专利名称：小花鬼针草药材毛细管电泳指纹图谱的构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药材的指纹图谱技术领域，尤其涉及小花鬼针草药材指纹图谱的构 建方法及其应用。
背景技术：
在中药现代化的研究进程中，如何有效地评价中药材质量的好坏一直是中药研究 与应用的重点与难点问题。随着科技的发展，指纹图谱质控技术在中药材及其提取物制剂 质量控制中得到广泛应用。中药的色谱指纹图谱质量控制技术是对中药进行整体、宏观分 析的有效手段，其中应用最多的是HPLC指纹图谱，但中药提取物常损害色谱柱，消耗大量 的有毒有机溶剂，导致HPLC指纹图谱法分析成本高且污染环境。毛细管电泳法因其低消 耗、无污染、柱效高、样品处理简单而日益受到重视。小花鬼针草(Bidens parviflora ffilld.)为菊科鬼针草属植物，药用部位为干燥 全草，具有清热解毒、散瘀消肿的功效，主治咽喉肿痛、泄泻、痢疾，近年来有临床研究表明 鬼针草合剂治疗前列腺增生有明显的效果，用鬼针草液还可以治疗慢性前列腺炎。文献报 道小花鬼针草60%乙醇水溶液提取物具有较强的抑制前列腺癌细胞(LnCap细胞)分泌前 列腺特异性抗原(PSA)活性(100 μ g · mL—1，抑制率IR = 0. 54)。此外，从小花鬼针草中已 分离得到黄酮类、酚类、脂溶性、挥发性类等化合物，其中以黄酮类化合物最常见。
发明内容
本发明的目的是提供一种小花鬼针草药材毛细管电泳指纹图谱的构建方法及其 应用，以此达到完善其质量评价体系，有效控制小花鬼针草药材质量的目的。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下小花鬼针草药材毛细管电泳指纹图谱的构建方法，包括下述主要步骤(1)供试品溶液的制备取小花鬼针草药材粉末4. 5 5. 5g，加入60% 80%乙 醇水溶液IOOmL,加热回流提取1 3次，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩，可反复多次直至 滤液浓缩至干，残渣用甲醇溶解，并转移至容量瓶，用甲醇定容至刻度，然后用微孔滤膜过 滤，续滤液作为供试品溶液；(2)对照品溶液的制备称取对照品粉末，置于容量瓶中，分别加水溶解并定量稀 释成每ImL约含95 105 μ g的溶液，制成对照品溶液；(3)毛细管电泳分析分别吸取所述对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效毛 细管电泳仪中进行毛细管电泳分析，记录毛细管电泳图谱，电泳条件为石英毛细管，运行 电压为10 24kV，紫外检测波长254nm，流体力学进样10s，压力为5X103Pa。其中，对照品可以是水杨酸、芦丁和金丝桃苷中的一种或几种，优选芦丁。背景电 解质溶液是磷酸盐、硼酸、硼砂以及硼砂-硼酸混合液中的一种或几种，优选50mmol化―1硼 砂溶液与IOOmmol .Γ1硼酸溶液的混合液，硼砂溶液与硼酸溶液的体积比为2 1。运行 电压优选20kV。
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基于上述小花鬼针草药材毛细管电泳指纹图谱的构建方法，发明人采集了 28批 不同产地的小花鬼针草药材样品，通过大批量实验研究，收集大批量仪器分析数据，并对大 批量仪器分析数据进行处理，从中提取特征信息，进而加以识别、计算，不仅进一步确立、验 证了该专属性强，并且稳定有效的小花鬼针草药材指纹图谱构建方法，并且得到了可有效 用于小花鬼针草药材质量评价的标准毛细管电泳指纹图谱。通过分析比较，确定了小花鬼针草药材的标准指纹图谱具有如下特征峰，以芦丁、 水杨酸、金丝桃苷为对照，计算得小花鬼针草药材标准指纹图谱中各特征峰的迁移时间及 理论塔板数分别如下9. 46min的峰为芦�。�10. 35min的峰为水杨酸，11. 22min的峰为金丝 桃苷，三个峰的理论塔板数分别为207283,22672，105835。标准指纹图谱中确定的上述共有特征峰具有广泛的代表性，在发明人购得的大量 小花鬼针草药材样品检测结果中均得到了证实，因此，该毛细管电泳指纹图谱的构建方法 及得到的指纹图谱可用于正品小花鬼针草药材或饮片质量的评价和控制。本发明分别考察了磷酸盐、硼酸、硼砂、硼砂_硼酸混合溶液构成的背景电解质溶 液，电泳色谱图显示采用硼砂-硼酸混合溶液为背景电解质溶液时的电泳峰分离较好；考 察不同配比的硼砂-硼酸混合溶液为背景电解质溶液时的电泳色谱峰，发现以50mmol ·厂1 硼砂溶液和IOOmmol化4硼酸溶液按2 1比例的混合液为背景电解质溶液时的电泳峰最 多，分离度较好，因此优选其为背景电解质溶液；考察PH变化对电泳色谱图的影响，发现pH 变化对电泳色谱峰没有明显改变；考察了运行时电压分别为10、15、18、20和24kV时电泳峰 的分离情况，结果以20kV时分离效果最佳。本发明另一方面提供了一种检测小花鬼针草药材质量的方法，是以毛细管电泳图 中的芦丁、水杨酸、金丝桃苷的迁移时间为对照，计算小花鬼针草药材毛细管电泳图谱中各 特征峰的迁移时间及理论塔板数。本发明还提供了小花鬼针草药材毛细管电泳指纹图谱的构建方法在检测小花鬼 针草药材及饮品质量方面的应用。与现有技术相比，本发明确立了小花鬼针草药材指纹图谱的构建方法，通过该方 法可获得小花鬼针草的标准指纹图谱，完善了小花鬼针草药材的质量评价体系，克服了 HPLC指纹图谱中损害色谱柱，有毒有机溶剂消耗量大，分析成本高且污染环境的缺点，为小 花鬼针草药材及其饮片质量的全面有效控制提供了理论和实践基础。
图1所示是本发明实施例的供试品溶液和对照品溶液的毛细管电泳图。
具体实施例方式以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。1、仪器与试药HP3DCE高效毛细管电泳仪(美国安捷伦科技有限公司)，G1600-60210石英毛细 管(美国安捷伦科技有限公司)，PTS-1002超声仪(深圳博达超声设备有限公司)。
硼酸(分析纯，广东汕头市西陇化工厂)，硼砂(分析纯，广东汕头市西陇化工 厂)，氢氧化钠(分析纯，广州化工分厂)，磷酸二氢钠(分析纯，广州化工分厂)，磷酸氢二 钠(分析纯，广州化工分厂)，甲醇(色谱纯，天津四友公司)，乙腈(色谱纯，Merck公司)， 水(Millipore-Q自制超纯水)，芦丁、水杨酸、金丝桃苷对照品(均购自中国药品生物制品 检验所，批号分别为 100080-200306，100106-200303，111521-200303)。小花鬼针草药材分别采自辽宁、黑龙江、吉林、山东、山西、甘肃、陕西、河南、四川、 重庆、广西、广东等28个产地，经沈阳药科大学生药教研室鉴定为小花鬼针草药材。2、溶液的制备(1)供试品溶液的制备将28批不同产地的小花鬼针草药材于60°C下干燥 30min,剪碎，分别精密称取5. Og,加60%乙醇水溶液IOOmL加热回流提取2次，提取液合 并，滤纸过滤，滤液减压浓缩至80mL，静置24h，滤纸过滤，滤液再减压浓缩至干，残渣用甲 醇20mL溶解，并转移至25mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，然后用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，取 续滤液备用。(2)对照品溶液的制备另取水杨酸对照品、芦丁对照品和金丝桃苷对照品适量， 精密称定，分别加水溶解并定量稀释成每ImL约含100 μ g的溶液，作为对照品溶液。3、电泳条件G1600-60210石英毛细管(64. 5cmX50 μ m，有效长度56cm，美国安捷伦科技有限 公司)，以50mmol · L—1硼砂溶液和IOOmmol · L—1硼酸溶液(2 1)为背景电解质(BGE)溶 液，运行电压为20kV，紫外检测波长为254nm，流体力学进样IOs (压力为5X IO3Pa)。每次 进样前先用0. IOmmol · L—1氢氧化钠溶液冲洗毛细管5min，再用去离子水冲洗3min，用BGE 溶液平衡8min后进样分析。4、图谱中色谱峰的归属将前述供试品溶液及对照品溶液分别进样分析，供试品溶液和对照品溶液的毛细 管电泳图见图1，图中A表示供试品溶液，B表示对照品溶液，1代表芦丁(rUtin)，2代表水 杨酸(salicylic acid)，3代表金丝桃苷(hyperoside)。与对照品溶液的迁移时间比较，指 认出供试品溶液中迁移时间为9. 46min的峰为芦�。�10. 35min的峰为水杨酸，11. 22min的 峰为金丝桃苷，三个峰的理论塔板数分别为207283，22672，105835。由于芦丁与相邻组分均 达到基线分离，其峰面积及迁移时间适中，因此优选为小花鬼针草CEFP的参照物峰。5、方法学考察(1)精密度试验按前述电泳条件将辽宁朝阳产小花鬼针草药材供试品溶液连续 进样5次，记录电泳色谱图。结果各指纹峰相对迁移时间的RSD小于3. 8%，相对峰面积的 RSD小于7%，表明进样精密度合格。(2)稳定性试验按前述电泳条件将辽宁朝阳产的小花鬼针草药材供试品溶液每 隔2h间断进样5次，记录电泳色谱图。结果各指纹峰相对迁移时间的RSD小于6%，相对峰 面积的RSD小于8. 6%，表明供试品溶液基本稳定。(3)重复性试验将按前述方法制备的辽宁朝阳产小花鬼针草的供试品溶液5份， 依次进样分析，记录电泳色谱图。结果各指纹峰相对迁移时间的RSD小于4. 2%，相对峰面 积的RSD小于10%，表明本方法的重复性基本满足指纹图谱的要求。6、小花鬼针草毛细管电泳指纹图谱的分析
(1)运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)，，相似度计算软件进行 分析验证将28批不同产地的小花鬼针草药材供试品溶液分别在毛细管电泳仪上分析，记 录电泳色谱图。通过《国家药典》委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A 版)”软件计算28批不同产地的小花鬼针草毛细管电泳色谱图的相似度，其相似度见表1。表1、28批小花鬼针草药材的毛细管电泳指纹图谱的相似度 (2)系统聚类分析聚类分析是用计算机自动寻找大量样本谱图的统计规律，再 根据所建立的规律对待测谱图进行归类，它们给出的答案是一种分类的信息，可以反映样 品之间的亲疏程度。本研究以28批不同产地的小花鬼针草药材为对象，进行指纹图谱研 究，获得包括芦丁(tK = 9.07min)在内的21个色谱峰。通过公式Cc = Ai j/Mi (Ce 样品 中化合物的表观含量；Aij 第i个样品、第j个色谱峰的峰面积；Mi 第i个样品的称样质 量)计算小花鬼针草样品中各色谱峰的表观含量，获得28 X 21阶原始数据矩阵，运用“SPSS 软件”对其进行系统聚类分析，采用离差平方和法(Ward’ s Method)，利用欧氏距离的平方 (Squared Euclidean Distance)作为样品的测度。聚类分析将28批小花鬼针草药材分为 3级，分级结果见表2。表2、28批药材系统聚类分析分级结果 (3)相似度计算相似度计算是先通过足够代表性的基准样本的色谱指纹图谱建 立共有模式，再通过样品指纹图谱与共有模式的相似度的计算，提供定性、定量的评价信 息，为中药质量控制提供依据。常用的相似度计算方法的测度主要有距离测度和相关系数测度。本研究采用欧氏距离(dir)、相关系数(rir)和夹角余弦(Cir)作为测度，对样品进 行相似度计算，计算公式分别为
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dir 欧氏距离；rir 相关系数；Cir 夹角余弦；Xik 第i个样品，第k个特征变量(k = l，2-m)；Xrk 共有模式均值向量第k个特征变量(k = 1，2…m)；Xi:第i个样品所有变量的均值；Xr:共有模式所有变量的均值。依据28批药材的色谱指纹图谱建立共有模式，然后计算各样品指纹图谱与共有 模式之间的相似度来判断药材质量，结果见表3。表3、28批药材的相似度分析结果 此外，本发明利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”和“SPSS计算软件”对不同产地小花鬼针草药材指纹图谱的相似度进行评价，发现两者的判定结果基本 吻合。由评价结果可以看出，不同产地小花鬼针草药材的指纹图谱整体面貌基本一致，但不 同产地药材中芦丁、水杨酸、金丝桃苷的含量存在一些差异其中以辽宁朝阳产小花鬼针草 中芦丁的含量最高，广西百色最低；辽宁抚顺产药材中水杨酸含量最高，广东广州最低；吉 林通化产药材中金丝桃苷含量最高，广东深圳最低。各产地小花鬼针草指纹图谱与对照指 纹图谱相似性良好，反映了药材的同源性，可以用作小花鬼针草药材的定性鉴别。
权利要求
小花鬼针草药材毛细管电泳指纹图谱的构建方法，包括下述主要步骤(1)供试品溶液的制备取小花鬼针草药材粉末4.5～5.5g，加入60％～80％乙醇水溶液100mL，加热回流提取1～3次，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩，可反复多次直至滤液浓缩至干，残渣用甲醇溶解并转移至容量瓶，用甲醇定容至刻度，然后用微孔滤膜过滤，续滤液作为供试品溶液；(2)对照品溶液的制备称取对照品粉末，置于容量瓶中，分别加水溶解并定量稀释成每1mL约含95～105μg的溶液，制成对照品溶液；(3)毛细管电泳分析分别吸取所述对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效毛细管电泳仪中进行毛细管电泳分析，记录毛细管电泳图谱；所述毛细管电泳条件为石英毛细管，运行电压为10～24kV，紫外检测波长254nm，流体力学进样10s，压力为5×103Pa。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对照品为水杨酸、芦丁和金丝桃苷中的 一种或几种。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述对照品为芦丁。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电泳条件中背景电解质溶液是磷酸盐、 硼酸、硼砂以及硼砂_硼酸混合液中的一种或几种。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述背景电解质溶液是50mmol L—1硼砂溶 液与lOOmmol L—1硼酸溶液的混合液，所述硼砂溶液与硼酸溶液的体积比为2:1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述运行电压为20kV。
7.—种检测小花鬼针草药材质量的方法，其特征在于，以权利要求1所述方法得到的 毛细管电泳图谱中的芦丁、水杨酸、金丝桃苷的迁移时间为对照，计算小花鬼针草药材毛细 管电泳图谱中各特征峰的迁移时间及理论塔板数。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述毛细管电泳图谱中9.46min的峰为 芦丁，10. 35min的峰为水杨酸，11. 22min的峰为金丝桃苷，三个峰的理论塔板数分别为 207283,22672,105835。
9.权利要求1的小花鬼针草药材毛细管电泳指纹图谱的构建方法用于检测小花鬼针 草药材的质量。
10.权利要求1的小花鬼针草药材毛细管电泳指纹图谱的构建方法用于检测小花鬼针 草饮片的质量。
全文摘要
本发明提供了一种小花鬼针草药材毛细管电泳指纹图谱的构建方法及其应用。该构建方法包括供试品溶液的制备，对照品溶液的制备以及毛细管电泳分析。对照品为水杨酸、芦丁和金丝桃苷中的一种或几种。本发明确立了小花鬼针草药材指纹图谱的构建方法，通过该方法可获得小花鬼针草的标准指纹图谱，完善了小花鬼针草药材的质量评价体系，克服了HPLC指纹图谱中损害色谱柱，有毒有机溶剂消耗量大，分析成本高且污染环境的缺点，为小花鬼针草药材及其饮片质量的全面有效控制提供了理论和实践基础。
文档编号G01N30/88GK101890066SQ201010223169
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月8日 优先权日2010年7月8日
发明者刘敏, 庞发根, 李玉兰, 王军德, 王珏 申请人:深圳市药品检验所
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