专利名称：一种联合检测相思子毒素和蓖麻毒素的胶体金试纸及专用单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种联合检测相思子毒素和蓖麻毒素的胶体金试纸及专用单克隆抗 体。
背景技术：
相思子毒素(Abrin)和蓖麻毒素(Ricin)是从植物种子中分离的毒性很强的植物 毒素，其中相思子毒素分子量约为62KD，pI6.9 ；蓖麻毒素分子量约为65KD，pI7.3。这 两种毒素具有相同的AB链结构和相同的致病机制，而且分子量大小也相似，具有较高的 同源性。自美国遭受9.11恐怖袭击和炭疽芽孢事件发生后，世界各国开始高度关注生物 恐怖袭击。由于这两种毒素天然资源比较丰富，制备比较容易，并且借助当今高度发达 的生物工程技术手段，还能够实现大批量生产。毒素中毒后无特异症状，出现症状时已 经造成机体严重的器质损害，给中毒的治疗及预防带来极大的难度，具备生物毒素武器 典型特征，因此历来为外军所高度重视，相思子和蓖麻毒素均被美国疾病预防控制中心 (Centers for Disease Control, CDC)列为最有可能作为生物恐怖袭击的生物战剂。这两种 毒素具有极强的细胞毒性作用，相思子毒素为IC5(l4.8X10-llmol/L(兔网织红细胞)，小 鼠腹腔LD50达0.04 μ g/kg ；而蓖麻毒素IC50为1.8 X 10-10mol/L (Hela细胞)；小鼠腹腔 注射 LD5Q3 μ g/kg。因此，在当前国内外严峻的反恐形势下，寻求新的对相思子毒素和蓖麻毒素快 速、有效的鉴定方法，具有十分现实的军事和民防价值。而对于相思子和蓖麻毒素的 检测和鉴定，传统的方法已不能满足当前反恐形势的要求。因此，发展和建立多重、特 异、灵敏的相思子和蓖麻毒素检测方法是十分急需、重要的。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种抗相思子毒素的单克隆抗体。本发明所提供的抗相思子毒素的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC Νο.4062 的Abrin-a A链单克隆抗体细胞株分泌的。保藏编号为CGMCC Νο.4062的Abrin_a A链单克隆抗体细胞株也属于本发明的
保护范围。本发明的另一个目的是提供一种用于检测相思子毒素和/或蓖麻毒素的胶体金 试纸。本发明所提供的用于检测相思子毒素和/或蓖麻毒素的胶体金试纸，包括样品 垫、胶金垫、反应垫和吸收垫，其依次连接；所述胶金垫包被有胶体金探针；所述反应 垫上设有检测位置1、检测位置2和质控位置，检测位置1包被有抗相思子毒素的抗体， 检测位置2包被有抗蓖麻毒素的抗体，质控位置包被有抗抗体；所述胶体金探针为如下1)和2)的混合物1)胶体金与抗相思子毒素的抗体的偶联物；2)胶体金与抗蓖麻毒素 的抗体的偶联物。上述胶体金试纸中，检测位置1包被的抗相思子毒素的抗体和胶体金与抗相思 子毒素的抗体的偶联物中，抗相思子毒素的抗体可为单抗也可为多抗。上述胶体金试纸中，检测位置2包被的抗蓖麻毒素的抗体和胶体金与抗蓖麻毒 素的抗体的偶联物中，抗蓖麻毒素的抗体可为单抗也可为多抗。上述胶体金试纸中，所述检测位置1包被的抗相思子毒素的抗体中，所述抗相 思子毒素的抗体是由保藏编号为CGMCC No.4062的Abrin-a A链单克隆抗体细胞株分泌 的。上述胶体金试纸中，所述检测位置2包被的抗蓖麻毒素的抗体中，所述抗蓖麻 毒素的抗体为抗蓖麻毒素的多克隆抗体；所述胶体金与抗蓖麻毒素的抗体的偶联物中， 所述抗蓖麻毒素的抗体为抗蓖麻毒素的多克隆抗体。该多克隆抗体具体可以是以脱毒的 蓖麻毒素为免疫原免疫兔得到的。其中蓖麻毒素的氨基酸序列具体可如SEQ ID NO 2 所示。上述胶体金试纸中，所述胶体金与抗相思子毒素的抗体的偶联物中，所述抗相 思子毒素的抗体为抗相思子毒素的多克隆抗体。该多克隆抗体具体可以是以脱毒的相思 子毒素为免疫原免疫兔得到的。其中相思子毒素的氨基酸序列具体可如SEQID NO: 1所
7J\ ο上述胶体金试纸中，所述检测位置2包被的抗蓖麻毒素的抗体中，所述抗蓖麻 毒素的抗体为兔来源的抗蓖麻毒素的多克隆抗体；所述胶体金与抗相思子毒素的抗体的 偶联物中，所述抗相思子毒素的抗体为兔来源的抗相思子毒素的多克隆抗体；所述胶体 金与抗蓖麻毒素的抗体的偶联物中，所述抗蓖麻毒素的抗体为兔来源的抗蓖麻毒素的多 克隆抗体。上述胶体金试纸中，所述检测位置1包被的抗相思子毒素的抗体的浓度为2mg/ mL，所述检测位置2包被的抗蓖麻毒素的抗体的浓度为1.5mg/mL。上述胶体金试纸中，所述胶体金探针是按照包括如下步骤的方法制备得到的 用HAuCl4水溶液和柠檬酸三钠水溶液制备得到胶体金溶液；将所述胶体金溶液的pH值调至8.0，再向胶体金溶液中加入抗蓖麻毒素的抗 体，混勻并放置30min，再加入抗相思子毒素的抗体，混勻并放置30min，再用牛血清白 蛋白进行封闭，离心，收集沉淀；重悬沉淀，得到胶体金与抗相思子毒素的抗体的偶联 物与胶体金与抗蓖麻毒素的抗体的偶联物的混合物，即得到所述胶体金探针；所述抗蓖 麻毒素的抗体与所述胶体金溶液的配比为3mg 100ml,所述抗相思子毒素的抗体与所述 胶体金溶液的配比为3mg IOOml ；上述胶体金试纸中，所述样品垫的材质是玻璃纤维素膜，所述胶金垫的材质是 玻璃纤维素膜，所述反应垫的材质是硝酸纤维素膜，所述吸收垫的材质是吸水滤纸；所述抗抗体为羊抗鼠抗体。上述任一所述的单抗可以用细胞体外培养的方法制备得到。胶体金试纸条中胶体金与抗体通过静电引力和疏水作用结合，因而不会影响抗 体活性。胶体金本身具有肉眼可见的颜色，无需仪器即可判读结果，无需洗涤，不形成免疫复合物的标记抗体通过层析作用自动分离，既简化了操作步骤，又减少了影响实验 结果的干扰因素。该法通常能在15min内完成检测，样品处理方法简便、操作灵活、运 输方便、不需要其他辅助仪器，结果可直观判断，而且试纸条自带质量控制线，实验结 果一目了然。本发明的胶体金试纸具有敏感度高、特异性高、精密度高、准确度高、成 本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本 发明试纸检测相思子毒素的方法，简便、快速、直观、准确，适用范围广，成本低，易 推广应用。
图1为试纸条灵敏度检测结果。图2为试纸条特异性检测结果。图3为试纸条稳定检测结果。图4为试纸条对模拟样品的检测结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。硝酸纤维膜(NC膜)，购于美国Millip0re公司，产品目录号为HFB 504 ；玻璃 纤维膜，购于美国Millipore公司；吸水滤纸购自Minipore公司。实施例1、相思子毒素单克隆抗体和多克隆抗体的制备一、杂交瘤细胞的制备(一 )抗原制备重组质粒 pET-HisA 在文献(Abrin—aA chain expressed as soluble form in Escherichiacoli from a PCR-synthesized gene is catalytically and functionally active Li-Chun Wang a，b，Lin Kang a，Ting-Mao Hu b，Jing-LinWang a， * Biochimie
86(2004)327-333)中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研 究所得到。质粒pET-HisA中含有相思子毒素A链的编码基因。1、相思子毒素A链重组基因工程菌表达抗原蛋白将重组质粒pET-HisA转入E.coliBL21中，Amp抗性筛�。庑蚣ǎ玫窖� 性重组菌，记作BL21-pET-HisA。将重组工程菌BL21-pET_HisA按1 100接入Amp 抗性LB培养基中，130rpm，37°C过夜培养。次日将过夜培养的菌体按1 100接入Amp 抗性LB培养基中，200rpm，37°C, 5h待OD6tltl约0.6时分别保菌，并加入IPTG lmmol/ L，200rpm> 37°C, 4h诱导表达。将诱导表达后的菌体6000rpm，4°C,离心IOmin后 弃上清，将菌体加入PBS重悬，6000rpm、4°C、离心IOmin弃上清。将收集的菌体加 入无咪唑Buffer混勻，冰浴超声破碎，至液体清亮后离心分别收集上清和沉淀，收集的 上清即为可溶性目的蛋白溶液。2XSDS，12%变性蛋白电泳分析。结果蛋白分子量为 31.0kDa。2、相思子毒素A链重组基因工程菌表达抗原蛋白纯化亲和纯化标签是6X组氨酸标签，组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍金属离子，在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低pH下用咪唑竞争洗 脱。将5mL次氨基三乙酸(NTA，Amersham公司)层析介质装入2cmX IOcm玻璃
层析柱中，用去离子水洗数遍，直至介质中的乙醇被洗�。缓蠡郝尤�5体积0.1M的 NiSO4,使Ni2+与介质充分结合，以5体积去离子水洗柱，除去未与介质结合的NiSO4, 用5体积的平衡液平衡柱，将收集的蛋白经0.45μιη滤器过滤后装人镍柱，依次用含 30mM、40mM、50mM、80mM、lOOmM、150mM、200mM 咪唑的平衡液洗脱，每个咪 唑浓度5mLX5次洗脱(即5个柱体积)，分步收集。2XSDS，12%变性蛋白电泳分析。以Ni-NTA亲和柱纯化来自500mL表达工程菌中的相思子重组蛋白A，经咪唑 浓度梯度洗脱，结果目的蛋白均出现在IOOmM咪唑浓度第2柱体积开始洗脱下来的溶 液中，穿透液中无目的蛋白。分别收集100mM-2、3、4、5、6 (柱体积)，150mM_l、 2(柱体积)，经BandScan5.0图像软件分析，重组蛋白A的纯度为96.2%。由于重组蛋 白液的体积稍变大，采用超滤法来浓缩蛋白，使蛋白浓度达到4mg/mL。( 二)动物免疫以实验(一)中制得的蛋白作为免疫原，取50 μ g免疫原与等体积的福氏完全佐 剂充分混勻，首免BALB/c健康小鼠，鼠龄在6 8周，0.5ml/只，腹腔注射。两周后 用IOOug蛋白和等体积福氏不完全佐剂加强免疫1次；隔三周后再用IOOug蛋白和等体积 福氏不完全佐剂加强免疫1次；二免后每周断尾取血，间接ELISA测定效价。细胞融合 前3天加强免疫一次。(三)细胞融合和克隆化鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按7 1比例(数量配比)与SP2/0骨髓 瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳 性孔进行克隆化，直到得到能稳定分泌相思子毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将该细 胞株命名为2号(1F8C5C3H1)，该细胞株已于2010年8月17日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.4062，分类命名 为Abrin-a A链单克隆抗体细胞株。二、单克隆抗体的制备(一)由杂交瘤细胞制备单抗的方法将已经建立的杂交瘤细胞株CGMCC No.4062接种于细胞培养基中，置于37°C和5% CO2孵箱中培养，每隔2d换一次细胞培 养基，待细胞浓度大于105/ml时停止换液，持续培养到细胞全部死亡。收集培养上清， 1500rpm,离心10分钟，取上清；上清含有高水平的单克隆抗体，-20°C保存备用。所 述细胞培养基为无血清培养基(购于美国BioWhittaker公司，产品目录号为12-727F)， 所述细胞培养基的pH为7.4。( 二)单抗纯化方法琼脂糖亲和层析柱购自Amersham公司，产品目录号为17-5080-01。用琼脂糖亲和层析柱进行纯化。具体步骤如下将亲和柱以平衡缓冲液(1L 平衡缓冲液由IOOOml 20mM PB缓冲液和300mmol NaCl组成，pH7.8)平衡，待柱平衡 后，将步骤(一)得到的上清经0.45 μ m滤膜滤过后以lmL/min流速上柱，用平衡缓冲液以lmL/min流速洗脱杂蛋白，监测，待杂蛋白洗脱彻底后换洗脱液(0.1M柠檬酸缓冲 液，pH4.0)将抗体洗下。收集洗下的抗体，收集试管事先已加适量的lmol/L，pH 9.0的 Tris-HCI,使pH恢复至7.4左右，以免失去活性。纯化好的抗体以PB (5mM，pH7.4) X 作液4°C透析，24h，每8h换一次液，再10000r/min离心30min，收集上清，-70°C保存(三)单抗鉴定方法12% SDS变性电泳分析纯度达95 %。三、单抗的性能验证包被液按照如下方法配制Na2C031.59克，，NaHC032.93克，用NaOH调pH 至9.6，定容至IOOOml密封盖好，4°C存放备用；封闭液按照如下方法配制称取3g BSA溶于IOOmlPBST中备用；洗涤液(PBST)按照如下方法配制将999.5ml PBS (0.01M、pH7.2)缓冲液和 0.5mlTween-20混合，得到洗涤液。(一)相对亲和力常数脱毒的天然相思子毒素按照实验四中所述方法制备。间接ELISA测定单抗相对亲和常数，将脱毒的天然相思子毒素用包被液稀释至 8yg/ml,加入酶联孔，ΙΟΟμΙ/孔，4°C过夜。次日，吸出孔内液体，用洗涤液洗板三 遍，在加入封闭液，150μ1/孔，37°C孵育Ih后弃孔内液体，重复洗板步骤。将纯化 好的单克隆抗体梯度稀释100yg/ml 0.0125 μ g/ml(具体为100yg/ml、50 μ g/mk 25μ g/ml> 12.5μ g/ml> 6.25μ g/ml> 3.125 μ g/ml、1.6yg/mK 0.8μ g/ml> 0.4 μ g/ ml、0.2 μ g/ml、0.1 μ g/ml、0.05 μ g/ml、0.025 μ g/ml、0.0125 μ g/ml)，100 μ 1/ 孔， 37°C孵育lh。洗板后加入稀释好的酶标二抗(羊抗鼠IgG)，ΙΟΟμΙ/孔，37°C孵育Ih后 洗板显色，于波长450nm测定A值。以McAb的不同浓度为横坐标，以其相应的A值为 纵坐标，绘制McAb的测定曲线。以各曲线上部趋于平坦段的A值为100%，找出50% A值对应的McAb的浓度，其倒数即为本株McAb的相对亲和力常数，为5.26 X 106。( 二 )效价与特异性应用间接ELISA法进行。将BSA蛋白(阴性对照)、蓖麻毒素、相思子毒素分别 用包被液稀释，包被酶联板，每孔100yL(浓度为lOyg/mL)，4°C过夜后，以PBST洗 3次，用封闭液进行封闭，37°C放置lh，PBST洗3次，加入梯度稀释的抗体(抗体的初 始浓度为 2mg/mL)l IO2, 1 IO3, 1 IO4, 1 IO5, 1 IO6, (100 μ L/孔)，设置 空白对照，37°C作用lh，用PBST洗3次，加入PBST稀释羊抗鼠IgG(l 60000稀释， 100 μ L/ L ), 37°C作用lh，用PBST洗3次，加显色液OPD，显色5min后，用2mol/L H2SO4终止反应，测A450值，阴性均值的2.1倍判定为阳性。抗体在1 IO5时经肉眼 观察和测A450值均为阳性，故判定其抗体效价达105。抗体与蓖麻毒素包被的酶联孔经 肉眼观察和测A450值均为阴性，说明该抗体与蓖麻毒素无交叉反应，特异性良好。四、相思子毒素多克隆抗体的制备(一 )脱毒的相思子毒素制备相思豆在文献(相思豆毒素研究及应用王利春，王景林生物技术通讯.V0115. No2, Mar, 2004)中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研 究所获得。
氨苯基-β -D-半乳糖苷琼脂糖亲和介质(Sigma)、Sephacryl S-100G75凝胶预 装柱(GE)、玻璃层析柱 5mL2cmX IOcm(AKTA)。丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、三羟甲基氨基甲烷 (Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)、考马斯亮蓝R250、二硫苏糖醇(DTT)等均为Sigma公 司产品；低分子量蛋白marker (Amersham Biosciences)、硫酸铵(Amresco0191)其余缓冲 液试剂磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、硫酸铵等均为国产分析纯；实验用 水为亚沸蒸馏水、透析袋(DM-IOmm)。提取将相思豆去壳后称取100g，浸泡于PBS(0.01M，pH7.2)中24h，至种子肿 胀；浸泡后的种子以ddH20反复冲洗去除种子上外膜及颜色，将洗净的种子置于 500mLPBS(0.01M, pH7.2)缓冲液中，于勻浆机中勻浆，并于4°C条件下放置24h ；次 日，将浸提液用脱脂纱布滤去残渣后，在4°C下以12000rpm离心20min，取上清液， 0.45 μ m滤膜过滤，上清液调pH7.2，为黄绿色液体；向上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶 液(pH7.4)至饱和度为30%，4°C磁力搅拌Ih后静止1小时，12000rpm离心20min，弃沉 淀；将上清液继续加饱和硫酸铵液体至90%饱和度，4°C磁力搅拌lh，静止过夜24h;次 日混合液在4°C条件下以12000rpm离心20min，取沉淀为黄绿色；将沉淀用PBS缓冲液 (10mM，pH7.4)50mL溶解后，于4°C条件下对PBS缓冲液透析48h (每8h换一次液)，透 析后经1200g4°C离心20min，取上清，即为相思子毒素粗提液，蛋白定量，12%变性、 非变性SDS电泳分析；-20°C冰冻保存。亲和层析纯化亲和层析介质为氨苯基_ β -D-半乳糖苷琼脂糖亲和介质(购自 sigma公司，产品目录号为A-0414)。取5mL亲和介质真空脱气后，缓慢装入层析柱，注 意避免产生气泡和断层，以至少10倍柱床体积的PBS进行清洗平衡。将相思子毒素粗提 液经0.45 μ m的滤膜过滤后，以平衡液10倍体积稀释，以lmL/min流速加入层析柱内， 使相思子毒素和凝集素充分吸附在柱上。待相思子毒素和凝集素吸附充分后，以平衡液 洗脱杂蛋白，流速控制在lmL/min左右，杂蛋白洗脱完全后，改用含有0 0.2M半乳糖 的PBS缓冲液进行步进式梯度洗脱，整个过程分部收集，紫外检测其吸收值进行监控。 收集各吸收峰处组分，真空干燥离心浓缩后对PBS透析除去半乳糖，冰冻备用。透析袋 应煮沸清洗后使用，透析时每隔2h更换一次透析液，随着透析时间的延长，更换透析液 的时间也可适当延长，时间总计24h以上。平衡液为0.01M，pH7.2的PBS缓冲液。凝胶过滤层析凝胶过滤柱为SephaCrylTMS-100G75凝胶预装柱，购自 Amersham公司。将亲和层析浓缩后的样品经0.22 μ m的滤膜过滤后上样，上样体积 为3mL，浓度10mg/mL左右；以PBS为洗脱液进行洗脱，流速0.5mL/min，分部收集 3mL/管，紫外测定后合并第二吸收峰各组分，12%变性、非变性SDS电泳分析为相思子 毒素蛋白；得到的相思子毒素透析、浓缩后-20°C保存。脱毒用PBS(0.1M，pH 7.4)稀释凝胶过滤后的相思子毒素蛋白至0.2_0.3mg/ ml,放置PBS缓冲液(0.1M，pH 8.1)中，35°C透析7天，然后再放入PBS (0.01M，pH 7.4)中透析48h，12000rpm离心lOmin，取上清液分装，_20°C保存。天然的相思子毒素蛋白和脱毒的相思子毒素蛋白的氨基酸序列均为SEQID NO l.o
2、相思子多克隆抗体制备多克隆抗体可委托生物公司制备，也可自己制备。自己制备的方法如下用脱毒的天然相思子毒素200 μ g与等体积的福氏完全佐剂充分混勻，免疫新西 兰纯种大耳白兔。两周后用0.5mg脱毒的天然相思子毒素和等体积福氏不完全佐剂加强 免疫1次；隔三周后再用Img脱毒的天然相思子毒素和等体积福氏不完全佐剂加强免疫 1次；此后每周耳缘静脉采血，间接ELISA测定效价。加强免疫后的第7天，血清的效 价最高，为106(多抗效价测定方法与单抗效价测定方法相同，包被抗原的浓度为IOyg/ ml)；取此血清进行多抗纯化。用琼脂糖亲和层析柱进行纯化。具体步骤如下将亲和柱以平衡缓冲液(1L 平衡缓冲液由1000ml 20mM PB缓冲液和300mmol NaCl组成，pH7.8)平衡，待柱平衡 后，将兔血清经0.45μιη滤膜滤过后以平衡缓冲液10倍体积稀释后，再以lmL/min流速 上柱，用平衡缓冲液以lmL/min流速洗脱杂蛋白，监测，待杂蛋白洗脱彻底后换洗脱液 (0.1M柠檬酸缓冲液，pH4.0)将抗体洗下。收集洗下的抗体，收集试管事先已加适量的 lmol/L, pH 9.0的Tris-HCI，使pH恢复至7.4左右，以免失去活性。纯化好的抗体以 PB(5mM, pH7.4)工作液 4°C透析，24h,每 8h 换一次液，再 10000r/min 离心 30min，收 集上清，-70°C保存备用。实施例2、蓖麻毒素的多抗制备—、制备脱毒的蓖麻毒素蓖麻种子购自北京秀禾种子有限公司，产品目录号为蓖麻1号。粗提将蓖麻种子去壳后称取100g，浸泡于PBS(0.01M，pH7.2)中24h，至种 子肿胀；去壳洗净，将洗净的种子置于500mLPBS(0.01M，pH7.2)缓冲液中，于勻浆机 中勻浆，并于4°C条件下浸提过夜24h(放置24h)；次日，将浸提液用脱脂纱布滤去残渣 后，在4°C下以12000rpm离心20min，取上清液，0.45 μ m滤膜过滤，上清液调pH7.2 ； 向上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液(pH7.4)至饱和度为30%，4°C磁力搅拌Ih后静止1 小时，12000rpm离心20min，弃沉淀；将上清液继续加饱和硫酸铵液体至90 %饱和度， 4°C磁力搅拌lh，静止过夜24h ；次日混合液在4°C条件下以12000rpm离心20min，取沉 淀为白色；将沉淀用PB(10mM，pH7.4)50mL溶解后，于4°C条件下对PBS缓冲液透析 48h(每8h换一次液)，透析后经1200g4°C离心20min，取上清，即为蓖麻毒素粗提液， 蛋白定量，12%变性、非变性SDS电泳分析；-20°C冰冻保存。亲和层析纯化亲和层析介质为氨苯基_ β -D-半乳糖苷琼脂糖亲和介质(购自 sigma公司，产品目录号为A-0414)。取5mL亲和介质真空脱气后，缓慢装入层析柱， 注意避免产生气泡和断层，以至少10倍柱床体积的PBS进行清洗平衡。将蓖麻毒素粗 提液经0.45 μ m的滤膜过滤后，以平衡液10倍体积稀释，以lmL/min流速加入层析柱 内，使蓖麻毒素和凝集素充分吸附在柱上。待蓖麻毒素和凝集素吸附充分后，以平衡液 洗脱杂蛋白，流速控制在lmL/min左右，杂蛋白洗脱完全后，改用含有0.1M半乳糖的 PBS缓冲液一步洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，12%变性、非变性SDS电泳分析。平衡液 为0.01M，pH7.2的PBS缓冲液。凝胶过滤层析凝胶过滤柱为SephaCrylTMS-100G75凝胶预装柱，购自
Amersham公司。将亲和层析浓缩后的样品经0.22 μ m的滤膜过滤后上样，上样体积为5mL,浓度2mg/mL;以PBS为洗脱液进行洗脱，流速0.5mL/min，紫外测定后合并第 二吸收峰各组分，12%变性、非变性SDS电泳分析为蓖麻毒素蛋白；得到的蓖麻毒素透 析、浓缩后-20°C保存。脱毒用PBS(0.1M，pH 7.4)稀释凝胶过滤后的蓖麻毒素蛋白至0.2_0.3mg/ ml,放置PBS缓冲液(0.1M，pH 8.1)中，35°C透析7天，然后再放入PBS (0.01M，pH 7.4)中透析48h，12000rpm离心lOmin，取上清液分装，_20°C保存。天然的蓖麻毒素蛋白的氨基酸序列均为SEQIDNO : 2。二、蓖麻毒素多克隆抗体制备多克隆抗体可委托生物公司制备，也可自己制备。自己制备的具体方法如下用脱毒的蓖麻毒素200 μ g与等体积的福氏完全佐剂充分混勻，免疫新西兰纯种 大耳白兔。两周后用0.5mg脱毒的天然相思子毒素和等体积福氏不完全佐剂加强免疫1 次；隔三周后再用Img脱毒的天然相思子毒素和等体积福氏不完全佐剂加强免疫1次； 此后每周耳缘静脉采血，间接ELISA测定效价。加强免疫后的第7天，血清的效价最 高，为106(多抗效价测定方法与相思子毒素单抗效价测定方法相同，不同的是包被原为 蓖麻毒素，包被原的浓度为lOyg/ml)；取此血清进行多抗纯化。多抗纯化与相思子毒素的多抗纯化方法相同。实施例3、胶体金试纸的制备及性能检测一、制备(一)样品垫的制备样品垫的材料为玻璃纤维膜；将玻璃纤维膜进行如下处理，以有效去除胶体金试纸的非特异现象及增加其灵 敏度将样品垫置于含鼠血清蛋白、pH为9.9、O.lmol/L碳酸盐缓冲液中浸泡2h，37°C 烘2h备用；鼠血清蛋白在缓冲液中的终浓度为0.4% (体积百分含量)。封闭剂可以封 闭过多的结合位点，提高PH值可以使样品中蛋白更易结合。(二)胶金垫的制备1、确定最低偶联抗体浓度的确定(1)取11只洁净的试管，分别编号1、2、3、…7，在已编号的7个试管内，分 别加入pH值为8.0的胶体金溶液lmL。将抗相思子毒素兔多抗和抗蓖麻毒素兔多抗分别 稀释至0.2mg/mL，并分别进行如下步骤(2)和(3)。(2)在2 6号管内分别加入0.2mg/mL单抗溶液250μ1、200 μ 1、150 μ 1、 100 μ 1、50 μ 1，第1、7管不加作对照，混勻，放置5min。(3)在2 6号管内分别加入10% (质量百分含量)NaCL水溶液100 μ L，1号 管不加作对照。混勻后室温静置20min，观察颜色变化。未加抗体(7号对照管)及抗体 加入量不足以稳定胶体金的试管中的液体颜色呈现由红变蓝的变化，而加入抗体量达到 或超过最低稳定剂量的试管则保持红色不变。与对照管(1号试管)相比，颜色最接近、 含抗体剂量最低的试管所含的抗体剂量，即为ImL胶体金所必须的抗体稳定剂量。实验结果表明，ImL胶体金溶液的抗相思子毒素兔多抗的最低稳定剂量为 30 μ g，ImL胶体金溶液的抗蓖麻毒素兔多抗的最低稳定剂量为30 μ g。2、胶体金探针制备将0.01% (质量百分含量)HAuCl4水溶液煮沸，再加入(质量百分含量)柠檬酸三钠水溶液，混勻并继续加热，直到液体颜色稳定成 葡萄酒红色，得到胶体金溶液；其中HAuCl4水溶液与柠檬酸三钠水溶液的体积比为 IOOml 1.5ml ；(混勻时持续加热，一般约IOmin，但主要依据液体颜色而定。)调节胶体金溶液pH值至8.0，向胶体金溶液中先加入抗蓖麻毒素兔多克隆抗 体，混勻，室温(25°C)放置30min，再加入抗相思子毒素兔多克隆抗体(抗蓖麻毒素兔 多克隆抗体与胶体金溶液的配比为3mg 100ml,抗相思子毒素兔多克隆抗体与胶体金 溶液的配比为3mg IOOml ；)，混勻并室温(25°C )放置30min ；再加入牛血清白蛋白 (BSA) (BSA在混合溶液中的质量百分浓度为1%;目的是封闭)，混勻并室温(25°C)静 置lOmin，再4°C静止15min，以12000rpm，4°C离心30min，弃上清，收集沉淀；将沉底 以重悬液(1L重悬液组成988ml 0.01M、pH 8.0的Tris-HCL缓冲液，50g BSA，IOg蔗 糖，12ml Tween-20)溶解，以12000rpm，4°C离心30min，弃上清，留下管底暗红色疏松 状沉淀；用重悬液重新悬浮沉淀，得到胶体金与抗相思子毒素的抗体的偶联物与胶体金 与抗蓖麻毒素的抗体的偶联物的混合物，即得到所述胶体金探针溶液，置4°C保存。胶体金颗粒与胶体金探针的电镜观察用透射电镜分别对胶体金颗粒与胶体金 探针进行检测。结果，透射电镜下，可见胶体金颗粒呈圆形或椭圆形，大小均勻一致， 计数100个金颗粒，颗粒直径约为25nm;胶体金偶联抗体后，可见金颗粒外围有明显的 低电子密度晕圈，表面吸附有蛋白。结果表明，制备的胶体金颗粒和免疫金探针合格。3、胶金垫的制备用玻璃纤维膜作支撑物，在支撑物上加胶体金探针，37°c干 燥 2.5h。(三)反应垫的制备用硝酸纤维素膜(NC膜)作为支撑物，向膜上喷涂相思子毒素单抗条带、抗蓖 麻毒素兔多抗条带、羊抗鼠抗体条带。检测带1 (Tl带)喷涂相思子毒素单抗(以5mM PBS缓冲液稀释成2.0、1.5、 l.Omg/mL的浓度)。检测带2(T2带)喷涂蓖麻毒素的多抗(以5mM PBS缓冲液稀释成 2.0、1.5、1.0mg/mL的浓度)。质控带(C带)喷涂羊抗鼠抗体lmg/mL。用CAMAG 公司的Camag Linomat 5TLC点样仪将样品喷到2.5mm宽的NC膜上(点样速度为50mm/ S)。把划完线的NC膜置于37°C干燥2h，得到反应垫。用相应天然毒素检测以确定最佳的抗体喷膜浓度。分别将天然相思子毒素和蓖 麻毒素稀释成50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、2yg/mL,以制备好的胶体金免疫层析 试纸条按照方法检测，PBS溶液样品作为阴性对照。当Tl带喷膜浓度为1.5或l.Omg/ mL时，检测相思子浓度仅达100ng/mL以上；T2带喷膜浓度为2.0或1.5mg/mL时，检 测灵敏度均可达50ng/mL，而喷膜浓度为1.0mg/mL时，灵敏度下降至lOOng/mL以上。 应选择阳性带显色，无交叉反应且所需抗体量最低的喷膜浓度。实验设3次重复，结果一致。结果表明，最佳喷膜浓度分别为Tl带2mg/ mL, T2带1.5mg/mL，无非特异反应。(四)试纸的制备免疫层析试纸由吸收垫、胶金垫、反应垫和样品垫四部分依次连接而成。吸收垫的材质是吸水滤纸。将样品垫、胶金垫、反应垫和吸收垫依次按顺序叠加粘到PVC板上；样品垫的末端与胶金垫的始端相连，胶金垫的末端与反应垫的始端相连，反应垫的末端与吸水垫 的始端相连，得到胶体金试纸。组装成完整的试纸条，然后切割成4mm/条，干燥避光 保存。检测带和质控带均为与试纸条的长相垂直的条带状。二、胶体金试纸的使用方法取稀释好的待检测样品100 μ L加入到胶体金试纸的样品垫始端(或向胶体金试 纸的样品垫中滴加稀释好的待检测样品80 μ L)，15min后，用肉眼观察检测带和质控带 的显色情况，根据其显色情况，判定样品中是否含有相思子毒素和蓖麻毒素。判定方法如下阴性当质控带显示为红色条带，而检测带不显色时，判为阴性。阳性当质控带显示为红色条带，检测带1同时也显示为红色条带，判为相思 子毒素阳性；当质控带显示为红色条带，检测带2同时也显示为红色条带，判为蓖麻毒 素阳性；当质控带显示为红色条带，检测带1、2同时也显示为红色条带，判为相思子和 蓖麻毒素阳性；无效当质控带不显色时，则无论检测带显示为红色条带与否，该胶体金试纸 均判为无效。该胶体金试纸的检测原理当在试纸的样品垫端滴加待测样品溶液后，待检溶 液流向胶金垫并与胶金垫中的胶体金探针(即金标抗体)通过抗原-抗体相互作用而结 合，并继续向反应垫扩散，并最终渗入吸收垫中。若待检测样品溶液中含有相思子毒 素，相思子毒素与胶金垫中的抗相思子毒素的兔多克隆抗体结合，形成抗原-多抗复合 物，当其扩散至反应垫时，抗原-多抗复合物中的抗原会与检测带1上的抗相思子毒素单 抗结合，进而检测带1显色。若待检测样品溶液中含有蓖麻毒素，蓖麻毒素与胶金垫中 的抗蓖麻毒素的兔多克隆抗体结合，形成抗原-多抗复合物，当其扩散至反应垫时，抗 原-多抗复合物中的抗原会与检测带2上的抗蓖麻毒素的兔多克隆抗体结合，进而检测带 2显色。三、胶体金试纸的性能检测下述实验中，样品处理液的组成PBS(0.01M，pH7.2)+0.5% Tween-20。相思子毒素为实施例1中制备，蓖麻毒素为实施例2中制备。(一)灵敏度检测实验组1:将相思子毒素用样品处理液稀释成如下不同浓度2yg/mL、 200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL ；实验组2:将蓖麻毒素用样品处理液稀释成如下不同浓度2yg/mL、200ng/ mL、100ng/mL、50ng/mL ；实验组3:将两种毒素以相同浓度等体积混合后，再梯度稀释成400ng/mL、 200ng/mL、100ng/mL (即混合液中，两种毒素的浓度分别依次为400ng/mL、200ng/ mL、100ng/mL)；分别用实验一制备的胶体金试纸按照实验二中所述方法检测。同时以PBS缓冲 液为对照。实验设3次重复，结果均一致。结果如图1所示。图中，A表示对相思子毒素的单独检测结果；B表示对蓖麻毒素的单独检测结果；C表示对两种毒素的同时检测结 果；结果显示该试纸条单独检测蓖麻或相思子毒素时灵敏度达50ng/mL，同时检 测两种毒素时灵敏度达100ng/mL。(二)特异性评价葡萄球菌肠毒素B (SEB)购自SIGMA公司，产品目录号为S0812。将相思子毒素、蓖麻毒素、葡萄球菌肠毒素B (SEB)、牛血清白蛋白均用PBS 分别配制成浓度为lOOng/mL的溶液；将相思子毒素和蓖麻毒素以相同浓度等体积混合 后，再梯度稀释成lOOng/mL的溶液(即混合液中，两种毒素的浓度分别为lOOng/mL)。 分别用实验一制备的胶体金试纸按照实验二中所述方法检测。实验设3次重复，结果一致。结果试纸条特异性良好，与葡萄球菌肠毒素B、 牛血清白蛋白均无交叉反应(图2)。(三)稳定性试验将新制备的胶体金试纸条于37°C存放2天、3天、4天或5天；取存放5天的试 纸进行检测，以检测试纸条的敏感性。实验组I(Abrin):将相思子毒素用样品处理液稀释成如下不同浓度IOOng/ mL、50ng/mL ；实验组2 (Ricin)将蓖麻毒素用样品处理液稀释成如下不同浓度lOOng/mL、 50ng/mL ；实验组3(Both)将两种毒素以相同浓度等体积混合后，再梯度稀释成200ng/ mL、100ng/mL ；(即混合液中，两种毒素的浓度分别依次为200ng/mL、100ng/mL)PBS溶液样品作为阴性对照。实验设3次重复，结果一致。结果存放2天、3天、4天、5天的试纸条的灵 敏度无显著差异(图3)，和新制备的检测试纸条相比(图1)，灵敏度没有明显下降，且 特异性仍很好。说明该试纸条可在室温存放6个月(根据生物制品规程中快速稳定性试 验规定37°C存放20天相当于室温存放18个月，根据此推算5天相当于6个月)。(四)模拟环境检测检测样品的制备Both将两种毒素以相同浓度等体积混合后，分别用下述牛奶混合液、橙汁混 合液、土壤溶液或水进行梯度稀释至如下浓度400ng/mL、200ng/mL、lOOng/mL(即 混合液中，两种毒素的浓度分别依次为400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL),分别得到 的稀释液分别用于检测。Ricin 将蓖麻毒素分别用下述牛奶混合液、橙汁混合液、土壤溶液或水进行梯 度稀释至如下浓度200ng/mL、lOOng/mL、50ng/mL,分别得到的稀释液分别用于检 测。Abrin 将相思子毒素分别用下述牛奶混合液、橙汁混合液、土壤溶液或水进行 梯度稀释至如下浓度200ng/mL、lOOng/mL、50ng/mL,分别得到的稀释液分别用于 检测。1、牛奶将牛奶与PBS缓冲液以1 4的体积比混合，得到牛奶混合液；
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2、果汁将橙汁与PBS缓冲液以1 4的体积比混合，0.IM K2CO3水溶液调节 PH7.4,得到橙汁混合液；3、自来水。4、土壤用PBS缓冲液溶解土壤(土壤与PBS缓冲液的配比为2g IOml)， 得到土壤溶液。实验设3次重复，结果一致。结果如图4所示，该试验证明该试纸条在检测模拟 样本时，对相思子毒素的检测灵敏度为50ng/ml，对蓖麻毒素的检测灵敏度为50ng/ml， 对相思子毒素和的蓖麻毒素共同检测时灵敏度为lOOng/ml;说明该试纸条可以检测模拟 环境样本。
权利要求
1.抗相思子毒素的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCCNo.4062的Abrin-a A链单 克隆抗体细胞株分泌的。
2.保藏编号为CGMCCNo.4062的Abrin_a A链单克隆抗体细胞株。
3.—种用于检测相思子毒素和/或蓖麻毒素的胶体金试纸，包括样品垫、胶金垫、 反应垫和吸收垫，其依次连接；所述胶金垫包被有胶体金探针；所述反应垫上设有检测 位置1、检测位置2和质控位置，检测位置1包被有抗相思子毒素的抗体，检测位置2包 被有抗蓖麻毒素的抗体，质控位置包被有抗抗体；所述胶体金探针为如下1)和2)的混 合物1)胶体金与抗相思子毒素的抗体的偶联物；2)胶体金与抗蓖麻毒素的抗体的偶联 物。
4.根据权利要求3所述的胶体金试纸，其特征在于所述检测位置1包被的抗相思子 毒素的抗体中，所述抗相思子毒素的抗体是由保藏编号为CGMCC No.4062的Abrin-a A 链单克隆抗体细胞株分泌的。
5.根据权利要求3或4所述的胶体金试纸，其特征在于所述检测位置2包被的抗蓖麻毒素的抗体中，所述抗蓖麻毒素的抗体为抗蓖麻毒素 的多克隆抗体；所述胶体金与抗相思子毒素的抗体的偶联物中，所述抗相思子毒素的抗体为抗相思 子毒素的多克隆抗体；所述胶体金与抗蓖麻毒素的抗体的偶联物中，所述抗蓖麻毒素的抗体为抗蓖麻毒素 的多克隆抗体。
6.根据权利要求3-5中任一所述的胶体金试纸，其特征在于所述检测位置2包被的抗蓖麻毒素的抗体中，所述抗蓖麻毒素的抗体为兔来源的抗 蓖麻毒素的多克隆抗体；所述胶体金与抗相思子毒素的抗体的偶联物中，所述抗相思子毒素的抗体为兔来源 的抗相思子毒素的多克隆抗体；所述胶体金与抗蓖麻毒素的抗体的偶联物中，所述抗蓖麻毒素的抗体为兔来源的抗 蓖麻毒素的多克隆抗体。
7.根据权利要求3-6中任一所述的胶体金试纸，其特征在于所述检测位置1包被的 抗相思子毒素的抗体的浓度为2mg/mL，所述检测位置2包被的抗蓖麻毒素的抗体的浓度 为 1.5mg/mL0
8.根据权利要求3-7中任一所述的胶体金试纸，其特征在于所述胶体金探针是按 照包括如下步骤的方法制备得到的用HAuCl4水溶液和柠檬酸三钠水溶液制备得到胶体 金溶液；将所述胶体金溶液的pH值调至8.0，再向胶体金溶液中加入抗蓖麻毒素的抗体，混 勻并放置30min，再加入抗相思子毒素的抗体，混勻并放置30min，再用牛血清白蛋白进 行封闭，离心，收集沉淀；重悬沉淀，得到胶体金与抗相思子毒素的抗体的偶联物与胶 体金与抗蓖麻毒素的抗体的偶联物的混合物，即得到所述胶体金探针；所述抗蓖麻毒素 的抗体与所述胶体金溶液的配比为3mg 100ml,所述抗相思子毒素的抗体与所述胶体金 溶液的配比为3mg IOOml ；
9.根据权利要求3-8中任一所述的胶体金试纸，其特征在于所述样品垫的材质是玻璃纤维素膜，所述胶金垫的材质是玻璃纤维素膜，所述反应垫的材质是硝酸纤维素 膜，所述吸收垫的材质是吸水滤纸； 所述抗抗体为羊抗鼠抗体。
全文摘要
本发明公开了一种联合检测相思子毒素和蓖麻毒素的胶体金试纸及专用单克隆抗体。抗相思子毒素的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.4062的Abrin-a A链单克隆抗体细胞株分泌的。本发明的胶体金试纸具有敏感度高、特异性高、精密度高、准确度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸检测相思子毒素的方法，简便、快速、直观、准确，适用范围广，成本低，易推广应用。
文档编号G01N33/558GK102020714SQ20101029188
公开日2011年4月20日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者周阳, 康琳, 王俊虹, 王利春, 王景林, 聂聪, 高姗 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
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