专利名称：一种筛选抗体的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选抗体的方法。
背景技术：
借助蛋白展示技术的高通量抗体筛选已经成为现在抗体制备的主要方法之一。 噬菌体展示技术、核糖体展示技术和酵母展示技术已经被广泛的应用于新抗体的筛选和 抗体亲和力的改进。展示的抗体能与目的抗原结合从而被快速的从复杂的抗体文库中 筛选出来。通常用于抗体筛选的抗原是已知的可溶性纯化抗原。然而许多疾病的分子 标记都定位于细胞膜表面，并且具有复杂的翻译后修饰，例如糖基化(Ohtsubo K, Marth JD :Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell 2006， 126(5) :855-867.)。糖基化丢失会影响蛋白的折叠效率和稳定性(Shental-Bechor D， Levy Y :Folding of glycoproteins toward understanding the biophysics of the glycosylation code. Curr Opin Struct Biol 2009，19 (5) :524_533·)。并且许多癌细 胞表面的糖基化都有明显变化(Kim YJ, Varki A !Perspectives on the significance of altered glycosylation of glycoproteins in cancer. Glycoconj J 1997，14(5) 569-576.)。可是通过生物工程技术进行生产和纯化的可溶性抗原通常会丢失翻译后 修饰，无法真实反映天然抗原的构象(Liat Binyamina HBaLMW Cancer therapy with engineered monoclonal antibodies Update on Cancer Therapeutics 2006,1 (2) 147-157. Linenberger ML,Maloney DG,Bernstein ID :Antibody_directed therapies for hematological malignancies. Trends Mol Med 2002,8(2) :69_76.)。而且有时抗原是未 知的分子，无法获得纯化的抗原。因此如果能以完整细胞为抗原筛选特异结合细胞表面抗 原的抗体，才有利于筛选到识别天然抗原表位的新抗体，将更加有利于临床的诊断和治疗。到目前为止，噬菌体展示系统和酵母展示系统都已被证明能够直接以完整的细胞 作为抗原，筛选特异识别细胞表面抗原的抗体。但是噬菌体展示技术由于展示效率有限，不 是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达。而且在噬菌体扩增的过程中，由于插入片 段性质的不同，可能呈现出生长差异，从而可能丢失文库多样性。此外，噬菌体展示系统难 以展示分子量较大的蛋白，因此不能成功展示完整的IgG抗体分子。而酵母展示技术由于 受到转化效率的影响，很难构建足够大的抗体文库。通常文库大小< 108。细菌原生质体展示技术(APEx) (Harvey BR, Georgiou G, Hayhurst A, Jeong KJ, Iverson BL, Rogers GK Anchored periplasmic expression, a versatile technology for the isolation of high-affinity antibodies from Escherichia coli-expressed libraries. Proc Natl Acad Sci USA 2004,101(25) :9193_9198.)是一种高效的细菌展示 技术。APEx展示技术是将蛋白质表达定位到细菌周质空间中，蛋白质通过N端融合的内膜 脂蛋白NlpA的六个氨基酸序列(CDQSSS)以共价酯化的方式锚定在内膜外侧，或者是通过 C端融合的M13噬菌体外壳蛋白3 (g3p)的N端片断锚定在内膜中，从而将目的蛋白展示到 周质空间。然后可以通过EDTA和溶菌酶的作用将细菌的外膜去掉，从而将内膜上锚定的蛋白质暴露出来。暴露的抗体可以和荧光标记的抗原结合从而使细菌获得明显的荧光。通过 流式分选可以将特异结合抗原的细菌分选出来，从而获得相应的抗体。APEx展示系统具有许多优点。(I)APEx展示系统是一种细菌展示系统，容易构建 巨大的抗体文库(> IO9)。(2)锚定方式多样，可以选择C端或N端锚定。(3)由于抗体展 示在内膜表面，而内膜不含有LPS或其它复杂的多糖类等外膜的成份，表面相对平整因此 不会对大分子抗原与抗体的结合产生空间影响。因此，APEx系统展示的抗体可有效的结合 分子量高达240kDa的可溶性抗原。(4)抗体的展示只需要穿过一层细胞膜，而不需要像酵 母展示或细菌外膜展示系统那样要穿越细胞外壁，这使得抗体的展示不会受分子量和空间 结构的限制，展示效果更好。因此，APEx系统能够成功地展示完整的IgG抗体(Mazor Y,Van Blarcom Τ, Mabry R, Iverson BL, Georgiou G :Isolation of engineered, full-length antibodies from libraries expressed in Escherichia coli. Nat Biotechnol 2007, 25(5) :563-565.)。并且完整的IgG抗体具有两个抗原结合位点，可以产生二价结合，这将 有利于筛选单价结合亲和力较低的抗体。(5)可以直接利用广泛使用的噬菌体展示载体来 进行蛋白表达，这使得可以直接利用许多噬菌体展示的单链抗体的文库资源。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种筛选与目标蛋白结合的目的蛋白的方法。本发明所提供的筛选与目标蛋白结合的目的蛋白的方法，包括如下步骤1)将目标蛋白展示于真核细胞的细胞膜表面，得到表面展示有目标蛋白的真核细 胞；2)将待筛选蛋白库中的各蛋白分别展示于细菌原生质体表面，得到表面展示有待 筛选蛋白的细菌原生质体库；3)将步骤1)得到的真核细胞与步骤2)得到的细菌原生质体库共同孵育，使展示 于所述真核细胞表面的目标蛋白和展示于所述细菌原生质体表面的蛋白之间发生特异性 的相互配对，得到所述真核细胞与所述细菌原生质体的特异性结合物，将所述结合物从孵 育体系中分离出来；4)从步骤3)得到的结合物中分离得到与展示于真核细胞表面的目标蛋白特异性 结合的目的蛋白或目的蛋白的编码基因。上述筛选方法中，所述待筛选蛋白库为含有与目标蛋白结合的目的蛋白的待筛选 蛋白库。即该方法适合于含有与目标蛋白结合的目的蛋白的待筛选蛋白库。上述筛选方法中，待筛选蛋白库可以是现有的用于噬菌体展示技术的可筛选的蛋 白库，也可以是现有的包含更大的抗体(例如完整的IgG)的蛋白库。上述任一所述筛选方法中，所述步骤3)中，所述孵育的条件包括所述孵育体系 的 PH 值为 5. 0-7. 5，具体为 5. 0,5. 3,5. 5,5. 8,6. 0,6. 3,6. 5,6. 8,7. 0,7. 3,7. 5。上述任一所述筛选方法中，所述步骤3)中，所述孵育的条件包括温度为 30-37°C，具体为30°C或37°C ；时间为0. 5-2小时，具体为0. 5h或Ih或2h。上述任一所述筛选方法中，所述步骤3)中，所述将所述结合物从孵育的体系中分 离出来的方法包括，首先使用平板淘选法筛选，然后使用流式分选法分选。上述任一所述筛选方法中，使用流式分选法的步骤为首先从所述孵育体系中去除未同所述真核细胞形成特异性结合物的细菌原生质体，再通过流式细胞仪筛选，收集所 述真核细胞与原生质体发生特异性结合的结合物。上述流式细胞仪筛选方法中，所述从所述孵育体系中去除未形成结合物的细菌原 生质体的方法为将所述孵育的体系300g离心1. 5-3分钟后，收集沉淀，弃去上清。上述任一所述筛选方法中，所述将所述结合物从孵育的体系中分离出来的方法 中；淘选法为在平板上淘选可结合的细菌原生质体，它主要是一种定性的筛�。前涯芄唤� 合的细菌原生质体都筛选出来，而不是根据结合力强弱来进行筛选。而流式细胞分选技术 是一种具有高通量，多参数定量分选能力的技术，它能够根据亲和力强弱进行定量的筛选。上述任一所述筛选方法中，所述步骤1)中，所述将目标蛋白展示于真核细胞的细 胞膜表面是由包括如下步骤的方法制备得到的将含有所述目标蛋白编码基因的重组载体 转入所述真核细胞中，得到重组真核细胞，培养该重组真核细胞并诱导所述重组载体的表 达，得到所述表面展示有目标蛋白的真核细胞；所述真核表达载体可以是任何可在真核细胞膜表面展示的载体。优选是 pUHD10-3-display(SEQ ID :6)，该载体是按照如下方法得到的将DNA片段插入pUHD10_3 载体中四环素调控的启动子下游的EcoR I和Xba I之间，得到中间重组载体；再将所述目 标蛋白的编码基因插入所述中间重组载体的Bgl II和Sal I位点间，得到所述目标蛋白的 编码基因的重组载体；所述DNA片段的序列如下所示，制备方法为以载体pDisplay为模板，用如下引物 对进行PCR扩增得到的上游弓丨物ACGCGAATTCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCT下游弓丨物AACTAGTCTAGACTAACGTGGCTTCTTCTGCCAAAGCAT。所述真核细胞可以是CH0、C0Sl、C0S7、293T、HeLa、HCT116等，优选是H1299细胞株。上述任一所述筛选方法中，所述步骤1)中，所述目标蛋白的编码基因是人源化 的。上述任一所述筛选方法中，所述步骤2)中，将待筛选蛋白库中的各蛋白分别展示 于细菌原生质体表面的方法包括如下步骤将待筛选蛋白的编码基因插入细菌表达载体 中，得到表达所述待筛选蛋白的重组载体，将所述表达待筛选蛋白的重组载体转入宿主细 菌，得到重组细菌，培养所述重组细菌并诱导所述重组载体的表达，再提取重组细菌的原生 质体，得到所述表面展示有待筛选蛋白的细菌原生质体。所述的细菌中还可以转入用于通过荧光信号筛选原生质体的荧光蛋白表达载体， 该载体可以是在细菌中表达任何颜色荧光蛋白质的载体，优选为PBAD30-KmR-GFPmut2。所述的细菌可以是各种大肠杆菌如DH10B，Topl0，JM109，BL21等，优选为大肠杆 菌 Jude-I上述任一所述筛选方法中，所述步骤4)中，所述从结合物中分离得到目的蛋白或 目的蛋白的编码基因的方法包括如下步骤从所述结合物中提取所述表达目的蛋白的重组 载体，将重组载体进行测序，得到所述目的蛋白的编码基因。实际应用中，所述目标蛋白可为抗原，所述待筛选蛋白可为抗体；所述抗体具体可 为特异识别人源细胞表面抗原的抗体。
本发明的另一个目的是提供一种使用上述方法辅助鉴定蛋白是否与目标蛋白结 合的方法。本发明所提供的辅助鉴定蛋白是否与目标蛋白结合的方法，包括如下步骤1)将目标蛋白展示于离体真核细胞的细胞膜表面，得到表面展示有目标蛋白的真 核细胞；2)将待鉴定蛋白库中的各蛋白分别展示于细菌原生质体表面，得到表面展示有待 鉴定蛋白的细菌原生质体库；3)将步骤1)得到的真核细胞与步骤2)得到的细菌原生质体库共同孵育，使展示 于所述真核细胞表面的目标蛋白和展示于所述细菌原生质体表面的蛋白之间发生特异性 的相互配对，得到所述真核细胞与所述细菌原生质体的特异性结合物，检测孵育的体系中 是否含有所述特异性结合物，若含有所述特异性结合物，则所述待鉴定蛋白与所述目标蛋 白结合，若不含有所述特异性结合物，则所述待鉴定蛋白不与所述目标蛋白结合。上述鉴定方法中，所述待鉴定蛋白库为含有与目标蛋白结合的目的蛋白的待筛选 蛋白库。即该方法适合于含有与目标蛋白结合的目的蛋白的待鉴定蛋白库。上述鉴定方法中，待鉴定蛋白库可以是现有的用于噬菌体展示技术的可筛选的蛋 白库，也可以是现有的包含更大的抗体(例如完整的IgG)的蛋白库。上述任一所述鉴定方法中，所述步骤3)中，所述孵育的条件包括所述孵育体系 的 PH 值为 5. 0-7. 5，具体为 5. 0,5. 3,5. 5,5. 8,6. 0,6. 3,6. 5,6. 8,7. 0,7. 3,7. 5。上述任一所述鉴定方法中，所述步骤3)中，所述孵育的条件包括温度为30-37°C 和时间为0. 5-2小时。上述任一所述鉴定方法中，所述步骤3)中，检测孵育的体系中是否含有所述特异 性结合物的方法是流式细胞仪检测。上述任一所述鉴定方法中，所述步骤3)中，可将所述结合物从孵育的体系中分离 出来再进行检测，分离方法包括，首先使用平板淘选法筛�。缓笫褂昧魇椒盅》ǚ盅�。上述任一所述鉴定方法中，使用流式分选法的步骤为首先从所述孵育体系中去 除未同所述真核细胞形成特异性结合物的细菌原生质体，再通过流式细胞仪筛�。占� 述真核细胞与原生质体发生特异性结合的结合物。上述流式细胞仪筛选方法中，所述从所述孵育体系中去除未形成结合物的细菌原 生质体的方法为将所述孵育的体系300g离心1. 5-3分钟后，收集沉淀，弃去上清。上述任一所述筛选方法中，所述将所述结合物从孵育的体系中分离出来的方法 中；淘选法为在平板上淘选可结合的细菌原生质体，它主要是一种定性的筛�。前涯芄唤� 合的细菌原生质体都筛选出来，而不是根据结合力强弱来进行筛选。而流式细胞分选技术 是一种具有高通量，多参数定量分选能力的技术，它能够根据亲和力强弱进行定量的筛选。上述任一所述筛选方法中，所述步骤1)中，所述将目标蛋白展示于真核细胞的细 胞膜表面是由包括如下步骤的方法制备得到的将含有所述目标蛋白编码基因的重组载体 转入所述真核细胞中，得到重组真核细胞，培养该重组真核细胞并诱导所述重组载体的表 达，得到所述表面展示有目标蛋白的真核细胞；所述真核表达载体可以是任何可在真核细胞膜表面展示的载体。优选是 pUHD10-3-display(SEQ ID :6)，该载体是按照如下方法得到的将DNA片段插入pUHD10_3载体中四环素调控的启动子下游的EcoR I和Xba I之间，得到中间重组载体；再将所述目 标蛋白的编码基因插入所述中间重组载体的Bgl II和Sal I位点间，得到所述目标蛋白的 编码基因的重组载体；所述DNA片段的序列如下所示，制备方法为以载体pDisplay为模板，用如下引物 对进行PCR扩增得到的上游弓丨物ACGCGAATTCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCT下游弓丨物AACTAGTCTAGACTAACGTGGCTTCTTCTGCCAAAGCAT。所述真核细胞可以是CH0、C0Sl、C0S7、293T、HeLa、HCT116等，优选是H1299细胞株。上述任一所述筛选方法中，所述步骤1)中，所述目标蛋白的编码基因是人源化 的。上述任一所述筛选方法中，所述步骤2)中，将待筛选蛋白库中的各蛋白分别展示 于细菌原生质体表面的方法包括如下步骤将待筛选蛋白的编码基因插入细菌表达载体 中，得到表达所述待筛选蛋白的重组载体，将所述表达待筛选蛋白的重组载体转入宿主细 菌，得到重组细菌，培养所述重组细菌并诱导所述重组载体的表达，再提取重组细菌的原生 质体，得到所述表面展示有待筛选蛋白的细菌原生质体。所述的细菌中还可以转入用于通过荧光信号筛选原生质体的荧光蛋白表达载体， 该载体可以是在细菌中表达任何颜色荧光蛋白质的载体，优选为PBAD30-KmR-GFPmut2。所述的细菌可以是各种大肠杆菌如DH10B，Topl0，JM109，BL21等，优选为大肠杆 菌 Jude-I ο上述任一所述筛选方法中，所述步骤4)中，所述从结合物中分离得到目的蛋白或 目的蛋白的编码基因的方法包括如下步骤从所述结合物中提取所述表达目的蛋白的重组 载体，将重组载体进行测序，得到所述目的蛋白的编码基因。实际应用中，所述目标蛋白可为抗原，所述待鉴定蛋白可为抗体；所述抗体具体可 为特异识别人源细胞表面抗原的抗体。本发明的另一个目的是提供一种用于筛选与目标蛋白结合的目的蛋白的试剂盒。本发明所提供的用于筛选与目标蛋白结合的目的蛋白的试剂盒，由真核细胞、真 核细胞表达载体、用于制备原生质体的细菌、原生质体展示载体、在原生质体中表达荧光蛋 白以便于筛选的载体组成。上述试剂盒中，所述离体人源细胞为人非小细胞肺癌细胞株H1299 ；所述真核细 胞表达载体为pUHD10-3-display(SEQ ID 6)；所述细菌为大肠杆菌菌株Jude-I ；所述表达 荧光蛋白的载体为pBAD30-KmR-GFPmut2。细菌原生质体展示方法在筛选与目标蛋白结合的目的蛋白中的应用也属于本发 明的保护范围。本发明提供了利用APEx展示技术应用于以完整的人细胞为抗原筛选特异识别人 细胞表面抗原的抗体的一种筛选方法。APEx细菌展示系统拥有与噬菌体展示系统相当大小 的抗体库(彡IO9)，并且具有展示完整的IgG抗体的能力。此外APEx细菌展示系统可以直 接利用广泛使用的噬菌体表达载体进行蛋白展示，因此可以直接利用现有的噬菌体单链抗 体文库进行筛选。此方法的建立，有助于筛选更多识别细胞表面分子标记的抗体，对疾病诊
8断和治疗都将起到巨大的推动作用。
图1为荧光显微镜观察和流式细胞仪分析H1299_tet on-PAD4细胞表面PAD4的表达。图2为荧光显微镜观察细菌原生质体与贴壁细胞的结合。图3为H1299_tet on-PAD4细胞与展示抗体M18的细菌原生质体的特异结合。图4为pH值对展示抗体M18的细菌原生质体与H1299_tet on_PAD4细胞结合的影响。图5为展示M18抗体的细菌原生质体在不同初始纯度时被平板淘选和流式分选的
富集效率。图6为多轮富集展示M18抗体的细菌原生质体。
具体实施例方式本发明用已有的抗原-抗体对作为模型，证明展示了特定抗体的细菌原生质体， 能够通过与人细胞表面展示的抗原相互作用从而结合到细胞表面。选用了炭疽杆菌保护 抗原的一个片断PA domaiM作为抗原，而对应的单链抗体为M18 ScFv0而抗地高辛标签 (DIG)的单链抗体26-10 scFv作为阴性对照。将诱导后的H1299-tet on-PAD4细胞从平板 上酶解下来，然后分别和展示抗PAD4的单链抗体或抗DIG标签的单链抗体并带有GFPmut2 荧光的细菌原生质体孵育。孵育完后，去掉未结合的细菌原生质体。将细胞重悬后在流式 细胞仪上检测。由于细胞和细菌原生质体在大小上有明显差别，在流式细胞仪上可以通过 前向散射光FSC和测向散射光SSC信号明显的区分开。H1299细胞在流式细胞仪上呈现比 细菌原生质体更大的FSC和SSC信号，可以准确的选取细胞群，分析细胞因为结合了有荧光 的细菌原生质体而获得的GFP荧光。荧光的强弱就能反映出细菌原生质体结合的强弱。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、筛选抗体的方法一、将抗原PAD4展示于离体的动物细胞表面人非小细胞肺癌细胞株H1299细胞购自中国医学科学院肿瘤细胞库，产品目录号 为 0092。pUHDlO-3载体在文献(Gossen M, Bujard H :Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA 1992,89(12) :5547_5551.)中公开过。(Domain 4 of the Anthrax Protective Antigen gene)白勺IS 码基因序列如SEQ ID N0:5所示。人细胞mRNA翻译常用的密码子与细菌有所差异，人源化 该DNA的目的是为了人细胞的翻译机器能高效地翻译该基因转录出来的mRNA。pDisplay(购自Invitrogen)是哺乳动物细胞表达载体，专门用于将重组蛋白定 位于哺乳动物细胞膜表面。通过将感兴趣的基因克隆到载体框架(包括N端Ig k分泌信 号，C 端血小板来源的生长因子受体(PDGFR) (Gronwald RG, Grant FJ, Haldeman ΒΑ, HartCE, Of Hara PJ, Hagen FS,Ross R,Bowen-Pope DF, Murray MJ :Cloning and expression of a cDNA coding for the human platelet-derived growth factor receptor :evidence for more than one receptor class. Proc Natl Acad Sci USA 1988,85(10) :3435_3439.) 的跨膜锚定域中，而使表达的蛋白质定向锚定于细胞表面。PAD4通过C端与血小板来源的 生长因子受体(PDGFR)的跨膜锚定域融合在N端分泌信号的引导下从而能够展示到H1299 细胞膜表面。以 pDisplay 为模板，用引物对(上游引物 ACGCGAATTCGCCACCATGGAGACAGACACACTC CTGCT，下游弓丨物 AACTAGTCTAGACTAACGTGGCTTCTTCTGCCAAAGCAT)进行 PCR 扩增，扩增产物中 包括载体上的Ig k链前导序列(分泌信号)、HA标签、多克隆位点区、c-myc标签及PDGFR 跨膜区。将PCR扩增产物插入pUHD10-3载体中四环素调控的启动子下游的EcoR I和Xba I之间，得到构建正确的重组质粒，记作pUHD10-3-display载体。该pUHDlO-3-display载 体中通过四环素来调节外源蛋白(PAD4)在细胞表面的表达。用overlap PCR的方法合成人源化的PAD4 DNA序列，具体如下组装PAD4的弓I物序列1 TCAGagatctCGGTTCCACTATGATCGGAACAACATCGCAGTCG 342 TGAGCTTCCTTCACGACGCTTTCGTCTGCGCCGACTGCGATGTTGTTCCG 503 GCGTCGTGAAGGAAGCTCACCGGGAAGTGATCAACAGCAGCACTGAAGGA 504 CGAATATCCTTATCGATGTTCAGGAGGAGTCCTTCAGTGCTGCTGTTGAT 505 CCTCCTGAACATCGATAAGGATATTCGGAAGATTCTGAGCGGCTACATCG 506 TTTGAGTCCCTCAGTATCTTCGATCTCCACGATGTAGCCGCTCAGAATCT 507 AGATCGAAGATACTGAGGGACTCAAAGAGGTCATCAACGATCGGTACGAT 508 CCTGTTGCAGGCTGCTGATATTGAGCATATCGTACCGATCGTTGATGACC 509 ATATCAGCAGCCTGCAACAGGACGGCAAAACTTTCATCGACTTCAAGAAA 5010 CAGAGGGAGCTTGTCGTTGTATTTCTTGAAGTCGATGAAAGTTTTGCC 4811 TACAACGACAAGCTCCCTCTGTACATTAGCAATCCCAACTACAAGGTGAA 5012 GTTCTCCTTTGTGACGGCATAGACGTTCACCTTGTAGTTGGGATTGCTAA 5013 TCTATGCCGTCACAAAGGAGAACACCATCATTAACCCAAGCGAGAACGGG 5014 GAGGATCCGTTTGATCCCATTTGTGGAAGTGTCCCCGTTCTCGCTTGGGT 5015 ACAAATGGGATCAAACGGATCCTCATCTTTTCCAAAAAGGGGTACGAGAT 5016 GTACgtcgacCCCAATCTCGTACCCCTTTTTGGAAAAGA 291.将各条引物重悬为100M。2.制备10X的引物混合物将每条引物各取11混合在一起，然后加Milli-Q水至 终体积200 μ 1。3.制备50 μ 1的PCR反应体系a. 8 μ 1 10Χ的引物混合物+5 μ 1 10Χ PCR缓冲液b. 1 μ 1 dNTP 底物(2. 5mM each)c. 1 μ 1 pyrobest Γ±|8| (Takara)d. 35 μ 1 Milli-Q 水4· PCR反应条件
a. 95 °C 2minb. 95°C 20secc. 52 °C Imind. 72 °C 2mine.重复步骤b_d29次f. 72 °C IOmin5.取1 μ 1 PCR产物(不需要纯化)作为模板用于第二次PCRa. 1 μ 1 of PCR 产物b. 5 μ 1 IOX PCR 缓冲液c. 1 μ 1 dNTP 底物(2. 5mM each)d. 0· 5μ 1 1 号引物(ΙΟΟμΜ)e. 0. 5μ 1 16 号引物(ΙΟΟμΜ)f. 1 μ 1 pyrobest 扩增酶(Takara)g. 41 μ 1 Milli-Q 水h.重复步骤6的PCR反应用Bgl II-Sal I酶切将扩增产物并亚克隆到pUHDlO-3-display载体中，重组质 粒进行测序验证，结果在pUHDlO-3-display的Bgl II和Sal I酶切位点间插入了 SEQ ID NO 5所示DNA，表明构建的重组质粒正确，记作pUHD10-3-display-PAD4。完全培养基含10%小牛血清(Hyclone)和100U/ml双抗(青链霉素，Sigma)的 DMEM培养基(Invitrogen)，用于培养HI2"细胞。在转染24小时前接种H1299细胞使其在转染时达到60% _80%满度，去除完全培 养基，用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)将pTet-on (编码rtTA转录因子，可于四环素 响应启动子配对对基因进行Tet on调控)(Clontech)和目的质粒pUHD10-3-display-PAD4 在无血清培养基中混合并加入细胞培养盘中，孵育4-6小时后，换成完全培养基继续 培养，转染24小时后，将细胞按1 5的比例接种于新的培养皿中，并加入450yg/ml G418 (Amersco)筛选抗性细胞。筛选两周后，将G418抗性细胞按5 X IO5细胞/IOcm平皿的 密度接种，并加入2μ g/ml d0XyCyCline(D0X，一种四环素的衍生物，具有更强的诱导效果 和稳定性)(Sigma)诱导PAD4表达。诱导48小时后，收集细胞。细胞鉴定用1 400稀释的抗c-myc标签的单抗(9E10，Calbiochem)4度标 记细胞表面的PAD4-c-myc蛋白。孵育30min后，再用1 300稀释的兔抗鼠的FITC标 记的二抗(Jackson ImmunoResearch) 4度孵育30min。被标记的细胞重悬于DMEM培养基 (Invitrogen,CA)中。样品在BD FACS Aria II (Becton Dickinson)上进行无菌分选，将约 5%具有最强FITC荧光的细胞分选出来。经过三轮分�。竦昧� 63%的细胞表面展示PAD4 的细胞，记作H1299-tet on PAD4细胞。Dox诱导前后的H1299_tet on-PAD4细胞如图1所示。图1中，(A)荧光显微镜观 察PAD4在H1299细胞表面的表达。抗c_myc标签抗体标记H1299_tet on_PAD4细胞在有 无Dox时表面PAD4的表达水平。(B)流式细胞仪检测H1299-tet on_PAD4细胞在有无Dox 时表面PAD4的表达水平。表明，在细胞维持的过程中，由于没有Dox，细胞不会表达PAD4抗 原，有利于细胞的扩增。只有当在培养基中加入Dox时，H1299细胞才能在短时间内在细胞表面表达PAD4抗原。二、将待筛选抗体展示于细菌原生质体表面细菌表达载体 pBAD30-KmR-GFPmut2、pAK200-26_10 (anti-Digoxigenin scFv) 禾口 pAK200-M18 在文献(Jung ST, Jeong KJ, Iverson BL, Georgiou G=Binding and enrichment of Escherichia coli spheroplasts expressing inner membrane tethered scFv antibodies on surface immobilized antigens. Biotechnol Bioeng 2007,98(1) 39-47.)中公开过。pAK200-M18中含有PAD4的抗体(即M18)的编码基因，该基因序列如SEQ ID NO 1所示。M18抗体的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。pAK200-26-10中含有阴性对照抗体26_10 (抗地高辛标签(DIG)的抗体)的编码 基因，该基因序列如SEQ ID N0:3所示。对照抗体26-10的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所
7J\ οpBAD30-KmR载体是一个araBAD启动子严格调控蛋白表达的载体。向细菌中导入pBAD30-KmR-GFPmut2的目的是使细菌原生质体发荧光，便于筛选。pAK200载体是一种噬菌体展示的载体，它将外源蛋白的C端与M13噬菌体的gp3 蛋白形成融合蛋白，通过gp3锚定在细菌内膜外侧从而将外源蛋白展示在细菌周质空间。 将细菌外壁去除后将能将目的蛋白展示在细菌表面。E. coli Jude-I 在文献(F，[TnlO (Tetr) proAB+lacIq Δ (lacZ)M15]mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80(11βοΖΔΜ15 Δ lacX74 deoR recAl araD139A (ara leu) 7697 galU galK rpsL endAl nupG)(Jung ST,Jeong KJ,Iverson BL,Georgiou G :Binding and enrichment of Escherichia coli spheroplasts expressing inner membrane tethered scFv antibodies on surface immobilized antigens. Biotechnol Bioeng 2007,98(1) 39-47.)中公开过。E coli Jude-I电化学感受态细胞的制备A.挑取单克隆接种于5ml SOB培养基中37度，250rpm培养16小时；B.将5ml过夜培养液接种于500ml SOB培养基中，37度，250rpm培养至0D600到 1. O ；C.将培养液置于冰上30分钟，然后4，500g 4度离心15分钟收集细菌；D.弃上清，用500ml冰上预冷的无菌超纯水重悬菌体E. 4，500g 4度离心15分钟，弃上清，用250ml冰上预冷的无菌超纯水重悬菌体F. 4，500g 4度离心15分钟，弃上清，用50ml冰上预冷的无菌超纯水重悬菌体G. 4，500g 4度离心15分钟，弃上清，用1. 5ml冰上预冷的10% (ν/ν)甘油的无菌 超纯水溶液重悬菌体，50 μ 1/管分装感受态细胞，马上置于-70度超低温冰箱保存。电转化E coli Jude-I电化学感受态细胞A.将0. Icm的电击杯置于冰上预冷，同时从_70度超低温冰箱取出一管E coli Jude-I电化学感受态细胞，置于冰上融化。B.将质粒溶液(1-2 μ 1)加入已溶化的E coli Jude-I电化学感受态细胞中，迅速 并温和混勻。C.马上将感受态-质粒混合物转移到0. Icm的电击杯中，将电击杯置于Gene
12Pulser II (Bio-Rad)电穿孔仪上，以1. 8kv，25 μ F，200 Ω的电击条件进行电击。电击常 数可控制到4-5毫秒。D.迅速加入Iml SOC培养基(常温)重悬电击后的细菌，并转移到一个15ml离心 管中，置于37度摇床，220rpm培养1个小时。E.将复苏后的菌液以300 μ l/10cm平皿涂布于含有氯霉素和卡那霉素的LB固体 选择培养基上筛选转化子。按照如上方法将pBAD30-KmR-GFPmut2和pAK200-26-10共同转入E.coli Jude-I， 得到含有 pBAD30-KmR-GFPmut2 和 pAK200-26_10 的 E. coli Jude-I。按照如上方法将pBAD30-KmR-GFPmut2和pAK200-M18共同转入E.coli Jude-I，得 到含有 pBAD30-KmR-GFPmut2 和 pAK200_M18 的 E. coli Jude-I。将含有pBAD30-KmR-GFPmut2 和 pAK200-26_10 的 E.coli Jude-I 或含有 pBAD30-KmR-GFPmut2 和 pAK200_M18 的 E. coli Jude-I 在添加了 20mg/ml 葡萄糖，40 μ g/ ml氯霉素(Sigma)和50 μ g/ml卡那霉素(Sigma)的TB (Terrific Broth)培养基中培养 37度过夜。将过夜培养液按1 100的比例接种到新鲜的TB培养基中(不含葡萄糖)，37 度培养至 OD6tltl 等于 0. 5。然后加入 ImM IPTG(Sigma)和 2mg/ml L-arabinose (Sigma)至于 16度诱导抗体和绿色荧光蛋白的表达。制备细菌原生质体诱导18小时后，离心收集菌体(菌体浓度为Iml菌体的 OD6tltl 值为 4. 5)，用 Iml IOmM Tris-HCl(pH 8. 0)洗两次，再重悬于 Iml STE 溶液中(0. 5M Sucrose, IOmM Tris-HCl, IOmM EDTA，pH 8· 0)，置于 37 度孵育 30min。12，000g 离心收集细 菌，然后用溶液 A (0. 5M Sucrose, 20mM MgCl2, IOmM M0PS，pH 6.8)洗一次，再重悬于 Iml 含 有lmg/ml溶菌酶的溶液A中，37度孵育15min。最后12，OOOg离心收集细菌原生质体，并 重悬于含有BSA和脱脂奶粉、pH6. 5的optimal-MEM培养基中，至细菌原生质体的 浓度为Iml悬液的0D_值为10，获得细菌原生质体悬液。三、抗体筛选方法的摸索Doxycycline 购自 Sigma，产品目录号为 D9891。optimal-MEM 培养基购自 Invitrogen，产品目录号为31985。(一 )验证平板淘选法(panning)能否用于抗体筛选实验组方法(A)将H1299-tet on_PAD4细胞按5X IO5细胞/IOcm平皿接种，并加 入2μβ/πι1 doxycycline诱导PAD4表达。诱导60小时后，平皿用PBS洗一遍，然后加入含 有BSA和脱脂奶粉的optimal-MEM pH6. 5培养基常温封闭20min。将IOml细菌原 生质体悬液(10ml细菌原生质体悬液的OD6tltl值为80)加入到每个平皿中，放置于37度、pH 值6. 5、水平摇床中以50转/分钟孵育1小时。孵育结束，用PBS洗三次，去除未结合的细 菌原生质体。实验中单独加展示M18的细菌原生质体或展示26-10的细菌原生质体。由于细菌原生质体带有GFP荧光，直接在荧光显微镜下观察细菌原生质体与细胞 的结合。结果如图2所示。图2A为展示M18的细菌原生质体与H1299-tet on-PAD4孵育； 图2B为展示26-10细菌原生质体与H1299-tet on_PAD4孵育；图2C为展示M18细菌原生 质体与H1299细胞孵育；图2D为展示26-10细菌原生质体与H1299细胞孵育。图2A显示 为特异结合实验，而图2B、C和D为对照实验。实验设3次重复，结果一致。结果表明，只有 展示了抗PAD4的单链抗体的细菌原生质体能结合到H1299-tet on_PAD4细胞的表面，而展示抗DIG标签的细菌原生质体不能与H1299-tet0n-PAD4细胞结合。两种细菌原生质体细 胞均不能和普通的H1299细胞结合。证实M18-细菌原生质体能结合到贴壁的H1299-PAD4 细胞表面。且对照抗体的非特异结合水平非常低。证明平板淘选法可以用于筛选抗体。(二)验证流式分选能否用于抗体筛选收集诱导过的H1299-tet on_PAD4细胞，重悬于含有IOmM EDTA和1 % BSA optimal-MEM pH6. 5 培养基中。将 IO6 H1299_tet on_PAD4 细胞与 Iml 0D_ 值为 2 的展示 M18的细菌原生质体或展示26-10的细菌原生质体悬液(Iml悬液的OD6tltl值为2)混合，置 于静音混和器上于37度、pH6. 5的条件下孵育1小时。孵育完后，300g离心2分钟以除去 未结合的细菌原生质体。样品重悬于DMEM培养基中，用流式细胞仪BD FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson)进行分析。图3A为细菌原生质体和H1299细胞通过抗体M18 和抗原PAD4结合在一起的示意图。H1299-tet on-PAD4细胞明显比细菌原生质体大，在流 式细胞仪上表现出更强的前向散射光和侧向散射光信号，通过散射光信号可以将细胞和残 留的细菌原生质体区分开来(图3B)。图3B中Rl区域为H1299-tet on_PAD4细胞及目的复 合物。将该Rl区域内的细胞和细胞_细菌原生质体可以图示为图3C。H1299-tet on-PAD4 细胞结合展示M18细菌原生质体，而不结合用于阴性对照的展示26-10细菌原生质体。两 种细菌原生质体均表达绿色荧光蛋白GFPmut2，因此被488nm激光激发后发绿色荧光。由 图3C可见，因展示M18细菌原生质体能特异结合H1299-tet on-PAD4细胞可检测到明显 的530/30nm波长的荧光信号；而展示26-10细菌原生质体几乎不结合H1299_tet on-PAD4 细胞，只能检测到非常低水平的背景荧光。样品可用流式分选仪FACSAria II (Becton Dickinson，也可用别的流式分选仪)根据荧光信号分选H1299_tet on-PAD4细胞与展 示M18抗体的细菌原生质体的复合物。图3C中S区域为分选区。结果筛选到H1299-tet on-PAD4细胞与展示M18抗体的细菌原生质体的复合物，表明流式分选法也可用于抗体筛 选。(三)孵育条件的优化将诱导过的H1299-tet on_PAD4细胞收集并重悬于含有IOmM EDTA和1 % BSA、pH 不同的optimal-MEM培养基中。将IO6细胞与Iml展示M18细菌原生质体悬液(Iml悬液的 0D_值为2)混合，置于静音混和器上于37度、pH不同的条件下孵育1小时。pH值分别为 5. 0,5. 3,5. 5,5. 8,6. 0,6. 3,6. 5,6. 8,7. 0，7. 3 或 7. 5。孵育完成的样品在流式分选仪FACSAria II (Becton Dickinson)上检测细菌原生
质体结合信号。同时以展示26-10抗体的细菌原生质体作为对照。实验设3次重复，结果取平均数。图4为展示抗PAD4抗体M18细菌原生质体或阴 性对照展示26-10抗体细菌原生质体在不同的pH值条件下与悬浮的H1299-tet on-PAD4 细胞结合数目。在pH为5. 5到7. 0之间，展示M18的细菌原生质体与H1299_tet on_PAD4 细胞的结合数(在流式中以GFP荧光强度表示)明显高于此pH值范围之外展示M18的细 菌原生质体与H1299-tet on-PAD4细胞的结合数。而在pH为5. 5到7. 0之间和之外，展示 阴性对照抗体26-10的细菌原生质体与H1299-tet on-PAD4细胞的结合数都处于低水平状 态。例如展示特异抗体M18的细菌原生质体与H1299-tet on_PAD4细胞孵育后，当pH值为 5. 0时，结合信号(荧光强度)为662 ；当pH值为5. 5时，结合信号为1136 ；当pH值为6. 0时，结合信号为2857 ；当pH值为6. 5时，结合信号为2711 ；当pH值为7. 0时，结合信号为 839 ；当pH值为7. 5时，结合信号为439。以上实验说明pH在5. 5到7. 0之间有利于对展 示特异抗体M18的细菌原生质体的富集。当pH值处于生理条件pH7. 5时，特异结合信号非常低。而pH值降到弱酸性时，结 合信号有明显提高。这很可能是因为在生理条件下哺乳动物细胞和细菌表面都带有负电 荷，降低PH可以中和部分负电荷，降低两者之间的静电排斥，从而有利于抗原-抗体的结 合。但PH值过低，结合信号也会开始下降。这可能是由于PAD4蛋白解折叠造成抗原表位 变化的原因。综合考虑结合信号及蛋白结构稳定性的双重因素，选定在PH6. 5作为最优条 件。四、抗体筛选( 一 )平板淘选法(panning)将展示26-10抗体的细菌原生质体的悬浮液与展示M18的细菌原生质体的悬浮液 混合，得到混合悬浮液，使混合悬浮液中展示M18的细菌原生质体与展示26-10抗体的细菌 原生质体的数目比为1 1000或5 100，然后将混合悬浮液分别用平板淘选法进行筛选 抗体。将H1299_tet on_PAD4细胞按5 X IO5细胞/IOcm平皿接种，在完全培养基中加入 2 μ g/ml doxycycline，诱导PAD4表达。诱导60小时后，平皿用PBS洗一遍，然后加入含有 1% BSA和脱脂奶粉的optimal-MEM pH6. 5培养基常温封闭20min。将IOml混合悬浮 液(IOml混合悬浮液的OD6tltl值为80)加入到每个平皿中，放置于37度、pH值6. 5、水平摇 床中以50转/分钟孵育1小时。孵育结束，用PBS洗三次，去除未结合的细菌原生质体，保 留剩余产物。获得抗体序列将剩余产物用胰酶酶解，从中回收表达抗体的质粒，将回收的表达 抗体的质粒电转于E. coli Jude-I电化学感受态细胞，将转化的细菌涂布于含有氯霉素的 LB固体选择培养基上筛选转化子。从阳性转化子中提取质粒，进行测序，得到目的抗体的编 码基因序列，序列如SEQ ID NO :1所示，基因序列正确，说明本发明方法能够筛选得到正确 的抗体。再通过基因工程表达和纯化得到目的抗体。统计富集效率将剩余产物用胰酶酶解，从中回收表达抗体的质粒，将回收的表达 抗体的质粒电转于E. coli Jude-I电化学感受态细胞，将转化的细菌涂布于含有氯霉素的 LB固体选择培养基上筛选转化子。随机挑取48个转化子，采用菌落PCR鉴定富集后的M18 纯度，再统计富集效率。富集效率的计算公式富集后的M18纯度/富集前的M18纯度。鉴定引物序列(M18特异引物)如下5’ -ATATGCTAGCGATATTCAGATGACACAGACT-3’ ；5 ’ -GCGTTTGCCATCTTTTCATAATCAAAATCACC-3’。实验设3次重复，结果取平均数。结果如图5所示。当用于实验的混合悬浮液中展示M18细菌原生质体的纯度为 0. 1 %时，富集后的M18纯度为6. 4%，淘选表现出好的富集效率，为64倍。当用于实验的混 合悬浮液中展示M18细菌原生质体的纯度为5%时，富集后的M18纯度为25%，淘选的富集 效率为5倍。当孵育温度为37度、孵育时间为0. 5h时，结果与图5所示结果无显著差异。
当孵育温度为37度、孵育时间为2h时，结果与图5所示结果无显著差异。当孵育温度为30度、孵育时间为0. 5h时，结果与图5所示结果无显著差异。当孵育温度为30度、孵育时间为2h时，结果与图5所示结果无显著差异。(二)流式分选法将展示26-10抗体的细菌原生质体的悬浮液与展示M18的细菌原生质体的悬浮液 混合，得到混合悬浮液，使混合悬浮液中展示M18的细菌原生质体与展示26-10抗体的细菌 原生质体的数目比为1 1000或5 100，然后将混合悬浮液分别用流式分选法进行筛选 抗体。将H1299-tet on_PAD4细胞按5 X IO5细胞/IOcm平皿接种，在完全培养基中加入 2 μ g/ml doxycycline，诱导PAD4表达。诱导60小时后，平皿用PBS洗一遍，酶解收集诱导 过的 H1299-tet on_PAD4 细胞，并重悬于含有 IOmM EDTA 和 1 % BSA、pH6. 5 的 optimal-MEM 培养基中。将IO6Cells与Iml混合悬浮液(Iml混合悬浮液的OD6tltl值为2)混合于1. 5ml 离心管中，置于静音混和器上于37度、pH6. 5的条件下孵育1小时。去除孵育体系中未结合的细菌原生质体将孵育产物(将容器内的所有物质记作 孵育产物)置于离心管中，300g离心2分钟，吸去上层液体，再以相同方式离心2次。分离复合物去除孵育体系中未结合的细菌原生质体后，用流式细胞仪进行分 选。用FACSAria II (Becton Dickinson)通过绿色荧光蛋白进行分�。占⒙躺獾� H1299-tet on_PAD4细胞与细菌原生质体的复合物。获得抗体序列将分选出的复合物用EasyPure Plasmid MiniPre Kit(Transgen) 按照试剂盒的操作步骤提取表达抗体的质粒，将提取的质粒电转于E. coli Jude-I电化学 感受态细胞，将转化的细菌涂布于含有氯霉素的LB固体选择培养基上筛选转化子。从阳性 转化子中提取质粒，进行测序，结果得到SEQ ID NO :1所示的目的抗体的编码基因序列，说 明本发明方法能够筛选得到正确的抗体。再通过基因工程表达和纯化得到目的抗体。统计富集效率将分选出的复合物用EasyPure Plasmid MiniPre Kit(Transgen) 按照试剂盒的操作步骤提取表达抗体的质粒，将提取的质粒电转于E. coli Jude-I电化学 感受态细胞，将转化的细菌涂布于含有氯霉素的LB固体选择培养基上筛选转化子。随机挑 取48个转化子，采用菌落PCR鉴定富集后的M18纯度，再统计富集效率。富集效率的计算 公式富集后的M18纯度/富集前的M18纯度。鉴定引物序列(M18特异引物)如下5’ -ATATGCTAGCGATATTCAGATGACACAGACT-3’ ；5 ’ -GCGTTTGCCATCTTTTCATAATCAAAATCACC-3’。实验设3次重复，结果取平均数。结果如图5所示。当用于实验的混合悬浮液中展示M18细菌原生质体的纯度为 0. 时，富集后的M18纯度为2%，流式分选的富集效率为20倍。当用于实验的混合悬浮 液中展示M18细菌原生质体的纯度为5%时，富集后的M18纯度为65.6%，流式分选的富集 效率为13倍。当孵育温度为37度、孵育时间为0. 5h时，结果与图5所示结果无显著差异。当孵育温度为37度、孵育时间为2h时，结果与图5所示结果无显著差异。当孵育温度为30度、孵育时间为0. 5h时，结果与图5所示结果无显著差异。
当孵育温度为30度、孵育时间为2h时，结果与图5所示结果无显著差异。综合实验(一)和(二)，结果表明，当用于实验的混合悬浮液中展示M18细菌原 生质体数目占所有原生质体数目的0. 1 %时，淘选表现出更好的富集效率，为64倍。当用于 实验的混合悬浮液中展示M18细菌原生质体数目占所有原生质体数目的5%时，流式分选 拥有比淘选更优异的富集效率，流式分选的富集效率为13倍，淘选的富集效率为5倍。淘选比流式分选更容易操作，不需要进行复杂的流式分选，并且能够回收更多的 编码抗体基因的质粒，不需要分选后PCR回首抗体基因，可以直接电转化细菌回收扩增质 粒。当特异抗体比例达到一定值时，流式更容易通过亲和力的强弱将高亲和力的抗体迅速 的筛选富集出来。(三)淘选法和流式分选法结合将展示26-10抗体的细菌原生质体的悬浮液与展示M18的细菌原生质体的悬浮液 混合，得到混合悬浮液，使混合悬浮液中展示M18的细菌原生质体与展示26-10抗体的细菌 原生质体的数目比为1 1000或1 104，然后将混合悬浮液分别进行如下筛选。(1) 一轮淘选和一轮流式分选步骤1 按照实验(一)中所述方法进行淘选筛�。由秆〔镏谢厥毡泶锟固宓� 质粒，将回收的表达抗体的质粒电转于E. coli Jude-I电化学感受态细胞，将转化的细菌涂 布于含有氯霉素的LB固体选择培养基上筛选转化子。统计富集效率。步骤2 将步骤1得到的阳性转化子制成细菌原生质体，再按照实验(二)中所述 方法进行流式分选。将分选得到的复合物按照实验(二)中所述方法进行富集效率统计。(2) 二轮淘选和一轮流式分选步骤1 按照实验(一)中所述方法进行淘选筛�。由秆〔镏谢厥毡泶锟固宓� 质粒，将回收的表达抗体的质粒电转于E. coli Jude-I电化学感受态细胞，将转化的细菌涂 布于含有氯霉素的LB固体选择培养基上筛选转化子。统计富集效率。步骤2:将步骤1得到的阳性转化子制成细菌原生质体，按照实验(一)中所述 方法进行淘选筛�。由秆〔镏谢厥毡泶锟固宓闹柿＃厥盏谋泶锟固宓闹柿５缱� E. coli Jude-I电化学感受态细胞，将转化的细菌涂布于含有氯霉素的LB固体选择培养基 上筛选转化子。统计富集效率。步骤3 将步骤2得到的阳性转化子制成细菌原生质体，再按照实验(二)中所述 方法进行流式分选。将分选得到的复合物按照实验(二)中所述方法进行富集效率统计。实验设3次重复，结果如图6所示。结果表明，当样品中展示M18的细菌原生质体的纯度为0. 时，通过一轮淘选筛 �。琈18抗体的纯度为5. 1 %，富集效率为51倍；然后通过一轮流式分�。琈18抗体的纯度 能达到65. 6% ；—轮淘选加上一轮流式分�。芄哺患� 656倍，达到了明显的富集效果。 当样品中展示M18细菌原生质体的纯度为0.01%时，两轮淘选筛选后，M18抗体的纯度为 6. 25%，富集效率为625倍；富集产物接着再进行一轮流式分�。蚋患镏蠱18纯度为 72.9%，通过两轮淘选和一轮流式分�。芄不竦昧� > 7200倍的富集效果。此结果充分的 说明了本发明方法能够有效地筛选特异识别人细胞表面抗原的抗体。本发明采用了两步法的策略来富集细菌原生质体，它结合了淘选和流式分选的优 点，同时又弥补了相互的缺点，可大大提高筛选效率。当特异抗体浓度 1000时，采用
17淘选来富集以增加特异抗体的比例。然后利用流式的定量分选能力，将具有更高亲和力的 抗体富集出来。
权利要求
一种筛选与目标蛋白结合的目的蛋白的方法，包括如下步骤1)将目标蛋白展示于离体真核细胞的细胞膜表面，得到表面展示有目标蛋白的真核细胞；2)将待筛选蛋白库中的各蛋白分别展示于细菌原生质体表面，得到表面展示有待筛选蛋白的细菌原生质体库；3)将步骤1)得到的真核细胞与步骤2)得到的细菌原生质体库共同孵育，使展示于所述真核细胞表面的目标蛋白和展示于所述细菌原生质体表面的蛋白之间发生特异性的相互配对，得到所述真核细胞与所述细菌原生质体的特异性结合物，将所述结合物从孵育体系中分离出来；4)从步骤3)得到的结合物中分离得到与展示于真核细胞表面的目标蛋白特异性结合的目的蛋白或目的蛋白的编码基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述孵育的条件包括所 述孵育体系的PH值为5. 0-7. 5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述孵育的条件包括所 述孵育体系的 PH 值为 5. 0,5. 3,5. 5,5. 8,6. 0,6. 3,6. 5,6. 8,7. 0，7. 3 或 7. 5。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述孵育的条件是 温度为30-37°C和时间为0. 5-2小时；所述温度具体为30°C或37°C，所述时间具体为0. 5小 时或1小时或2小时。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于，步骤3)中，将所述结合物从孵育 体系中分离出来的步骤是，首先使用平板淘选法筛�。缓笫褂昧魇椒盅》ǚ盅 �
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，使用流式分选法的步骤为首先从所述孵 育体系中去除未同所述真核细胞形成特异性结合物的细菌原生质体，再通过流式细胞仪筛 �。占稣婧讼赴朐侍宸⑸匾煨越岷系慕岷衔�。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于从所述孵育体系中去除未同所述真核细 胞形成特异性结合物的细菌原生质体的步骤为将所述的孵育体系常温300g离心1. 5-3分 钟后，收集沉淀，弃去上清。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述将目标蛋白展示于真核细胞的细胞膜表面是由包括如下步骤的方法 制备得到的将含有所述目标蛋白编码基因的重组表达载体转入所述真核细胞中，得到重 组真核细胞，培养该重组真核细胞并诱导所述重组载体的表达，得到所述表面展示有目标 蛋白的真核细胞；步骤2)中，将待筛选蛋白库中的各蛋白分别展示于细菌原生质体表面的方法包括如 下步骤将待筛选蛋白的编码基因插入细菌表达载体中，得到表达所述待筛选蛋白的重组 载体，将所述表达待筛选蛋白的重组载体转入宿主细菌，得到重组细菌，培养所述重组细菌 并诱导所述重组载体的表达，再提取重组细菌的原生质体，得到所述表面展示有待筛选蛋 白的细菌原生质体。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于，所述含有所述目标蛋白的编码 基因的重组载体是受四环素调控的重组载体；所述培养该重组真核细胞并诱导所述重组载 体的表达的方法为将插入外源基因后的真核表达载体转入所述真核细胞，并用四环素诱导所述真核细胞表达目标蛋白。
10.根据权利要求1-9所述的方法，其特征在于，所述宿主细菌中还转入用于通过荧光 信号筛选原生质体的荧光蛋白表达载体。所述荧光蛋白表达载体可以是在细菌中表达任何 颜色荧光蛋白质的载体，优选为PBAD30-KmR-GFPmut2。
11.根据权利要求1-10中任一所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白的编码基因 是人源化的；所述真核细胞是人非小细胞肺癌细胞株H1299 ；所述真核表达载体为真核细 胞膜表面展示载体；所述真核细胞膜表面展示载体是核苷酸序列是SEQ ID 6所示的载体 pUHD10-3-display。
12.根据权利要求1-11中任一所述的方法，其特征在于，所述宿主细菌为大肠杆菌，优 选为 E.coli Jude-I0
13.根据权利要求1-12中任一所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，所述从结合物 中分离得到目的蛋白或目的蛋白的编码基因的方法包括如下步骤从所述结合物中提取所 述表达目的蛋白的重组载体，对重组载体进行测序，得到所述目的蛋白的编码基因。
14.一种辅助鉴定蛋白是否与目标蛋白结合的方法，包括如下步骤1)将目标蛋白展示于离体真核细胞的细胞膜表面，得到表面展示有目标蛋白的真核细胞；2)将待鉴定蛋白库中的各蛋白分别展示于细菌原生质体表面，得到表面展示有待鉴定 蛋白的细菌原生质体库；3)将步骤1)得到的真核细胞与步骤2)得到的细菌原生质体库共同孵育，使展示于所 述真核细胞表面的目标蛋白和展示于所述细菌原生质体表面的蛋白之间发生特异性的相 互配对，得到所述真核细胞与所述细菌原生质体的特异性结合物，检测孵育的体系中是否 含有所述特异性结合物，若含有所述特异性结合物，则所述待鉴定蛋白与所述目标蛋白结 合，若不含有所述特异性结合物，则所述待鉴定蛋白不与所述目标蛋白结合。
15.一种用于筛选与目标蛋白结合的目的蛋白的试剂盒，由真核细胞、真核细胞表达载 体、用于制备原生质体的细菌、原生质体展示载体、在原生质体中表达荧光蛋白以便于筛选 的载体组成。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述真核细胞为人非小细胞肺癌 细胞株H1299 ；所述真核细胞表达载体为pUHDlO-3-display ；所述细菌为大肠杆菌菌株 Jude-I ；所述表达荧光蛋白的载体为pBAD30-KmR-GFPmut2。
17.权利要求15-16所述试剂盒在筛选与目标蛋白结合的目的蛋白中的应用。
18.细菌原生质体展示方法在筛选与目标蛋白结合的目的蛋白中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种筛选抗体的方法。该方法包括如下步骤1)将目标蛋白展示于离体真核细胞的细胞膜表面，得到表面展示有目标蛋白的真核细胞；2)将待筛选蛋白库中的各蛋白分别展示于细菌原生质体表面，得到表面展示有待筛选蛋白的细菌原生质体库。本发明提供了利用APEx展示技术应用于以完整的人细胞为抗原筛选特异识别人细胞表面抗原的抗体的一种筛选方法。APEx细菌展示系统拥有与噬菌体展示系统相当大小的抗体库(≥109)，并且具有展示完整的IgG抗体的能力。此方法的建立，有助于筛选更多识别细胞表面分子标记的抗体，对疾病诊断和治疗都将起到巨大的推动作用。
文档编号G01N33/53GK101948534SQ20101025736
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者杭海英, 邱俊康 申请人:中国科学院生物物理研究所
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