专利名称：借助由两种不同底物构成的固相进行的固相合成的制作方法
技术领域：
本发明涉及在固相上的物质合成、所述的由两种不同底物构成的固相、适应此目的的反应体系、包括固相合成和分析过程在内的方法，其中通过分析过程来分析被合成的物质的化学结构和生物特性。
当需要一些连续的反应步骤去构建分子时，分子在固相上的合成特别具有优势，这是因为固相使各自获自反应物的中间体容易分离，并使合成自动化。特别是，固相合成是用于生成多肽和多核苷酸的标准合成。为了在给定的反应容积中提供最大可能的表面，通常使用多孔的固相。
在最近的几年中，固相合成的重要性大大地提高了，这特别归因于它在建立化学库中的应用。例如，经所谓的“分离-混合”过程产生此化学库，在该“分离-混合”过程中，被称作小球的微球体被分到若干反应容器中，它们在第一步合成例如进行第一次取代之后重新合并，并为了进行第二次可变的取代而再次分离。重复此过程，这提供了一种技术简便的方法，其用于产生数千或数百万个不同的分子，而同时在每一个小球上只有一种特定的分子。为了形成足量的物质并使固相容易处理，多孔的小球通常被用作载体。通常直接在这些小球上使用所谓的FACS(荧光辅助的细胞分类)方法，以对被合成的物质进行生物学筛�。朔椒ń鲇糜谀承┒允芴�-配体。此外，也可经解离将物质从小球上移走，并对该物质的溶质形式进行分析；这导致多种物质的混合，而这种混合是不利的(Felder,Chimia 48,pp.531-541,1994)。
特别是多并联合成，它被提议替代“分离-混合”方法。在多并联合成中，在每个反应容器或固体反应表面分别合成一类特定物质。尽管相对“分离-混合”技术，此途径可合成的物质种类的数目较�。哂幸韵掠攀朴捎谒铣晌镏实墓潭ǖ奈恢茫宦酆问本珊耸灯渖矸荩欢铱珊铣山洗蟮牧�。通常，在具有最大可能表面的载体例如多孔树脂底物上进行合成。当用于生物学分析时，合成的产物必须为此再次经解离从载体上移走，从而仍然存在与筛选液体样品相伴随的缺点，例如由分子间作用引起的矫作物。如果在非多孔的平面载体上进行合成，所合成的量对于一些化学分析来说太�。乇鹗窃谛⌒突谋砻娴那榭鱿�。
针对这一背景，本发明的目的是提供一种简单的固相合成，它既允许合成足够用于对获得的物质进行化学鉴定的物质量，又能使对获得的物质的生物学活性检测相对现有技术具有较高的灵敏度。
根据本发明，通过在含有液相的反应容器中进行物质的固相合成来达到此目的，其特征是，用于合成的固相包含一种被可逆地引入液相的底物和全部或部分的反应容器器壁。
被用于合成的固相的本发明容器器壁部分优选是反应容器的底部。此底部优选是非多孔的，并特别优选是非多孔且平坦的。
被可逆地引入液相的底物优选是一个或多个小球，例如树脂制成的小球，其中树脂例如有经化学修饰的聚苯乙烯基树脂。这些小球一方面使底物在合成完成后易于处理，另一方面具有较大的表面，从而使在给定容积中合成物质的量变得非常大。此外，被可逆地引入液相的底物也可以是同样已用于多并联合成的探针头(needle head)，例如塑料针的探针头(Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,3998,1984)。
本发明的一个基本特征是，在合成的每一步中，被可逆地引入液相的底物和作为固相的反应容器器壁部分均处于经化学修饰的状态，此化学修饰使得固相的这两种组分固定相同的分子，并优选具有几乎相同的反应性。用于固相合成的大量树脂可商购获得(例如，购自Calbiochem-Novabiochem GmbH,Schwalbach)，可以按照本发明将它们用作可被可逆地引入液相的底物。例如有Merrifield树脂(氯甲基衍生化的苯乙烯树脂)、羟基官能化的树脂、氨基官能化的树脂、三苯甲基树脂、芳基甲硅烷氧基树脂、羧基官能化的树脂、醛官能化的树脂、硫醇官能化的树脂和碳酸酯树脂。具有不同反应基团的不同分子可直接或通过间隔基附着在这些树脂上，附着的方法依赖于反应基团并为本领域的技术人员所共知。如果某一树脂被选作能可逆地用于本发明合成的底物，那么必须注意确保作为固相的全部或部分容器器壁具有官能团，且这些官能团允许固定与可逆引入的底物固定的相同的分子。优选被可逆引入的底物和作为固相的容器器壁部分具有相同的官能团。适合用于官能化固相的方法为本领域技术人员所熟悉。例如，通�？赏ü柰榛蚴褂美淑讯�-布罗杰特(Langmuir-Blodgett)技术使表面官能化。如果作为固相的反应容器器壁部分是例如玻璃基，且如果氨基官能化的树脂被选作能够可逆引入的底物，那么玻璃表面的氨基可通过衍生化产生，例如用氨丙基三甲氧基硅烷进行衍生化。另一方面，如果反应容器的底部是例如丙烯酸有机玻璃底，且羧基官能化的树脂被选作能够可逆引入的底物，那么丙烯酸有机玻璃上羧基官能团可通过例如朗缪尔-布罗杰特膜产生，这正如DE C 4332003所公开的那样。
当将用于固相合成的合成组分加入制得的固相中时，其加入方式应确保被加入的该合成组分过量于键合在固相上的官能团。如果反应时间充分，可确保固相的组分反应完全，即使在被可逆引入的底物上的官能团与反应容器的容器壁上的官能团反应性不同的情况下。这样可保证在反应容器的容器壁上和在被可逆引入的底物中合成相同的最终分子。还必须注意确保在每一步合成之间进行充分的冲洗。为了这个目的，优选反应容器的上口装有过滤器，该过滤器确保被可逆引入的底物在冲洗过程中仍保留在反应容器内。如果反应容器的侧壁被用作固相，那么反应溶液也可从反应容器的多孔底部通过虹吸除去。
与从现有技术获知的多并联合成相反，本发明确保物质不仅在坚固锚定于反应容器上的多孔载体上合成，还在反应容器的容器壁上和在被可逆引入液相的底物上合成，该液相可容易地从容器中除去。
本发明合成方法的特殊优点在于对所合成的物质的物化特性和生物学特性的分析，与现有技术比较，这两种分析都得到了大大简化。
可直接对按照本发明制备且位于固相上的合成产物进行大量的生物学分析，而无需任何预先的反应和分离步骤。当合成完成时，将被可逆引入液相的底物从反应容器移到另一容器中。接着可直接对保留在反应容器中例如在反应容器底部的合成产物进行生物学分析。生物学试验的选择包括但不限于所有适用于例如分析生物学或生化特性的试验。它们特别包括化学发光方法、表面等离子体共振方法、荧光方法和应用声响变化的表面技术(声响传感器)。本发明的优势在以下生物学试验中特别明显，该试验测定其受体恰好位于细胞膜中的被合成的物质的相互作用，或测定配体-受体相互作用，此相互作用产生的信号过弱，以致不能在传统试验中得以测定。
被合成的物质与恰好位于细胞膜中的受体的相互作用可经细胞试验得以分析，此细胞试验包括用显微镜透过薄的透明底物观察细胞。在这些情况下，以这样的方式选择反应容器的底部，以至它适合用于所述的细胞试验。优选反应容器的底部是玻璃基底，例如，在使用例如钙成像的荧光试验中，优选石英玻璃基底。除了经在反应容器的底部直接合成而简化的过程之外，按照本发明合成进行的细胞试验还具有改进的灵敏度，这是因为所有的分子分别在表面有统一的取向或其取向可由合成控制。
另外，本发明的合成在要求分析配体相互作用的情况下特别具有优势。这是因为传统试验不够灵敏或不特异，以致不能用于这样的分析。试验变得可能，这归功于在检测作为薄的表面膜的物质的情况下检测容量的急剧减少，它比有关的容积方法灵敏几个数量级，且甚至允许检测单一的分子。这样的试验述于德国专利申请19822542.4，并且，除测定绝对浓度之外，它还允许测定亲合常数和结合动力学，这些常常是相互作用特异性的标准。在这些情况下，用于本发明合成的反应容器的底部也优选是石英玻璃基底。
特别是当生物学试验显示令人感兴趣的结果时，可通过分析较早从反应容器中移走的固相，在另一步中确定受测化合物的化学身份。考虑将经典的化学分析技术例如GC/MS、TOF/MS、MALDI和NMR用于此目的，但也可进行微观排序，其取决于合成的物质的类型。
在本发明的一个优选实施例中，反应容器是微量反应板的一个阱，微量反应板例如有96、384或1536微量反应板。通过加入不同的反应物，这样的微量反应板允许在每一个阱中平行进行多达1536个不同的化学合成。另外，微观构建的体系例如基于晶片技术的体系是适合本发明用途的反应容器。
另外，本发明提供一种适合本发明的固相合成的反应体系。本发明的反应体系包括装满液相的微量反应板，其特征是微量反应板的每一阱中额外含有被可逆引入液相的底物，每个底物和有关阱的容器壁的全部或部分都带有用于固定相同分子的官能团。
在用DMF冲洗后，通过与在DMF中20％的哌啶于室温温育30分钟切去甲酰基保护基，并开始制备经固相连接的二肽的新反应循环。重复循环六次，以此产生六肽。最后用在二氯甲烷中25％的三氟乙酸(30分钟、室温)除去侧链保护基并冲洗。
根据所使用氨基酸的序列，在板的各个阱中产生相应的六肽。现在移去小球，可用化学分析方法对其进行分析。通过加入荧光标记的目标蛋白分子并用荧光扫描仪扫描基底，可容易地研究结合在微量反应板的玻璃基底上的六肽与蛋白的结合。
权利要求
1．在含有液相的反应容器中的物质的固相合成，其特征是，用于合成的固相包含一种被可逆地引入液相的底物和全部或部分的反应容器器壁。
2．权利要求1的固相合成，其特征是，反应容器包括一个非多孔的作为容器壁一部分的基底，它被用作合成的固相。
3．权利要求1或2的固相合成，其特征是，全部或部分的反应容器器壁和被可逆地引入的底物带有相同的官能团。
4．权利要求2或3的固相合成，其特征是，基底是石英玻璃基底。
5．上述权利要求中任一项的固相合成，其特征是，被可逆地引入液相的底物是一个或多个小球。
6．权利要求1至4中任一项的固相合成，其特征是，被可逆地引入液相的底物是探针头。
7．上述权利要求中任一项的固相合成，其特征是，反应容器是微量反应板的一个阱。
8．一种方法，其包括(a)上述权利要求中任一项的固相合成和(b)分析过程，该分析过程包括(b1)通过分析在被可逆地引入液相的底物上合成的物质，分析所合成的物质的化学结构，和(b2)通过分析在反应容器器壁上合成的物质，分析所合成的物质的生物学特性。
9．一个包含装满液相的微量反应板的反应体系，其特征是，微量反应板的阱中额外含有被可逆引入液相的底物，每个底物和有关阱的容器壁的全部或部分都分别带有用于固定相同分子的官能团。
全文摘要
本发明涉及在由两种不同底物构成的固相上的物质合成、合适的反应体系、包括固相合成和分析过程在内的一种方法,其中被合成的物质的化学结构和生物学特性在分析过程中得以分析。本发明的物质固相合成在含有液相的反应容器中进行,其特征是,合成用的固相包括被可逆地加到液相中的底物和全部或部分的反应容器器壁。
文档编号G01N33/68GK1324366SQ99812577
公开日2001年11月28日 申请日期1999年9月29日 优先权日1998年9月30日
发明者斯特凡·泽格 申请人:分子机械和工业股份有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
