灭菌玻璃珠的试管 里，取5 y g纯化好的线性化质粒PSP124S的DNA加入试管内混合，振荡器强烈震荡、45度斜 角旋涡振荡15 30秒；取混合藻液，转移到培养管中，加入无菌新鲜TAP培养液，25°C下水 平摇床lOOrpm震荡、过夜黑暗培养；B、莱茵衣藻转化子的筛选取上述过夜培养的莱茵衣藻细胞在室温下4000rpm离 心5min收集藻细胞，用0. 5ml新鲜TAP液体培养基重悬，涂在含腐草霉素和琼脂的TAP培 养基固体平板上，25 °C、100 200iimolphotons m^s"1光照、培养3 4周，平板上长出绿 色的单克隆藻落；挑取有抗性的单藻落在选择培养基上多次继代培养；分别进行产氢培养 并检测产氢量和耗氧量，使用氢气和氧气标准品定义所测气体的组成和含量；对产氢量变 化大的转化子进行分子鉴定；(4)分析莱茵衣藻转化子产氢培养的产氢量和耗氧量在缺硫培养基中分别对得到的转化子进行产氢培养，并检测密封瓶子上方封存的 空气中的氢气和氧气含量；与未转基因莱茵衣藻cc849相比较，得产氢量明显增加的莱茵 衣藻突变株最高产氢量为3386.4iU mg_1Chl，是未转基因的衣藻cc849的最高产氢量 433. 6 u 1 mg_1Chl的7. 8倍；产氢培养体系中氧气含量为0. 2%，未转基因的衣藻cc849的 最低氧气含量1.4% ；(5)分析莱茵衣藻突变株中ble基因的整合及其表达A、莱茵衣藻总DNA的提取取对数生长后期的衣藻培养液，4°C低速离心收集，加 入由 O.lmol/L NaCl,50mmol/L EDTA, 20mmol/LTris-HCl, pH 8. 0 组成的 NET 蛋白提取液重悬沉淀，加入25 ill 10mg/ml的蛋白酶K及25yl 20% SDS，混勻、37°C水浴过夜，冰上冷 却；加入200 yl 5mol/L KAc，冰上静置后高速离心，上清中加入等体积的酚/氯仿/异戊 醇体积比为25 24 1的溶液抽提2次；再用等体积的氯仿抽提，总DNA用无水乙醇沉淀 和70%乙醇洗涤，干燥后溶于30 yl TE缓冲液，用于下述PCR检测备用；B、ble基因整合到莱茵衣藻突变株Ml细胞核DNA上的检测以具有腐草霉素抗 性的莱茵衣藻转化子的总DNA为模板；用于扩增ble基因的特异性引物是ble-F :5’ -CAA GCT GAC CAG CGC CGT TC-3’ ；ble-B :5’ -CAC GAA GTG CAC GCA GTT G-3’ ；PCR 反应条件 为94°C预变性5min，一个循环；94°C变性lmin，62°C退火30s，72°C延伸lmin ；共30个循 环；72°C延伸lOmin ；PCR产物分别用QIAGEN试剂盒纯化回收，并测序鉴定正确性；C、莱茵衣藻突变株Ml中ble基因转录的检测取对数生长期中期的莱茵衣藻 lml，室温4000rpm离心5分钟收集藻细胞；提取莱茵衣藻的总RNA和合成cDNA，利用上述 ble基因的特异性引物和ble基因PCR条件进行扩增，ble基因转录水平检测，转录的ble 基因RT-PCR产物电泳条带约为400bp ；(6)分析重组豆血红蛋白hemH-lba基因对莱茵衣藻生长的影响A、用双光束紫外可见光分光光度计检测莱茵衣藻在750nm处的吸光度； B、取藻液3000rpm离心5min收集藻细胞，加入同体积的95 %乙醇溶液，混合均勻， 室温避光放置20min，4°C下12000rpm离心lOmin ；取上清，测定0D665及0D649的吸光值；C、计算总叶绿素的含量，单位mg/L 叶绿素ChL = 20. 04X0D649+6. 10X0D665。本发明方法的要点是选细胞壁缺欠型莱茵衣藻藻种cc849 ；莱茵衣藻藻种培养条件温度25士 1°C 日 光灯光照强度100 200微摩尔光量子/平方米 秒(i! molphotonsnT2 s—1) ；50 100ml 三羟甲基氨基甲烷_乙酸-磷酸盐(Tris-Acetate-Phosphate简称TAP)培养基液体培养， 初始pH7. 2，水平摇床转速100 130rpm，每5 6天1 %接种继代培养；固体平板TAP培养基琼脂粉1. 5%;挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法 接种在平板上保存和纯化藻种，每3周继代一次；莱茵衣藻产氢培养条件在缺硫培养基中进行，把正常的TAP培养基的硫酸镁、硫 酸铁、硫酸铜和硫酸锌分别换为等摩尔的氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌；将生长至对数 期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用缺硫培养基洗3次，悬浮在缺硫 培养基内，分别装在培养瓶内，培养瓶上方留10ml的空间，用翻口橡皮塞密闭；黑暗条件下 培养24小时，然后放在连续光照件下培养，光照强度50 100微摩尔光量子/平方米 秒 (umol photons mH，温度25士 1°C ；每24小时进行气体成分和含量检测一次；用气相色谱仪测定氢气和氧气含量分子筛型号5X1/8，柱长2m，内径3mm，热导 检测器TCD，以氩气作为载气，柱温50°C，进样温度200°C，热导检测温度300°C;使用上海基 量标准气体有限公司氢气和氧气标准品定义所测气体的组成和含量。莱茵衣藻细胞核转化载体的准备和玻璃珠的准备质粒pSP124S的提取纯化通过本领域熟练技术人员所公知的标准方 法(Sambrook 等，Molecular Cloning. New York :Cold Spring HarborLaboratory Press. 1998)和Lumbreras等对莱茵衣藻细胞核转化及其载体pSP124S描述的方法(The Plant Journal, 1998,14 441-448)以及 TIANGEN 质粒提取试剂盒(TIANpr印 Mini kit)操作说明书进行载体PSP124S DNA的提取和纯化。具体地，取1 5mL过夜培养的含有 PSP124S质粒的大肠杆菌菌液，4°C下12000rpm离心lmin收集菌细胞，然后按照TIANGEN 质粒提取试剂盒(TIANpr印Mini kit)操作说明书进行载体pSP124S DNA的提取和纯化， 于-20°C冰箱保存备用。 质粒pSP124S的线性化按照本领域熟练技术人员所公知的标准方法(Sambrook 等，Molecular Cloning. New York Co Id Spring HarborLaboratory Press. 1998)用限制 性内切酶Kpnl酶切上述提取纯化的质粒pSP124S DNA,使pSP124S质粒DNA线性化，酶切 后的质粒DNA用TIANGEN公司DNA凝胶回收试剂盒回收纯化，用本领域技术人员所公知的 分光光度计法测量浓度和纯度，用于莱茵衣藻细胞核转化。玻璃珠的准备玻璃珠直径为
0.45 0. 52 ii m,在超净台中用5ml无菌去离子水冲洗三次，250°C烘干2h，按0. 3g分装于
1.5ml的印pendorf管中，121 °C高温灭菌20min，密封备用。
莱茵衣藻细胞核转化和转化子筛选莱茵衣藻细胞核的转化通过Kindle (Proc. Natl Acad. Sci. U SA. 1990，87 :1228 1232)的玻璃珠转化法对莱茵衣藻细胞核进行转化。具体地，取100ml生长至对数期中后期 (约4 5X 106)、细胞健康有活力的莱茵衣藻，25°C下4000rpm离心5min收集藻细胞，用 新鲜TAP洗三次，再用新鲜TAP重悬藻细胞使细胞浓度为2X 108个细胞/ml。吸取300 u 1 衣藻悬浮液到15ml的试管里，内装已灭菌的0. 3g玻璃珠，取5 y g纯化好的线性化质粒 PSP124S的DNA加入试管内，混合物在振荡器上以最大震荡强度、45度斜角旋涡振荡15 30秒。取混合藻液，转移到新的15ml的培养管中，加入10ml无菌的新鲜TAP培养液，25°C 下水平摇床lOOrpm震荡、过夜黑暗培养。莱茵衣藻转化子的筛选上述过夜培养的莱茵衣藻细胞在室温下4000rpm离 心5min收集藻细胞，用0. 5ml新鲜TAP液体培养基重悬，涂在含10mg L—1的腐草霉素 (Zeocin)和1. 5%琼脂的TAP (即选择培养基)固体平板上，25°C、100 200 y mol photons m^s-1光照、培养3 4周，平板上长出绿色的单克隆藻落，挑取有抗性的单藻落分别在选择 培养基上多次继代培养，然后分别进行产氢培养并检测产氢量和耗氧量，使用上海基量标 准气体有限公司氢气和氧气标准品定义所测气体的组成和含量，对产氢量变化大的转化子 进行分子鉴定。分析莱茵衣藻转化子产氢培养时的产氢量和耗氧量。在缺硫培养基中分别对本发明得到的105个转化子进行产氢培养，并检测密封 瓶子上方封存的空气中的氢气和氧气含量。结果表明，与未转基因莱茵衣藻cc849相比， 有一个本发明命名为Ml突变株，其产氢量明显增加，本发明条件下的最高产氢量约为 3386. 4 ill mg_1Chl，是未转基因的衣藻cc849的最高产氢量433. 6 yl mg_1Chl的7. 8倍， 见图3。突变株Ml的产氢培养体系中的氧气含量也最低，约为0.2%，而未转基因的衣藻 cc849的最低氧气含量为1.4%，见图4。分析莱茵衣藻突变株Ml中ble基因的整合及其表达莱茵衣藻总DNA的提取取10ml处于对数生长后期的衣藻培养液，4°C低速离心收 集，加 350 ill NET(0. lmol/L NaCl, 50mmol/L EDTA, 20mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)重悬沉 淀，加入 25 ii 1 lOmg/ml 的蛋白酶{((Proteinase K)及 25 ii 1 20% SDS，混勻并于 37°C水 浴过夜，冰上冷却，加入200 ill 5mol/L KAc，冰上静置后高速离心，上清中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25 24 1)抽提2次，再用等体积的氯仿抽提1次，总DNA用无水乙醇 沉淀和70%乙醇洗涤，干燥后溶于30 ill TE缓冲液，用于下述PCR检测。ble基因整合到莱茵衣藻突变株Ml细胞核DNA上的检测因为转化之前pSP124S 质粒DNA用限制性内切酶Kpnl酶切成线性，它只有整合到莱茵藻细胞核DNA上才能正确表 达ble基因，才能在含腐草霉素的TAP平板上筛选到具有抗性的转化子。所以，测定ble基 因存在于莱茵衣藻转化子中的合适方法是实施下文所述的PCR法以具有腐草霉素抗性的 莱茵衣藻转化子的总DNA为模板、以ble基因的特异性引物扩增的PCR产物应该有一条约 500bp的电泳条带，而未转基因的莱茵衣藻总DNA的PCR产物电泳结果则无条带。其中用于 扩增 ble 基因的特异性引物是 ble-F:5’-CAA GCT GAC CAGCGC CGT TC-3’ ;ble_B :5，-CAC GAA GTG CAC GCA GTT G_3，。PCR 反应条件为94°C预变性 5min，一个循环；94°C变性 lmin， 62°C退火30s，72°C延伸lmin ；共30个循环；72°C延伸lOmin。PCR产物分别用QIAGEN试剂 盒纯化回收，并测序鉴定正确性。莱茵衣藻突变株Ml中ble基因转录的检测按照本领域技术人员所公知的反转 录 PCR 的标准方法(Sambrook 等，Molecular Cloning. New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press. 1998)，取对数生长期中期的莱茵衣藻1ml左右，室温4000rpm离心5分 钟收集藻细胞。按照试剂盒制造商的产品说明书提取莱茵衣藻的总RNA(QIAGEN)和按照 Promega AMV RTProtocol说明书合成cDNA(Promega)，利用上述ble基因的特异性引物和 上述ble基因PCR条件进行扩增，进行ble基因转录水平的检测，正确转录的ble基因的 RT-PCR产物的电泳条带约为400bp。分析重组豆血红蛋白hemH-lba基因对莱茵衣藻生长的影响用TU-1901双光束紫外可见光分光光度计检测莱茵衣藻在750nm处的吸光度；取藻液3000rpm离心5min收集藻细胞，加入同体积的95 %乙醇溶液，混合均勻，室 温避光放置20min，4°C下12000rpm离心lOmin ；取上清，测定0D665及0D649的吸光值；计算总叶绿素的含量，单位mg/L 叶绿素 Chi (mg/1) = 20. 04X0D649+6. 10X 0D665 ；本发明的要点是利用线性化的pSP124S质粒DNA对莱茵衣藻细胞核进行随机插入 诱变而获得一个高产氢莱茵衣藻突变株的方法。本发明提供了一个利用线性化的PSP124S质粒DNA对莱茵衣藻细胞核进行随机插 入诱变而获得高产氢莱茵衣藻突变株Ml。本发明高产氢突变株Ml的产氢量提高了 7倍以上，其产氢培养体系中氧气含量也 明显降低，生长却未受到抑制。这种结果是世界生物制氢领域长期努力寻求而未能得到的 结果。本发明中pSP124S 质粒由 Saul Purton 教授(s. purtoniucl. ac. uk)提供，其序列 结构特征是按照Lumbreras等(Plant Journal. 1998，14 441-448)所描述的内容pSP124S 质粒具有pBluescript SK-基本骨架、RBCS2启动子、选择标记ble基因的编码区(编码腐 草霉素抗性蛋白)、3’ -RBCS2未翻译区。本发明提供的RBCS2启动子、选择标记b 1 e基因的编码区、3，-RBCS2未翻译区的基 因表达调控元件可以使ble基因稳定且高效的在莱茵衣藻细胞核内表达，使筛选转化子的 准确率和效率更高。所以优选是本发明所用的PSP124S质粒结构中的基因表达调控元件。本发明中PSP124S质粒DNA是按照本领域的技术人员所公知的方法从大肠杆菌中提取、纯化和进行限制性内切酶酶切为线性DNA。本发明中用于酶切pSP124S质粒DNA的限制性内切酶为Kpnl，但不限制于Kpnl， 只要它能够将PSP124S质粒DNA酶切开并且使RBCS2启动子、选择标记ble基因的编码区 和3’ -RBCS2未翻译区的连续结构未被酶切断开就可以。本发明所指的转化包括玻璃珠振荡转化法、基因枪转化法和电击转化法，更优选 的是玻璃珠振荡转化法。在利于表达载体导入的条件下，将直径0. 4-0. 5mm的玻璃珠和线 性pSP124S质粒DNA与健康的、生长对数期中期的莱茵衣藻细胞混勻，用漩涡振荡器最大速 度振荡15-30s，将含有包括RBCS2启动子、选择标记ble基因的编码区、3，-RBCS2未翻译区 连续结构的表达载体导入莱茵衣藻细胞核中。本发明中通过抗生素的选择性筛选出表达ble基因的莱茵衣藻转化子，进一步在 抗生素平板上多次继代培养，增加目的基因在莱茵衣藻细胞核DNA中的整合率，并进一步 筛选出产氢量高的转基因莱茵衣藻单克隆。本发明表达理解为将起始DNA或RNA的遗传信息转移至基因产物(多肽或蛋白 质，在本文中是ble基因编码的蛋白)。本发明所述转基因是将遗传信息转移至生物体，特别是莱茵衣藻。这意味着包括 引入所有对本领域熟练工作人员所公知信息的方法，例如粒子轰击、电穿孔、化学介导、玻 璃珠振荡或农杆菌介导的摄入、显微注射等。遗传信息可引入细胞，例如以DNA、RNA、质粒 或以任何其它方式，并且通过重组掺入宿主基因组的方式。为了本发明目的实现，转基因莱 茵衣藻是经过遗传修饰的莱茵衣藻。本发明具有如下优点1、本发明方法适用于所有产氢莱茵衣藻。2、本发明方法获得的高产氢莱茵衣藻突变株M1，生物制氢产量高。3、本发明方法获得的高产氢莱茵衣藻突变株Ml为深入研究莱茵衣藻产氢代谢机 理提供了良好的实验材料。4、本发明方法为进一步利用基因工程手段提高莱茵衣藻产氢效率提供了良好的 基础和条件。经广泛查阅国内外公开出版物，检索专利文献，未见有使用与本发明方法完全相 同的技术选育出与本发明Ml高产氢莱茵衣藻完全相同的产氢效果的发明；未见有与本发 明方法完全相同的报道。因此本发明具有新颖性和创造性；由于当代社会发展对清洁能源 的迫切需求，本发明在生物制氢技术领域的实验和研究中，具有极大的应用价值。
图1为莱茵衣藻细胞核转化载体PSP124S主要基因元件结构图。图2为对莱茵衣藻细胞核转化PSP124S线性DNA后在含10mg. L—1腐草霉素的TAP 平板上筛选莱茵衣藻转化子。其中A、B为具有腐草霉素抗性的莱茵衣藻转化子；C为继续 在含10mg. L—1腐草霉素的TAP平板上继代培养的莱茵衣藻转化子。图3为部分具有腐草霉素抗性的莱茵衣藻转化子在产氢培养条件下产氢量比较 图，其中突变株Ml的产氢量最高。图4为部分具有腐草霉素抗性的莱茵衣藻转化子在产氢培养条件下耗氧量比较图，产氢体系中突变株Ml的氧气含量最低。图5为莱茵衣藻突变株Ml细胞核中整合ble基因的PCR电泳图(以总DNA为 模版)。图中1 分子标记DL2000 ；2 未转基因莱茵衣藻cc849 ；3 突变株Ml ；4 质粒 PSP124S ；5 不含模版的阴性对照组。图6为莱茵衣藻突变株Ml细胞核中整合ble基因并转录的PCR电泳图(以cDNA 为模版)。图中1 分子标记DL2000 ；2 未转基因莱茵衣藻cc849 ；3 突变株Ml ；4 质粒 PSP124S ；5 不含模版的阴性对照组。图7为莱茵衣藻突变株Ml与未转基因莱茵衣藻cc849不同培养时间的吸光度比 较图。图8为莱茵衣藻突变株Ml与未转基因莱茵衣藻cc849不同培养时间的叶绿素含 量比较图。
具体实施例方式实施例1 莱茵衣藻的培养 莱茵衣藻生长速度快、培养成本低、氢化酶活性高，所以是微藻光合制氢的代表物 种。为了使转基因容易操作，本发明优选细胞壁缺欠型的莱茵衣藻藻种cc849。①莱茵衣藻正常培养条件按照Harris主编的《TheChlamydomonas Sourcebook a comprehensive guide to biology andlaboratory use.New York :Academic Press. 1989》，优选是在25 士 1°C，日光灯光照强度(100 200umol photons mY1)，液体 培养是在50 100ml Tris-Acetate-Phosphate (TAP)培养基，初始pH7. 2，水平摇床转速 100 130rpm，每5 6天1 %接种继代培养；固体TAP平板培养基含1. 5%的琼脂粉，藻种 的保存和纯化是挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法接种在平板上，每3周继代一 次。②莱茵衣藻产氢培养条件按照Melis等(Plant Physiology. 2000122 127-136) 的方法，莱茵衣藻的产氢培养是在缺硫培养基(TAP-S)中进行。缺硫培养基(TAP-S)是把 正常的TAP培养基的硫酸镁、硫酸铁、硫酸铜和硫酸锌分别换为等摩尔的氯化镁、氯化铁、 氯化铜和氯化锌。本实施例为了本发明在工业化生产中应用，有目的的简化了其产氢培养 的操作步骤即将生长至对数期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用 TAP-S培养基洗3次，然后悬浮在TAP-S培养基内，分别装在600ml的培养瓶内，培养瓶上方 留100ml的空间，立刻用翻口橡皮塞塞紧培养瓶密闭培养，先放在黑暗条件下培养24小时， 然后放在连续光照件下培养，光照强度50 100 iimol photons nrY1，温度25 士 1°C。每24 小时用微量气密进样器抽取瓶中气体，进行气体成分和含量检测。③按照冉春秋等(高等学校化学学报，2006，27:62-66.)的方法用GC测定氢气 和氧气含量。气相色谱仪为Agilent Technologies GC7890A, USA，分子筛型号5 X 1/8，柱 长2m，内径3mm，热导检测器TCD，以氩气作为载气。进样体积0. 5ml，柱温50°C，进样温度 200°C，热导检测温度300°C。用本领域熟练技术人员公知的外标法计算氢气和氧气体积。 氢气和氧气标准品为上海基量标准气体有限公司。实施例2
莱茵衣藻细胞核转化载体的准备和玻璃珠的准备①质粒pSP124S的提取纯化通过本领域熟练技术人员所公知的标准方 法(Sambrook 等，Molecular Cloning.New York CoId Spring HarborLaboratory Press. 1998)和Lumbreras等对莱茵衣藻细胞核转化及其载体pSP124S描述的方法(The Plant Journal, 1998,14 441-448)以及 TIANGEN 质粒提取试剂盒(TIANpr印 Mini kit) 进行载体PSP124S提取和纯化。具体地，取1 5mL过夜培养的含有pSP124S质粒的大肠 杆菌菌液，4°C下12000rpm离心lmin收集菌细胞，分别加入250 yl的PI (事先加入RNase A)和250 ill的P2，温和上下翻转6 8使菌体充分裂解；再加入350 ill的P3，立即温和 上下翻转6 8使菌体充分混勻，4°C下12000rpm离心lOmin，将上清液转移至吸附柱CB3 中，12000rpm离心lmin，用500 u 1去蛋白液PD清洗一次，再分别加入700 yl和500 yl漂 洗液PW清洗吸附柱CB3两次，12000rpm离心2min去除残留的漂洗液后，用50-100 u 1的洗 脱液EB洗脱吸附在吸附柱CB3上的质粒DNA，放入_20°C冰箱保存备用。②质粒pSP124S的线性化用限制性内切酶Kpnl酶切上述提取纯化的质粒pSP124S DNA，使质粒pSP124S DNA线性化(图1)，酶切后的质粒DNA用DNA凝胶回收试剂盒(TIANGEN公司)回收纯化，用 本领域熟练技术人员所公知的分光光度计法测量浓度和纯度，用于莱茵衣藻细胞核转化 DNA在紫外光区260nm处有最大吸收峰值(即0D260)，0D260值为1相当于40 y g mL-1单链 DNA。OD260/OD280 值大于 1. 8 为纯净 DNA。③玻璃珠的准备玻璃珠直径为0. 45 0. 52 um (Sigma)，在超净台中用5ml无菌去离子水冲洗三 次，250°C烘干2h，按0. 3g分装于1. 5ml的印pendorf管中，121 °C高温灭菌20min，密封备用。实施例3 莱茵衣藻细胞核转化和转化子筛�、倮骋鹨略逑赴说淖ü齂indle (Proc. Natl Acad. Sci. U S A. 1990，87 :1228 1232)的玻璃珠转化法 对莱茵衣藻细胞核进行转化，取100ml生长至对数期中后期(约4 5X 106)、细胞健康有 活力的莱茵衣藻，25°C下4000rpm离心5min收集藻细胞，用新鲜TAP洗三次，再用新鲜TAP 重悬藻细胞使细胞浓度为2X 108个细胞/ml。吸取300 u 1衣藻悬浮液到15ml的试管里， 内装已灭菌的0. 3g玻璃珠，取5 u g纯化好的线性化质粒pSP124S的DNA加入试管内，混合 物在WH-816 vortex shaker振荡器上以最大震荡强度、45度斜角旋涡振荡15 30秒。取 混合藻液，转移到新的15ml的培养管中，加入10ml无菌的新鲜TAP培养液，25°C下水平摇 床lOOrprn震荡、过夜黑暗培养。②莱茵衣藻转化子的筛选上述过夜培养的莱茵衣藻细胞在室温下4000rpm离心5min收集藻细胞，用0. 5ml 新鲜TAP液体培养基重悬，涂在含10mg L-1的腐草霉素(Zeocin)和1. 5%琼脂的TAP(即 选择培养基)固体平板上，25°C、100 200iimol photons m_2s_2光照、培养3 4周，平板 上长出绿色的单克隆藻落(图2，A、B)。挑取有抗性的单藻落分别在选择培养基上多次继 代培养(图2，C)，然后分别进行产氢培养并检测产氢量和耗氧量，使用氢气和氧气标准品(上海基量标准气体有限公司)定义所测气体的组成和含量。对产氢量变化大的转化子进 行分子鉴定。实施例4 分析莱茵衣藻转化子产氢培养时的产氢量和耗氧量因为在缺硫培养基中，莱茵衣藻PSII的活性受到抑制，但是呼吸作用不受影响， 在密封条件下莱茵衣藻液体培养基中的氧气含量因为呼吸消耗而快速下降，致使液体培养 基中出现缺氧状态，诱导莱茵衣藻氢酶表达而开始产生氢气，通过检测密封瓶子上方封存 的空气中的氧气和氢气含量变化情况就能反映出莱茵衣藻的耗氧和产氢情况。结果表明， 与未转基因莱茵衣藻cc849相比，本发明方法中所获得的105个莱茵衣藻转化子在产氢培 养条件下，有的产氢量增加，有的产氢量下降，有的产氢量无显著变化。本发明突变株Ml产 氢量明显增加，最高产氢量为3386. 4 ill mg_1Chl，未转基因的衣藻cc849的最高产氢量为 433.6iU mg_1Chl。相比突变株Ml产氢量为衣藻cc849的7. 8倍，见图3。突变株Ml的产 氢培养体系中的氧气含量最低，为0. 2 %，未转基因的衣藻cc849的最低氧气含量为1.4%， 见图4。实施例5:分析莱茵衣藻突变株Ml中ble基因的整合及其表达①莱茵衣藻总DNA的提取通过本领域熟练技术人员所公知的标准方法(Sambrook等，Molecular Cloning. New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press. 1998)禾口 Rochaix 禾口 Erickson 的方法 (Trends in Biochemistry Science，1988，13 :56_59)，提取衣藻总 DNA。取 10ml 处于对数 生长后期的衣藻培养液，4°C低速离心收集，加350 ill NET (0. lmol/L NaCl, 50mmol/LEDTA, 20mmol/L Tris_HCl，pH 8. 0)重悬沉淀，加入 25 yl lOmg/ml 的蛋白酶 K (Proteinase K)及 25 u 1 20% SDS，混勻并于37°C水浴过夜，冰上冷却，加入200 yl 5mol/L KAc，冰上静置后 高速离心，上清中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25 24 1)抽提2次，再用等体积的 氯仿抽提1次，总DNA用无水乙醇沉淀和70%乙醇洗涤，干燥后溶于30iU TE缓冲液，用于 下述PCR检测。②ble基因整合到莱茵衣藻突变株Ml细胞核DNA上的检测测定ble基因存在于莱茵衣藻转化子中的方法是PCR法。质粒PSP124SDNA用限制 性内切酶Kpnl酶切成线性，其转入衣藻细胞内后如果不整合到核DNA上则不能表达ble基 因的活性，则筛选不到据有腐草霉素抗性的转化子；如果ble基因通过随机插入的方式整 合到莱茵衣藻转化子的细胞核DNA上，则以具有腐草霉素抗性的莱茵衣藻转化子的总DNA 为模板、以ble基因的特异性引物扩增的PCR产物应该有一条500bp的电泳条带，而未转基 因的莱茵衣藻总DNA的PCR产物电泳结果则无条带，见图5。用于扩增ble基因的特异性引 物是 ble-F :5’ -CAA GCT GAC CAG CGC CGT TC-3’ ；ble-B :5’ -CAC GAA GTG CAC GCA GTT G-3，。PCR反应条件为94°C预变性5min，一个循环；94°C变性lmin，62°C退火30s，72°C延 伸lmin ；共30个循环；72°C延伸lOmin。PCR产物分别用QIAGEN试剂盒纯化回收，并测序 鉴定正确性。③莱茵衣藻突变株Ml中ble基因转录的检测检测ble基因在莱茵衣藻转化子中是否转录的合适方法是按照本领域熟练技术人员所公知的反转录PCR的标准方法(Sambrook等，MolecularCloning. New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1998)实施部分。莱茵衣藻的取样是取对数生长期中期 的莱茵衣藻1ml左右，室温4000rpm离心5分钟收集藻细胞。按照试剂盒制造商的产品说 明书(QIAGEN，Promega)提取莱茵衣藻的总RNA和按照Promega AMV RTProtocol说明书合 成cDNA，利用上述ble基因的特异性引物和上述ble基因PCR条件进行扩增，进行ble基因 转录水平的检测，正确转录的ble基因的RT-PCR产物的电泳条带约为400bp，见图6。实施例6:分析莱茵衣藻突变株Ml的生长情况本发明是通过测量转基因藻前后莱茵衣藻的细胞数和叶绿素含量的变化来比 较ble基因随机插入到莱茵衣藻细胞核DNA中后对莱茵衣藻转化子生长情况的影响。藻 细胞数和叶绿素含量的测定是参照Harris主编的《The Chlamydomonas Sourcebook :a comprehensive guide to biologyand laboratory use. New York :Academic Press. 1989》 方法，因为莱茵衣藻在750nm处的吸光度(0D75CI)与莱茵衣藻的细胞数正相关，所以用 TU-1901双光束紫外可见光光度计直接检测培养的莱茵衣藻在750nm处的吸光度作为莱茵 衣藻细胞数的生长指标。叶绿素含量的测定是取1ml藻液，4000rpm离心5min收集藻细胞， 加入同体积的95%乙醇溶液，混勻，室温避光放置20min后，4°C下12000rpm离心lOmin，取 上清，按比例稀释后，测定0D665及0D649的吸光值，根据下列公式计算出叶绿素a，叶绿素b 及总叶绿素的含量，单位是mg/L。叶绿素Chi (mg/1) = 20. 04X (0D649)+6. 10X (0D665)。图 7为莱茵衣藻突变株Ml与未转基因莱茵衣藻cc849不同培养时间的吸光度比较图。图8为 莱茵衣藻突变株Ml与未转基因莱茵衣藻cc849不同培养时间的叶绿素含量比较图。结果表明转基因莱茵衣藻Ml的生长未受到抑制。本发明的结果显示，利用线性化的pSP124S质粒DNA对莱茵衣藻细胞核进行随机 插入诱变，由于腐草霉素对衣藻具有很强的毒性，且PSP124S质粒经限制性内切酶酶切以 后为线性DNA，其转入到莱茵衣藻细胞核中以后，在毒性较强的腐草霉素选择压力下，只有 ble基因整合到莱茵衣藻细胞核DNA上才能有效复制和正确表达蛋白产物，才能在含有腐 草霉素的TAP平板上筛选到有抗性的莱茵衣藻突变株，利用此方法获得突变株的准确率很 高。通过对本发明获得的突变株进行产氢含量测定，得到一个产氢量提高7. 8倍的莱茵衣 藻突变株，且其产氢培养体系中的氧气含量也最低。该突变株为进一步利用其研究莱茵衣 藻产氢代谢机理提供了良好材料，并为进一步利用基因工程手段改造衣藻产氢能力提供良 好材料，具有极大的应用价值。以上所述本发明的实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本 发明可以有更改和变化。凡在本发明的原则之内，所作的任何修改、改进等，均应包括在本 发明的保护范围之内。
1权利要求
一种细胞核插入诱变选育高产光合制氢莱茵衣藻的方法，步骤如下(1)莱茵衣藻培养A、选取细胞壁缺欠型莱茵衣藻藻种cc849；B、培养莱茵衣藻藻种(a)莱茵衣藻培养条件温度25±1℃；日光灯光照强度100～200微摩尔光量子/平方米·秒；50～100ml三羟甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸盐TAP培养基液体培养，初始pH7.2，水平摇床转速100～130rpm，每5～6天1％接种继代培养；(b)固体平板TAP培养基琼脂粉1.5％；挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法接种在平板上保存和纯化藻种，每3周继代一次；C、莱茵衣藻产氢培养条件使用氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌制备缺硫三羟甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸盐TAP培养基；将生长至对数期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用缺硫三羟甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸盐TAP培养基洗3次，悬浮在缺硫培养基内，分别装入培养瓶，培养瓶上方留100ml的空间；用翻口橡皮塞密闭；黑暗条件下培养24小时；然后放在光照强度50～100微摩尔光量子/平方米·秒连续光照件下培养，温度25±1℃；每24小时进行气体成分和含量检测一次；D、用气相色谱仪测定氢气和氧气含量分子筛型号5×1/8，柱长2m，内径3mm，热导检测器TCD，以氩气作为载气，柱温50℃，进样温度200℃，热导检测温度300℃；测气体的组成和含量；(2)莱茵衣藻细胞核转化载体和玻璃珠的准备A、取过夜培养的含有载体pSP124S质粒的大肠杆菌菌液，4℃下12000rpm离心1min收集菌细胞；进行载体pSP124S DNA的提取和纯化，-20℃冰箱保存备用；B、质粒pSP124S的线性化用限制性内切酶KpnI酶切上述提取纯化的质粒pSP124S DNA，使pSP124S质粒DNA线性化，酶切后的质粒DNA用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化；分光光度计法测量浓度和纯度；C、玻璃珠的准备取直径0.45～0.52μm玻璃珠，超净台中用无菌去离子水冲洗三次，250℃烘干2h；分装于1.5毫升离心管中，121℃高温灭菌20min，密封备用；(3)莱茵衣藻细胞核转化和转化子筛选A、莱茵衣藻细胞核的转化取对数生长期中后期的莱茵衣藻，25℃下4000rpm离心5min收集藻细胞，用新鲜三羟甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸盐TAP培养液洗三次；再用新鲜TAP重悬藻细胞使细胞浓度为2×108个细胞/ml；吸取衣藻悬浮液到内装已灭菌玻璃珠的试管里，取5μg纯化好的线性化质粒pSP124S的DNA加入试管内混合，振荡器强烈震荡、45度斜角旋涡振荡15～30秒；取混合藻液，转移到培养管中，加入无菌新鲜TAP培养液，25℃下水平摇床100rpm震荡、过夜黑暗培养；B、莱茵衣藻转化子的筛选取上述过夜培养的莱茵衣藻细胞在室温下4000rpm离心5min收集藻细胞，用0.5ml新鲜TAP液体培养基重悬，涂在含腐草霉素和琼脂的TAP培养基固体平板上，25℃、100～200μmolphotons m-2s-1光照、培养3～4周，平板上长出绿色的单克隆藻落；挑取有抗性的单藻落在选择培养基上多次继代培养；分别进行产氢培养并检测产氢量和耗氧量，使用氢气和氧气标准品定义所测气体的组成和含量；对产氢量变化大的转化子进行分子鉴定；(4)分析莱茵衣藻转化子产氢培养的产氢量和耗氧量在缺硫培养基中分别对得到的转化子进行产氢培养，并检测密封瓶子上方封存的空气中的氢气和氧气含量；与未转基因莱茵衣藻cc849相比较，得产氢量明显增加的莱茵衣藻突变株最高产氢量为3386.4μl·mg-1Chl，是未转基因的衣藻cc849的最高产氢量433.6μl·mg-1Chl的7.8倍；产氢培养体系中氧气含量为0.2％，未转基因的衣藻cc849的最低氧气含量1.4％；(5)分析莱茵衣藻突变株中ble基因的整合及其表达A、莱茵衣藻总DNA的提取取对数生长后期的衣藻培养液，4℃低速离心收集，加入由0.1mol/L NaCl，50mmol/L EDTA，20mmol/LTris-HCl，pH 8.0组成的NET蛋白提取液重悬沉淀，加入25μl 10mg/ml的蛋白酶K及25μl 20％SDS，混匀、37℃水浴过夜，冰上冷却；加入200μl 5mol/L KAc，冰上静置后高速离心，上清中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇体积比为25∶24∶1的溶液抽提2次；再用等体积的氯仿抽提，总DNA用无水乙醇沉淀和70％乙醇洗涤，干燥后溶于30μl TE缓冲液，用于下述PCR检测备用；B、ble基因整合到莱茵衣藻突变株M1细胞核DNA上的检测以具有腐草霉素抗性的莱茵衣藻转化子的总DNA为模板；用于扩增ble基因的特异性引物是ble-F5’-CAA GCT GAC CAG CGC CGT TC-3’；ble-B5’-CAC GAA GTG CAC GCA GTT G-3’；PCR反应条件为94℃预变性5min，一个循环；94℃变性1min，62℃退火30s，72℃延伸1min；共30个循环；72℃延伸10min；PCR产物分别用QIAGEN试剂盒纯化回收，并测序鉴定正确性；C、莱茵衣藻突变株M1中ble基因转录的检测取对数生长期中期的莱茵衣藻1ml，室温4000rpm离心5分钟收集藻细胞；提取莱茵衣藻的总RNA和合成cDNA，利用上述ble基因的特异性引物和ble基因PCR条件进行扩增，ble基因转录水平检测，转录的ble基因RT-PCR产物电泳条带约为400bp；(6)分析重组豆血红蛋白hemH-lba基因对莱茵衣藻生长的影响A、用双光束紫外可见光分光光度计检测莱茵衣藻在750nm处的吸光度；B、取藻液3000rpm离心5min收集藻细胞，加入同体积的95％乙醇溶液，混合均匀，室温避光放置20min，4℃下12000rpm离心10min；取上清，测定OD665及OD649的吸光值；C、计算总叶绿素的含量，单位mg/L叶绿素ChL＝20.04×0D649+6.10×OD665。
全文摘要
本发明涉及生物制氢技术，细胞核插入诱变选育高产光合制氢莱茵衣藻的方法。现有的莱茵衣藻产氢率低，限制了生物光合制氢技术的应用和发展。本发明对莱茵衣藻细胞核进行随机插入诱变而获得高产氢突变株方法如下莱茵衣藻培养；莱茵衣藻细胞核转化载体和玻璃珠的准备；莱茵衣藻细胞核转化和转化子筛�。环治隼骋鹨略遄硬馀嘌牟饬亢秃难趿浚环治隼骋鹨略逋槐渲曛衎le基因的整合及其表达；分析重组豆血红蛋白hemH-1ba基因对莱茵衣藻生长的影响。本发明的优点是方法是获得的高产氢莱茵衣藻生物制氢产量是原有的7倍；为深入研究莱茵衣藻产氢代谢机理提供了良好的实验材料和良好的基础条件。
文档编号G01N21/31GK101864365SQ201010183660
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月24日 优先权日2010年5月24日
发明者吴双秀, 王全喜, 王荣荣, 许丽丽, 黄瑞 申请人:上海师范大学
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