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专利名称：码绢金龟精巢染色体制作观察方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，提供了一种码绢金龟精巢染色体制作观察方法。
背景技术：
码绢金龟Maladera sp.隶属鞘翅目、绒金龟科、绢绒金龟属，是取食为害烟草等作物的主要金龟子类害虫，由于该虫与其它绢绒金龟属金龟子形态特征极相似，目前单纯依靠形态鉴定法尚不能准确鉴定，因此对码绢金龟的分类仍仅停留在属上，尚未定种。然而，形态鉴定法对于形态极为相似的同属金龟子则无法准确鉴定，在对于不具备分子生物学实验条件者来说，分子生物学鉴定法也受到一定的制约，而对于利用核型分析法则尚无成功的染色体制作观察方法，利用目前现有染色体的制作方法后无法清晰观察到该虫的染色体形态及记数。

发明内容
本发明克服了现有技术的不足，提供了一种准确、方便的码绢金龟染色体的制作观察方法。
本发明的步骤是1、取材和预处理将码绢金龟成虫固定在解剖蜡盘上，取出精巢，放入0.04～0.06％秋水仙素溶液中处理6～14h，秋水仙素0.1～0.3％的原液保存于冰箱中。
2、溶液配制Giemsa试剂1g，甘油50ml，甲醇50ml，先将Giemsa试剂1g放入研钵中，再加入5ml甘油研磨而使其溶化为匀浆状，再加入甘油，混合后装入瓶中摇匀后加入甲醇；3、玻片标本的制备将精巢从秋水仙素浸液中取出，用蒸馏水冲洗，再在解剖镜下分开每条精巢小管，剔除精巢小管周围的蛋白质等杂质，先在0.4％KCl溶液和蒸馏水两种溶液中低渗处理30min，移入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)内经30～60min后，移入70％酒精内，置于冰箱中，从固定液中取出精巢小管，在载片上放一条精巢小管，用吸水纸吸干，然后用蒸馏水洗3遍，吸干，滴上0.05％秋水仙液一滴，盖上盖玻片，轻轻敲击使精巢小管破裂里面的减数分裂细胞流出来和染色液接触，将载玻片直接放在平展的桌面上，取两层干净吸水纸盖在上面，在盖玻片位置上垂直施压；4、染色用磷酸缓冲液(PH6.8)将Giemsa(PH6.7～7.0)原液稀释10倍，染色10～20min；5、镜检将制得的玻片标本在显微镜下观察、计数，码绢金龟精巢染色体呈短杆状；其中将码绢金龟成虫精巢放入0.04～0.06％秋水仙素溶液中处理10～14小时，在固定液中固定时间为46～60min，染色时间为15～20min。
按照此发明方法以码绢金龟成虫精巢为材料，经过秋水仙素预处理，经KCl溶液低渗处理、固定，用Giemsa染色后，制作观察码绢金龟染色体，细胞分裂中期相多，且清晰，因此染色体清晰可见，能准确、直观记数染色体的数量，可用于码绢金龟染色体核型分析及种类鉴定。
具体实施例方式
实施例一取码绢金龟成虫精巢放入0.05％秋水仙素溶液中处理6小时。
秋水仙素溶液浓度为0.1％；Giemsa溶液的配制由Giemsa试剂1g，甘油50ml，甲醇50ml，先将Giemsa试剂1g放入研钵中，再加入5ml甘油研磨而使其溶化为匀浆状，再加入甘油，混合后装入瓶中摇匀后加入甲醇。
玻片标本的制备将精巢从秋水仙素浸液中取出，冲洗后在解剖镜下分成精巢小管，先在0.4％KCl溶液和蒸馏水两种溶液中低渗处理30min，移入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)内经30min后，取出精巢小管，在载玻片上放一条精巢小管，滴上0.05％秋水仙液一滴，盖上干净的盖玻片，敲击使精小管破裂里面的减数分裂细胞流出来和染色液接触。
染色用磷酸缓冲液(PH6.8)将Giemsa(PH6.7～7.0)原液稀释10倍，染色10min，在盖玻片位置上垂直施压。
镜检玻片标本在显微镜下观察、计数。
结果码绢金龟精巢细胞染色体分裂中期细胞，n＝9者占85％，染色体均呈短杆状。
实施例二取码绢金龟成虫精巢，放入0.05％秋水仙素溶液中处理14小时。
秋水仙素溶液浓度为0.3％，Giemsa溶液的配制由Giemsa试剂1g，甘油50ml，甲醇50ml，先将Giemsa试剂1g放入研钵中，再加入5ml甘油研磨而使其溶化为匀浆状，再加入甘油，混合后装入瓶中摇匀后加入甲醇。
玻片标本的制备将精巢从秋水仙素浸液中取出，冲洗后在解剖镜下分成精巢小管，先在0.4％KCl溶液和蒸馏水两种溶液中低渗处理30min，移入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)内经60min后，取出精巢小管，在载玻片上放一条精巢小管，滴上0.05％秋水仙液一滴，盖上干净的盖玻片，敲击使精小管破裂里面的减数分裂细胞流出来和染色液接触。
染色用磷酸缓冲液(PH6.8)将Giemsa(PH6.7～7.0)原液稀释10倍，染色20min，在盖玻片位置上垂直施压。
镜检玻片标本在显微镜下观察、计数。
结果码绢金龟精巢细胞染色体分裂中期细胞，n＝9者占85％，染色体均呈短杆状。
实施例三取码绢金龟成虫精巢，放入0.05％秋水仙素溶液中处理10小时。
秋水仙素溶液浓度为0.2％，Giemsa溶液的配制由Giemsa试剂1g，甘油50ml，甲醇50ml，先将Giemsa试剂1g放入研钵中，再加入5ml甘油研磨而使其溶化为匀浆状，再加入甘油，混合后装入瓶中摇匀后加入甲醇。
玻片标本的制备将精巢从秋水仙素浸液中取出，冲洗后在解剖镜下分成精巢小管，先在0.4％KCl溶液和蒸馏水两种溶液中低渗处理30min，移入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)内经45min后，取出精巢小管，在载玻片上放一条精巢小管，滴上0.05％秋水仙液一滴，盖上干净的盖玻片，敲击使精小管破裂里面的减数分裂细胞流出来和染色液接触。
染色用磷酸缓冲液(PH6.8)将Giemsa(PH6.7～7.0)原液稀释10倍，染色15min，在盖玻片位置上垂直施压。
镜检玻片标本在显微镜下观察、计数。
结果；码绢金龟精巢细胞染色体分裂中期细胞，n＝9者占85％，染色体均呈短杆状。
权利要求
1.一种码绢金龟精巢染色体制作观察方法，其步骤是(1)取材和预处理将码绢金龟成虫固定在解剖蜡盘上，取出精巢，放入0.04～0.06％秋水仙素溶液中处理6～14h，秋水仙素0.1～0.3％的原液保存于冰箱中；(2)溶液配制Giemsa试剂1g，甘油50ml，甲醇50ml，先将Giemsa试剂1g放入研钵中，再加入5ml甘油研磨而使其溶化为匀浆状，再加入甘油，混合后装入瓶中摇匀后加入甲醇；(3)玻片标本的制备将精巢从秋水仙素浸液中取出，用蒸馏水冲洗，再在解剖镜下分开每条精巢小管，剔除精巢小管周围的蛋白质等杂质，先在0.4％KCl溶液和蒸馏水两种溶液中低渗处理30min，移入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)内经30～60min后，移入70％酒精内，置于冰箱中，从固定液中取出精巢小管，在载片上放一条精巢小管，用吸水纸吸干，然后用蒸馏水洗3遍，吸干，滴上0.05％秋水仙液一滴，盖上盖玻片，轻轻敲击使精巢小管破裂里面的减数分裂细胞流出来和染色液接触，将载玻片直接放在平展的桌面上，取两层干净吸水纸盖在上面，在盖玻片位置上垂直施压；(4)染色用磷酸缓冲液(PH 6.8)将Giemsa(PH 6.7～7.0)原液稀释10倍，染色10～20min；(5)镜检将制得的玻片标本在显微镜下观察、计数，码绢金龟精巢染色体呈短杆状。
2.根据权利要求1所述的码绢金龟精巢染色体制作观察方法，其特征是步骤(1)中的码绢金龟成虫精巢放入0.04～0.06％秋水仙素溶液中处理10～14小时。
3.根据权利要求1所述的码绢金龟精巢染色体制作观察方法，其特征是步骤(3)中的在固定液中固定的时间为46～60min。
4.根据权利要求1所述的码绢金龟精巢染色体制作观察方法，其特征是步骤(4)中的染色时间为15～20min。
全文摘要
本发明涉及一种码绢金龟精巢染色体制作观察方法，属于生物技术领域。本发明的技术方案是以码绢金龟(Maladera sp.)成虫精巢细胞为材料，将金龟子精巢用秋水仙素预处理6～14h，经0.4％KCl溶液低渗30min，甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定30～60min，用Giemsa染色10～20min后，获得的精巢细胞染色体形态清晰，分散性较好，采用显微操作技术，获得了着色清晰的生殖细胞染色体，进行染色体数目的计数统计，得到了码绢金龟染色体数目n＝9。本发明的效果用途是能提供码绢金龟精巢染色体的制作观察方法，为码绢金龟精巢染色体形态观察和染色体数计数提供技术支撑。
文档编号G01N1/30GK1828296SQ20051004872
公开日2006年9月6日 申请日期2005年12月22日 优先权日2005年12月22日
发明者陈斌, 李正跃, 桂富荣, 孙跃先, 严乃胜 申请人:云南农业大学