专利名称：用于进行可培养细胞计数的方法、试剂盒和系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于定量测量样品中的细胞量的方法、试剂盒和系统。 现有技术以下是被认为与描述本发明所属领域中的技术状态有关的技术的清单。(1)国际专利申请公开案第W006/065350号(金佰利国际公司(Kimberly Clark Worldwide Inc.))(2)欧洲专利申请案第06U850号(日本密理博株式会社(Nihon Millipore Kogyo KK))(3)美国专利第5，258，285号(福斯电器控股公司(Foss Electric Holding AS))(4)美国专利申请公开案第2008014607号(5)国际专利申请公开案第W092/(^632号(新锐尔公司(Sierra Cytometry))(6)琼斯 D. L. (Jones, D. L. )，Μ. Α.布莱斯福德(Μ. A. BraiIsford)和 J. _L.多克 特(J.-LDrocourt). 1999.固相激光扫描细胞术用于计数制药用水中的微生物的新两 小时方法(Solid-phase, laser-scanning cytometry :a new two-hour method for the enumeration of microorganisms in pharmaceutical water). M Mi^lii, (Pharmacop. Forum)25 :7626-764背景技术：
样品、尤其是液体样品中生物实体的定量测量对于测定污染和感染的程度、疾病 状态等极为重要。例如，在微生物学中是利用菌落形成单位(CFU/ml)来度量细菌或真菌数量。尽管微生物包括孢子、无活性(不可培养)微生物和可繁殖微生物等形式，但仅定 量可繁殖微生物的方式具有重要意义。例如，在食品和饮料工业的质量控制过程、与消费者 接触的物品(例如医药品和个人护理品)的制造、水生系统(例如河流湖泊和海洋)的环 境保护、公共安全性(例如，城市供水系统；水井；例如水池温泉和海滩等娱乐用水的细菌 监测)各种工业生产过程、保健相关性感染和医疗护理规定中，可繁殖微生物的定量是一 个重要问题。分裂的(可培养)微生物的定量通常是基于细菌培养物生长的专业的实验室程 序。需要在较长的培育时间内维持使微生物在固体和液体培养基上生长的特定条件，并在 培育结束时，测定CFU (CFU/ml)。在实验室中，CFU通常是根据稀释次数和样品体积使计数 的菌落的总数量标准化来计算。这种方法需要实验室设备、有资质的工作人员以及可能持 续一天到一个月的较长的时间。尽管此方法涉及耗人力且耗时的工作，但CFU仍是目前管 理机构认可的进行微生物计数的标准。此项技术中提供了多种方法来检测测试样品中的微生物，作为细胞计数的替代方 法，这些方法中利用了颜色或荧光标记。例如，国际专利申请公开案第W006/065350号(金佰利国际公司(Kimberly ClarkWorldwide Inc.))描述了一种半定量或定量检测所提供的样品中微生物的存在的方法。 此方法利用了一种测试染料，其在一种或一种以上微生物存在下会出现可检测的颜色改 变。例如，所述测试染料是一种会对微生物组分(例如细胞膜、细胞质等)与细胞外部的环 境之间的极性差异起反应的溶剂化变色染料(solvatochromic dye)(例如雷查特氏染料 (Reichardt‘ s dye))。欧洲专利第EP0612850号描述了一种测定样品溶液中活的微生物细胞的数量的 方法，其包含使样品溶液滤过具有疏水性的滤膜，以将微生物截留在疏水障壁内；向其中施 加ATP提取剂的细雾以提取出微生物中的发光成分；向其中再施加针对所提取的发光成 分的液体发光诱导剂的细雾，以使所述成分发光；和使用能够测量发光量的构件，测量发光量。美国专利第5，258，285号描述了一种测定包含细菌和体细胞的细胞群中细菌的
数量的方法。美国专利申请公开案第US2008/014607号描述了一种用于检测和计数液体样品 中可能存在的指定种类的活细胞的基于生物发光的方法，其包含测量指定的非病毒种类的 活细胞中以ATP形式表达的总游离细胞内腺嘌呤核苷酸(adenyl nucleotide, AN)的含量。国际专利申请公开案第W092/20263号描述了 一种用于检测、鉴别和/或计数牛奶 中活细胞的方法，其中用荧光染料(例如酯酶依赖性染料、核酸结合性染料，和检测细胞内 氧化活性的染料)选择性标记活细胞，随后进行鉴别和/或计数。美国专利第7，312，073号描述了一种用于定量活细胞的方法，其中将并入标记物 的溶胶-凝胶液体前体贯穿固定于载玻片上作为薄层涂层。在培育期间，使所述载玻片与 含有从测试样品中分离的微生物的过滤器接触。在培育过程中，微生物将摄取一个或一个 以上标记物。随后照射载玻片，并检测由微生物中所含的标记物发射的信号，由此产生影像 以供微生物的检测计数。另外，用于计数制药用水中微生物的两小时方法描述于琼斯(Jones)等人(药典 论坛(Pharmacop. Forum) 1999，25，7626-7645))中。
发明内容
本发明是基于细胞膜动力学的利用，根据细胞膜动力学，可培养(分裂的)细胞将 持续进行膜运输。本发明者现设想，在可培养的微生物细胞中，细胞膜内化，与内部的膜隔 室融合，随后以比非分裂细胞高得多的速率再并入膜中。具体点说，本发明是基于以下发现利用能够缔合膜并内化于微生物细胞的细胞 内隔室中的荧光染料对微生物细胞染色，使得所述染料在细胞内积累。此内化过程具有一 个特有的特征，即，在第一时间段Tl后，积累达到平稳的平台期，并且在特有的第二时间段 T2中，积累量稳定保持此平台期。另外，本发明是基于以下发现对于指定的微生物细胞类型或一组微生物细胞，第 一时间段Tl与第二时间段T2是某一(某些)细胞类型所特有的。换句话说，对于指定的 细胞类型(或一组细胞)，当在相同的预定条件下测量时，Tl与T2将基本上保持恒定。因此，根据本发明的第一方面，本发明提供一种测定指示测试样品中可培养的微 生物细胞的数目的数量值的方法，所述方法包含
(i)使容易携带可培养的微生物细胞的测试样品与至少一种能够缔合所述微生 物细胞的膜的信号发射剂接触，所述接触将持续预定的第一时间段(Tl)，所述第一时间段 (Tl)足以使所述信号发射剂内化于所述微生物细胞中，达到使得由所述样品发射的信号基 本上达到平台期的水平；(ii)从所述测试样品中去除未内化的信号发射剂；(iii)在所述第一时间段(Tl)后，于第二时间段(T2)期间，且在此期间所述信号 基本上保持在所述平台期，由所述样品内信号发射物体检测发射信号的可培养细胞，所述 检测是基于针对所述可培养细胞而预定的选择参数；和(iv)根据所述所选的信号发射物体，测定所述测试样品中指示可培养细胞的数目 的数量值。本发明也提供一种用于测定测试样品中等于可培养的微生物细胞数目的数量值 的试剂盒，所述试剂盒包含(i)至少一种能够缔合微生物细胞的膜的信号发射剂，(ii)有关使所述至少一种信号发射剂与所述样品接触达第一时间段(Tl)的说 明，所述第一时间段(Tl)足以使所述信号发射剂内化于所述微生物细胞中，达到使得由所 述样品发射的信号基本上达到平台期的水平；(iii)有关从所述样品中去除未缔合的信号发射剂的说明；(iv)有关由所述样品内信号发射物体检测和选择发射信号的可培养细胞的说明， 所述检测是基于针对所述可培养细胞而预定的选择参数，所述检测和选择是在所述Tl后 于第二时间段0 期间进行，并且在此期间，所述信号基本上保持在所述平台期；(ν)有关使用所述所选的信号发射物体来测定测试样品中指示可培养细胞的数目 的数量值的说明。本发明还提供一种用于测定测试样品中指示可培养的微生物细胞的数目的数量 值的系统，所述系统包含(i)载体，其用于保存样品，并允许样品与一种或一种以上信号发射剂接触；(ii)检测器，其用于检测样品内信号发射物体，并输出其对应的数据；(iii)存储单元，其包含具有预定的选择参数和多个预定的标准化因子的数据库， 每一选择参数和每一标准化因子对于某一微生物细胞或对于某一组微生物细胞具有特异 性；(iv)处理单元，其用于接收来自所述检测器的输出数据、来自所述存储单元的一 个或一个以上所述参数和所述标准化因子，并用所述参数和所述标准化因子处理所述输出 数据，以测定所述样品中指示所述可培养的微生物细胞的数目的数量值。本发明还提供一种机器可读的程序存储装置，其明确地实施可由所述机器执行的 指令程序，以执行用于测定测试样品中指示可培养的微生物细胞的数目的数量值的方法， 所述方法包含(i)使容易携带可培养的微生物细胞的所述测试样品与至少一种能够缔合所述微 生物细胞的膜的信号发射剂接触，所述接触将持续预定的第一时间段(Tl)，所述第一时间 段(Tl)足以使所述信号发射剂内化于所述微生物细胞中，达到使得由所述样品发射的信 号基本上达到平台期的水平；
(ii)从所述测试样品中去除未内化的信号发射剂；(iii)在所述第一时间段(Tl)后，于第二时间段(T2)期间，且在此期间所述信 号基本上保持在所述平台期，由所述样品内信号发射物体检测和选择发射信号的可培养细 胞，所述检测是基于针对所述可培养细胞而预定的选择参数；和(iv)根据所述所选的信号发射物体，测定所述测试样品中指示可培养细胞的数目 的数量值。此外，也提供一种计算机程序，其包含当所述程序在计算机上运行时执行本发明 所有步骤的计算机程序代码构件，所述计算机程序是在程序存储装置中实施。
为了解本发明并且看其实际上如何进行，现将仅通过非限制性实例，参考附图来 描述实施例。图1是展示作为样品的时间函数的荧光强度的图，所述样品包含来源于城市用水 的细菌细胞(-■“)、分离的大肠杆菌(- “)和绿脓杆菌(-▲“)的混合物，其荧经光染 料FM1-43染色。图2是绘制样品中微生物细胞的CFU/ml计数相对于同一样品中微生物细胞的量 的定量测量的图，所述定量测量是通过本发明的方法来获得。图3A-;3B是展示通过常规方法所获得的CFU/ml计数(标准CFU/ml)与根据本发 明的一个实施例所获得的CFU当量之间的相关性(图3A)以及每一测试样品各值(CFU当 量与常规CFU/ml)之间的相关性(图:3B)。表2中的结果也绘制成图，以图3A( 表示CFU当量，■表示标准CFU)提供，CFU 当量与标准CFU之间的相关性在图:3B中呈现。
具体实施例方式本发明大体提供在用常规信号发射剂对样品染色之后在数分钟内定量测量样品 (通常为液体样品)中可培养微生物细胞的量的方法、试剂盒和系统。常规微生物细胞计数技术，例如下文论述的异向板计数器(Heterotropic Plate Count, HPC)，通常需要培养微生物细胞若干小时以区别死细胞与可培养微生物细胞且仅计 数培养的细胞。一些可培养微生物细胞鉴别为菌落形成单位(CFU/ml)。为此，本发明允许 在几分钟内仅计数可培养微生物细胞以得到等于CFU的数量值。因此，本发明得到CFU当 量，同时与常规方法相比，缩短所需的时间且降低所需的成本。虽然本发明的CFU当量与常 规菌落形成单位测量(例如HPC)相关，但可能存在一些不同且任何所述不同的差异都不会 超过30%以上、优选不大于10%且更优选不大于5%。在本发明的情况下，术语“可培养微生物细胞”或“可培养细胞”用于表示当放置 在合适的受控培养基上时可分成两个(子)细胞的显微镜或超显微镜尺寸的任何细胞(例 如母细胞)。因此，术语“非可培养微生物细胞”表示即使有活力，当放置在培养条件下时也 不且不能分成子细胞的细胞。微生物细胞可包括(但不限于)细菌，例如大肠菌类细菌(Coliforming bacteria)(大肠杆菌(Ε. Coli))、肠细菌(沙门菌属(salmonella)、李斯特菌属(listeria)、志贺菌属(shigella))、假单胞菌群(Pseudomonas group)(铜绿假单胞 |if (pseudomonas auriginosa) > 5 7 Iix Ifi lif (pseudomonas f luorescensa)) > ^f 菌群(Staphylococcus group)(金黄色葡萄球菌(staphilococus aureus)、粪链球菌 (streptococcus fecalis))、链球菌群(Streptococcus group)禾口 甲烧菌等；霉菌，例 如黑曲霉(Aspergillus niger)、青霉菌群(penicillium group)等；酵母，例如念珠菌 群(Candida group) > Sachramises group 等；原虫，例如隐 包子虫群(Cryptosporidium group)、贾地虫群(Giardia group)、变形虫(Amoeba)等；藻类，例如绿藻(green algae) 等；嗜酸细菌(Acidophylic bacteria, TAB)；军团菌群(legionella group)；弧菌 (Vibrio)物种等。本发明可获得各种应用，优选但非排他性地为在需要基本上立即鉴别和定量样品 中的微生物污染(例如引起疾病(病原性)因子)时。举例来说，本发明方法可适用于定 量测量饮用水中微生物细胞的量。一些其它应用可能与工业微生物学(例如存在于食物或 饮料中的细胞、个人护理、工业工艺和卫生保健相关感染)、水生系统(饮用水、工艺用水、 废水、天然水源、改水，例如游泳池、矿泉疗养地和海滩等)、医学微生物学(血浆、唾液、尿、 咽喉样品、胃肠液)、环境微生物学(土壤、空气表面)等相关。如上文所指示，本发明提供的用于几乎实时测定样品中可培养微生物细胞的量的 解决方案是基于膜运输的利用或细胞膜向细胞间隔室的移动，这些在可培养细胞中发生的 程度是在有活力但非可培养细胞中发生的程度的1. 5、3、6、12且甚至高达20倍。非可培养 细胞可包括例如孢子、合成代谢细胞等。因而，发明者因此假设如果可用与膜缔合的膜信号 发射剂对细胞的膜染色且发生膜运输，那么与非可培养细胞相比，信号发射剂在可培养细 胞中积聚的程度更高，从而从这些可培养细胞中产生更强的信号。术语“基本上立即”或“立即”或“几乎实时”表示从起始本发明方法到捕捉到测试 样品的至少一个可推断(通常且优选通过影像处理，将在下文进一步论述)根据本发明的 CFU当量的影像的时间窗不到20分钟，优选不到15分钟，更优选不到10分钟。换句话说，
本发明方法是瞬时的，不需要长期(数小时)培养细胞以测定测试样品中可培养细胞的数目。因此，根据本发明的第一方面，本发明提供一种测定指示测试样品中可培养的微 生物细胞的数目的数量值的方法，所述方法包含(i)使容易携带可培养微生物细胞的测试样品与至少一种能够缔合所述微生物细 胞的膜的信号发射剂接触，所述接触将持续预定的第一时间段(Tl)，所述第一时间段(Tl) 足以使所述信号发射剂内化于所述微生物细胞中，达到使得由所述样品发射的信号基本上 达到平台期的水平；(ii)从所述测试样品中去除未内化的信号发射剂；(iii)在所述第一时间段(Tl)后，于第二时间段(T2)期间，且在此期间所述信号 基本上保持在所述平台期，由所述样品内信号发射物体检测信号发射可培养细胞，所述检 测是基于针对所述可培养细胞而预定的选择参数；和(iv)根据所述所选的信号发射物体，测定所述测试样品中指示可培养细胞的数目 的数量值。根据本发明的方法包含提供易具有可培养微生物细胞和允许培养所述细胞的条件的样品。所述条件可由所属领域的技术人员基于可用技术容易地确定且通常将视怀疑样 品中存在的微生物细胞或微生物细胞群的类型而定。所述条件可例如与HPC所需的条件相 似或相同。测试样品可为液体、半液体以及干物质。当样品是液体样品时，可在起始测定分析 之前加以干燥。样品不需要达到完全干燥，而是从其中去除至少一部分液体，以浓缩样品中 的细胞得到细胞浓缩物。浓缩液体样品中的微生物细胞可使用生物实验室中可用的任何方法。这些方法包 括(但不限于)经由合适的过滤器过滤样品、离心和其它干燥技术。用一种或一种以上信号发射剂对样品(原样或从其中去除至少一部分液体之后 的样品)染色。如本文所使用的术语“信号发射剂”表示在适当条件下发射可检测信号的 任何化学实体。信号发射剂可为光发射剂(例如比色剂)或发光发射剂，后者为例如光致 发光(包括荧光或磷光)、化学发光、辐射发光、热发光；或细胞标记领域熟知的任何其它信 号发射剂。根据本发明可使用的发光发射部分的实例包含(但不限于)生物发光剂，包 括基于荧光素的试剂(6-0-β-吡喃半乳糖基荧光素)、荧光剂，包括Alexa Fluor家族 (英杰公司(Invitrogen))的成员、PromoFluor 染料(普莫金公司(PromoKine))HiLyte Fluors (安纳斯派克公司(AnaSpec))、DyLight Fluors (皮尔斯(Pierce)，赛默飞世尔科 技(Thermo Fisher Scientific))和ATTO染料系列(ATT0-TEC和西格玛-阿尔德里奇 (Sigma-Aldrich)) 0所属领域的技术人员应了解，根据本发明可使用多种荧光剂或其它发 光剂。在一个实施例中，所述试剂包含发光剂，优选结合于亲脂性连接子的荧光部分，从 而允许缔合，例如用可培养细胞膜包埋至少一部分所述试剂，从而通过膜运输将所述试剂 内化于细胞中。信号发射剂缔合于可培养细胞的细胞膜通常是非特异性的且是试剂亲脂性的结 果(例如归因于发光部分连接于亲脂性连接子)。因此，非特异性信号发射剂通常用于获得 总可培养细菌计数(TCBC)。本发明还允许即使样品具有微生物混合物，也能获得样品中特异性类型的可培养 微生物细胞的细胞计数。此举可使用各种特异性信号发射剂单独或与非特异性信号发射剂 组合实现。术语“特异性的”或“特异性”在术语“特异性信号发射剂”的情况下用于表示对膜 或特异性细胞类型(需要在样品中检测的细胞)的细胞内组分具有亲和力和/或选择性结 合的试剂。特异性信号发射剂可包含靶向实体，即对细胞的细胞外组分具有结合特异性的配 体。在一个实施例中，靶向信号发射剂使得其可内化于可培养细胞中，从而允许仅检测那些 已内化有信号发射剂的细胞。在另一实施例中，靶向(特异性)信号发射剂不内化于其靶向的细胞中，且由这一 特异性信号发射剂与非特异性信号发射剂的组合检测这些细胞。为此目的，非特异性信号 发射剂提供总可培养细菌计数，且特异性信号发射剂提供细胞类型(信号特异性结合的细 胞类型)的总计数。然后叠加从用两种信号发射剂获得的影像发射的信号，以便从仅那些发射两个信号的细胞，即满足可培养标准与能够结合特异性试剂的细胞推断。信号发射剂的特异性还可使用酶促实体实现(例如在酶活化对某一细胞类型具 有特异性的细胞内反应时)。所述酶可包括(但不限于)作用于邻硝基苯基-D-吡喃半 乳糖苷以产生信号发射降解产物的酶。其可有助于鉴别样品中的具有产生信号发射降解产 物的特异性酶的特异性细胞群体。在又一实例中，特异性(靶向)可通过使用细胞特异性抗体(单克隆以及多克隆) 来实现。抗体实例可包括抗沙门菌属LPS抗体、抗CD18抗体、大肠杆菌LPS抗体(例如大 肠杆菌J5 LPS抗体)、抗沙门菌属鞭毛抗原抗体、抗大肠杆菌K99附着因子抗体。作为另一 实例，抗体可为免疫脂质体(连接于脂质体的抗体)。在又一实例中，特异性可使用噬菌体(例如荧光噬菌体)来实现。因为本发明方 法在数分钟内提供数量值，所以有可能在荧光噬菌体损害细胞之前完成分析。举例来说，可 使用噬菌体兰巴噬大肠菌体(Lamba Coliphage 1，LGl)检测大肠杆菌并定量。非特异性与特异性信号发射剂的组合的实例可为(但不限于)结合于霍乱B毒素 结合蛋白质以检测霍乱物种的发光部分，同时可使用连接于大肠杆菌特异性膜脂多糖的发 光部分定量大肠杆菌，各与非特异性信号发射剂(例如实例中使用的FM1-43)组合使用。应注意，所述试剂可不断发射信号，或所述信号可通过诸如细胞内隔室内所发生 的酶促过程(所述酶促反应操纵所述试剂发射信号或酶促降解产物发射信号(如上所述)) 的刺激、辐射刺激等产生。接触期期间，信号发射剂缔合细胞的膜。在本发明的情况下，术语“缔合”表示试 剂与细胞的膜的任何类型的相互作用；其包括(但不限于)静电键结、离子键结、共价键结、 包埋标记物的至少一部分于细胞的膜中、抗原-抗体键结、受体-配体键结等。在本发明的 情况下，术语“缔合”还涵盖已内化于细胞中的任何信号发射剂。易携带可培养微生物细胞的样品的接触时间应足以使信号发射剂内化于细胞中 且足以细胞内积聚信号发射剂。发明者已发现，归因于可培养细胞中发生的膜运输的程度 大于非可培养细胞，所述可培养微生物细胞在细胞内具有较大量的积聚试剂。在给定条件 下，非可培养细胞与可培养细胞之间的积聚试剂的量可相差1. 5、3、6、12且甚至高达20倍。 发明者另外确定，细胞内试剂的积聚达到平台期。试剂达到平台期所需的时间在本文中定义为“Tl”。时间Tl是细胞类型的特征且 是预定的。Tl的预定可通过用信号发射剂对所选细胞类型染色且检测信号强度随时间的变 化直到信号强度基本上无变化来达成。信号强度无明显变化的时间点即定义为达到平台期 的时间。如本文所使用的术语“平台期”表示细胞内积聚的信号发射剂的水平保持同一值 达至少50、250且甚至长达900秒。为了说明起见，提及本文提供的实例，所述实例显示含有分离的大肠杆菌的样品 经非特异性信号发射剂FMl-43(分子探针公司(Molecular probes)制造)染色需要约90 至110秒的Tl来使捕捉的信号的水平达到稳态水平；而也经FM1-43染色的含有分离的绿 脓杆菌(Ps. aeruginosa)的样品需要约70至100秒的Tl来达到稳态水平。因为易处于测试样品中的细胞(或细胞群)的Tl是事前确定的，所以有可能确定 洗涤除去未缔合且优选未内化信号发射剂的时间点。所述试剂的洗涤可利用所属领域中已 知的任何技术达成。所述技术可包括(但不限于)过滤(例如用常规微生物过滤器)、离心(例如4500rpm以上)和允许分离细胞与溶解或悬浮于样品液体中的未缔合试剂的任何其 它技术。检测缔合有信号发射剂的细胞作为信号发射物体。然而，应了解，信号发射剂也可 缔合样品中的不为完整可培养细胞的细胞组分或其它人工产物，且可提供假信号。类似地， 信号可来自聚集的信号发射剂(即未充足溶解于样品中)。因此，所述方法提供检测及选 择仅那些起源于缔合有试剂且内部内化有试剂的细胞的信号发射物体的工具。在本发明的 情况下，术语“信号发射物体”表示测试样品中的发射信号的任何光学点。信号发射物体未 必要具有细胞尺寸，且实际上可能归因于由从细胞发射的信号形成的环绕细胞的晕圈而较 大，特别是当成像的细胞在焦点外(“�：Α�)时。此由当将信号发射细胞成像时，透镜的 光射线锥未聚焦于完美焦点引起。检测和选择在信号达到平台期之后在第二时间段T2进 行。这一时间段T2表示从信号发射物体发射的信号基本上稳态地保留在平台期期间的时 间窗。在T2期间，检测数个信号参数。这些参数包括从信号发射物体发射的信号的强 度、测试样品内信号发射物体的尺寸、信号发射物体的形态。微生物细胞或微生物细胞群的选择标准要求从检测物体发射的信号的强度至少 低于预定上限，且在一些实施例中，在预定强度范围内。因此，舍弃例如从细胞片段(死亡 和损害的细胞)发射的低于预定最低水平的信号强度或例如从试剂聚集体发射或从样品 中的非细胞体发射的高于预定最大水平(上限)的信号强度。选择标准还要求信号发射物体具有预定尺寸范围。其包括舍弃低于最低阈值(例 如与细胞片段相关)或高于最大阈值(例如来自样品中的大型体)的物体。另外，选择标准可要求信号发射物体具有预定形态。应了解，细胞形态一般表示 给定细菌物种的特征且所述细胞具有多种形态。这些形态可包括基本上圆形(例如球菌 O^oci))、基本上细长形(例如杆状菌(Bacilli))、杆状形态等。信号发射物体通常将具有 对应于(类似于)发射所述信号的细胞的形状。举例来说，细长形信号发射物体通常将来 源于细长形微生物细胞。物体形状的检测不仅允许舍弃非微生物信号发射物体(即人工产 物)，而且可有助于鉴别发射信号的细胞的类型。在一个实施例中，需要至少满足强度参数和尺寸参数，以便检测和选择信号发射 物体。应注意，所述选择参数可随应用而变化。例如，对于测试饮用水，范围、阈值和所选 形状都不同于测试例如湖水的水质而预定者。以下非限制性实例显示，对于至少包含大肠杆菌和绿脓杆菌的微生物混合物，测 定的尺寸范围为直径0. 8-2 4!11，且测定的强度参数低于25461^且在60-2讨61^的范围内，实 例中未显示)。在一个实施例中，需要达到至少两个参数，较佳强度参数和尺寸参数，以便鉴别信 号发射物体。一旦鉴别出信号发射物体达到了预定的选择标准，即选出这些物体，并由其推 算出数量值。在一个实施例中，将其强度的均方根值相加；较佳用预定的标准化因子使此相 加得到的强度值标准化(例如，通过使用预定的等式(参看下文的材料与方法))，由此得 到指示样品中可培养的微生物细胞的数目的数量值(即，CFU当量)。标准化因子对于某一 细胞类型或每一测试样品类型(即，每一应用)的某一组细胞具有特异性，并且是基于事先在每一应用的控制条件下测量的测试样品中所述细胞的量测定。例如，先在对照条件下并 通过将如所述从捕捉的影像获得的值与借助于例如HPC等常规方法得到的细胞计数(CFU/ ml)相关，来测定某一地理位置的饮用水的标准化因子。随后，使用此标准化因子将来在所 述位置进行饮用水质量的测定(参看材料与方法)。根据本发明一个实施例，测定包含大肠杆菌与绿脓杆菌的混合物的测试样品的标 准因子(等式)0. 025x+0. 3375 (χ为总荧光值的对数坐标)。本发明还提供测定等于测试样品中可培养微生物细胞的数目的数量值的试剂盒， 所述试剂盒包含-至少一种能够缔合微生物细胞的膜的信号发射剂，-有关使所述至少一种信号发射剂与所述样品接触达第一时间段(Tl)的说明，所 述第一时间段(Tl)足以使所述信号发射剂内化于所述细胞中，达到使得由所述样品发射 的信号基本上达到平台期的水平；-有关从所述样品中去除未缔合的信号发射剂的说明；-有关由所述样品内信号发射物体检测和选择发射信号的可培养细胞的说明，所 述检测是基于针对所述可培养细胞而预定的选择参数，所述检测和选择是在所述Tl后于 第二时间段0 期间进行，并且在此期间，从样品发射的信号基本上保持在所述平台期；-有关使用所述所选的信号发射物体来测定测试样品中指示可培养细胞的数目的 数量值的说明。试剂盒还可包含说明在用所述信号发射剂对样品染色之前从所述样品中去除至 少一部分液体的说明。根据本发明的一个实施例，试剂盒包含多个信号发射剂。因此，为某一应用(即专 用于测试家用市政水的质量的试剂盒)所特有的所述多个试剂将包括对市政水中通常发 现的微生物细胞具有特异性的试剂。在一个实施例中，说明书包括选择待检测细胞或细胞群的指南，而且包括为所述 细胞或细胞群预定的信号强度上限和/或信号强度范围、欲检测的物体的尺寸范围和预定 的信号发射物体的形态以及选择那些满足所述指南的物体的说明。此外，根据这一特定方面，试剂盒可包含一个或一个以上预定细胞特异性标准化 方程式，各方程式对于细菌细胞类型、真菌或其它微生物类型具有特异性；和用于由其推断 CFU当量数量值的所述预定方程式的使用说明书。本发明还提供一种用于测定指示测试样品中可培养微生物细胞的数目的数量值 的系统，所述系统包含-载体，其用于保存样品和用于允许所述样品与一种或一种以上信号发射剂接 触；-检测器，其用于检测样品中的信号发射物体和输出其相应数据；-存储单元，其包含具有预定选择参数和一个或一个以上预定细胞特异性标准化 因子的数据库，各选择参数各标准化因子对于微生物细胞或一组微生物细胞具有特异性；-处理单元，用于从所述检测器接收输出数据和用于从所述存储单元接收选择参 数和对于微生物细胞或一组微生物细胞具有特异性的所述标准化因子并且用所述参数和 所述标准化因子处理所述输出数据，以由其测定等效于样品中所述可培养微生物细胞的数目的数量值。所述载体可以是可保存生物学细胞的任何容器。在一个实施例中，载体包含用于 从所述样品中滤除至少一部分液体并且保存半干或干燥样品的过滤器。本发明的检测器通常包含发光成像系统，例如能够捕捉由测试样品发射的发光信 号的一个或一个以上影像的照相机。可根据本发明使用的照相机的非限制性实例包括电荷 耦合装置(charge-coupled device ；CCD)、CM0S检测器、光电二极管(PD)检测器、光电倍增 管(photomultiplier tube ；PMT), γ粒子计数器、闪烁计数器或发光物体成像领域中已知 的任何其它信号捕捉装置。影像处理单元配置成接收由测试样品发射的一个或一个以上影像并且基于信号 发射物体的选择参数对其鉴别样品中可培养细胞的数目。如本文中所使用，术语“处理单元”表示经预编程以由样品中的信号发射物体收集 测量信号参数并且进行数据分析的任何数据处理和分析实用程序，其由根据预定条件选择 信号参数和基于所选选择参数输出数量值组成。为此目的，所述处理单元带有配置成进行 所述分析的以电脑为基础的程序。在一个实施例中，影像处理单元是配置成在整个信号发射物体中选择信号强度在 预定范围内、大小在预定范围内并且具有预定形态的那些物体；并且对所选信号发射物体 测定均方根值强度。处理单元进一步配置成基于由所选物件发射的均方根值强度输出数量 值。在另一实施例中，影像处理单元配置成用从数据库得到的标准化因子标准化数量 值以获得等效于CFU/ml计数的标准化值。本发明已以说明性方式进行描述，并且应了解已使用的术语打算具有描述而非限 制的词语的性质。显然，根据上述教示，本发明的许多修改和变化是可能的。因此，应了解 除下文具体所述外，本发明可在随附权利要求书的范围内实践。除非本文另外明确指示，否则如说明书和权利要求书中所使用，形式“一 (a/an)，， 和“所述”包括单数以及复数指示物。举例来说，术语“信号参数”包括一个或一个以上参数。此外，如本文中所使用，术语“包含”打算是指方法、试剂盒和系统包括所述要素，
但不排除其它要素。类似地，“基本上由......组成”用于定义方法试剂盒和系统包括所述
要素，但排除在本发明的执行方面可能具有基本有效性的其它要素。“由......组成”的意
思应是排除超过微量要素的其它要素。由这些转换术语各自定义的实施例都在本发明的范 围内。此外，所有数值(例如浓度或剂量或其范围)都是近似值，其是规定值正负变化至 多20%，有时至多10%。应了解，即使不一定总是明确地规定，所有数值符号也应当作之前 加上术语“约”。还应了解，尽管未必明确地规定，本文所述的试剂也仅为示范性的并且其等 效物为所属领域所已知。非限制性示范性实施例的描述舰在以下非限制性实例中，使用包含城市用水(自来水)与预定浓度的细菌混合的 样品来测定本发明的方法的效率。
在各样品中，使用本发明的方法以及标准CFU计数(检查水和废水的标准方法 (Standard Methods for Examination of Water & Wastewater)(勒诺 S.克雷斯尔(Lenore S. Clescerl)(编辑)，阿诺德E.格林堡(Arnold Ε. Greenberg)(编辑)，安德鲁D.伊顿 (Andrew D. feton)(编辑)·第18版，2002.)定量有活力的可繁殖微生物的量。比较结果 并且本发明的方法的功效与CFU方法的相关性为R2 = 0. 997。材料与方法微牛物细胞提供三种微生物细胞原料制剂从自来水中分离出大肠杆菌(第一种制剂)和绿脓杆菌(第二种制剂)的天然形 式，用于大肠杆菌、胰蛋白胨胆汁X-葡糖苷酸(Tryptone Bile X-Glucuronide ；TBX)培养 基(普洛麦格公司(!Iomega)制造)和用于绿脓杆菌溴化十六烷基三甲铵琼脂(Cetrimide agar)(普洛麦格公司(!Iomega)制造)。第三种制剂含有常规自来水并称为微生物混合物 制剂(因为其通�：形⑸锘旌衔�)。将培养和分离的大肠杆菌和绿脓杆菌以及自来水制剂各转移到肉汤生长培养基 中并通过使用溶菌肉汤(Lysogeny broth ；LB)培养基(普洛麦格公司(Promega)，目录号 7290A)震荡来培育。用于三种制剂的培育条件大肠杆菌-35°C，18小时；绿脓杆菌-30 "C，40小时；水微生物细胞混合物-30°C，72小时。通过离心(6，000RPM, 5分钟)，使用Iso标准PBS将培养的制剂冲洗三次。在此阶 段，如通过微生物过滤CFU计数所测定的微生物浓度测定为约10lclCFU/ml，大肠杆菌；109CFU/ml，绿脓杆菌；和108CFU/ml，来源于水的微生物混合物。随后，用无菌PBS稀释微生物制剂(大肠杆菌和绿脓杆菌)，同时按原样使用自来 水细菌混合物制剂或用无菌自来水(通过过滤自来水通过0. 22μπι微生物过滤器(密理博 公司(Milipore)制造)制备)稀释。使用微生物过滤(0.45um过滤器)程序，用范围为 0. 01毫升到1公升的悬浮液测试体积制备异养菌平板计数(Heterotrophic Plate Count ； HPC) (Standard Methods for Examination of Water & Wastewater) / 勒诺 S.克雷斯尔 (Lenore S. Clescerl)(编辑)，阿诺德 Ε·格林堡(Arnold Ε. Greenberg)(编辑)，安德鲁 D.伊顿(Andrew D. Eaton)(编辑)·第 18 版，2002.)。在 PCA (普洛麦格公司(Promega)， 目录号7157A)培养基上使用如下培育条件培育过滤器大肠杆菌-35 °C，24小时；绿脓杆菌是30 V，48小时；细菌混合物是30°C，72小时。CFU计数的结果标准化为1公升测试体积。荧光染型在以下实验中，使用浓度为lyg/ml PBS溶液的FM1-43苯乙烯基染料(西川S. (Nishikawa S.)佐佐木F. (Sasaki F.)苯乙烯基染料FM1-43在非洲爪蟾的侧线器官的 毛细胞中的内在化(Internalization of styryl dye FM 1-43 in the hair cells of lateral line organs in Xenopus larvae),组织化学与细胞化学(Histochem Cytochem), 1996 44(7) :733-41)。染饩方法在室温(约25°C)下使用FM1-43苯乙烯基染料进行微生物细胞制剂的荧光染色。 使用细胞的单层制剂测定染色的时间和工作时间窗，且确定信号需要2分钟达到信号平台 期(Tl，参见下文Tl和T2的测定)并且所述平台期在稳定状态下保持约600秒时间(Tl， 参见下文Tl和T2的测定)。在染色结束时，用iso标准PBS冲洗培养物三次。应注意对于 过滤器表面粘着的培养物或悬浮的培养物使用相同染色方法(即这对于单层制剂不具有 特异性)。荧光成像使用Axiovert 200 显微镜(卡尔蔡司公司(Karl Zeiss))，1· 3NA Plan Neofluor XlO物镜(BP450-490激发过滤器(激发450-490nm ；光束分离器FT 5IOnm ；发射 515-565nm;卡尔蔡司公司(Karl Zeiss))获得信号发射样品的荧光影像。影像捕捉使用标准^^^⑶！!! qe (柯克公司(Cooke Corp. )) 512 X 512CCD捕捉影像。影像处理使用Imageftx)+软件Q002)进行影像处理和数据收集。Tl和T2的测定为测定Tl，由原料制剂制备三种样品，即包含天然存在于自来水中的细菌混合物 的自来水样品(在如上文所述培养于培养基上和用PBS洗涤后)；分离的大肠杆菌的第二 样品(在如上文所述培养和用PBS洗涤后)；和分离的绿脓杆菌的第三样品(在如上文所 述培养和用PBS洗涤后)。根据HPC方法分析来自各原料制剂的样品，获得相应常规CFU/ml计数。随后用PBS稀释各样品，获得约1000CFU/ml浓度的样品。随后用FM1-43对各样 品染色并且每10秒以单层成像(如上文所述)直到由单层发射的信号达到平台期。信号 达到平台期的时刻测定为Tl。T2的测定在另一组从三种制剂稀释的三种所述样品中，在样品染色后约110秒，用PBS洗涤 样品，并且在10秒的时间顺序以单层成像，直到信号开始消退。信号开始消退的时间点测 定为T2。以上程序重复三次。绘制在测量阶段期间捕捉的信号的强度并且结果在图1中展示。CFU当量的测定为鉴别CFU当量(即用标准CFU/ml计数校准本发明的测量)，收集和使用来自三 处不同地理位置(A、B和C)的自来水的总共三种样品。如上文关于Tl测定所述制备来自 各位置的制剂，获得分离的大肠杆菌和绿脓杆菌样品以及细菌混合物样品。对于各位置，基 于HPC方法推测各细菌细胞的浓度或各制剂的总细菌计数(即获得稀释前的TBC)，接着用无菌水稀释来自细菌混合物制剂的样品(即来自各位置，总共3个)，获得四个近似浓度， 1000CFU/ml、100CFU/ml、10CFU/ml 和 lCFU/ml,即总共 12 个样品。根据HPC方法并且也根据本发明的方法分析12个样品的每一者。在后者情况下， 如上文所述用FM1-43对各样品染色，120秒后用无菌水洗涤(即在平台期开始时)并且立 即成像(在约150-180秒时)。根据信号选择参数处理影像。具体来说，一旦捕捉到影像， 就对满足选择参数的物体计数，并且测定其均方根强度。选择的结果在下表1A-1B中提供。将从以上制备的样品中分离的大肠杆菌和绿脓杆菌确切地处理成细菌混合物样 品。观察到变化的动力学类似于细菌混合物，并且由类似浓度的细菌混合物样品获得的信 号不存在显著变化(数据未显示)。本发明的方法的验证由如上文所述的三处不同位置制备总共48个微生物测试样品(每一位置得到4 个样品，每一样品一式三份)。具体来说，用无菌水X10、X100稀释或不稀释来自各位置 的制剂(细胞浓度未知)。同样，从各位置，通过用0.22 μ m筛网过滤器(硝基纤维素，密理 博(Milipore)制造)对原料制剂的一个样品灭菌。随后用FM1-43对各测试样品染色，用无菌水洗涤并使用常规HPC方法或如上文所 述的本发明的方法分析。结果在下表2中展示。荧光测量所有荧光测量和相应CFU计数都在室温(约25°C )下进行。成像和信号处理出于影像分析目的，当通过对应于12- 像素(在这些非限制性实例中所用的特 定设置下)的光学显微镜观察时，微生物信号发射物体(即计数用的物体)测定为大小为 0. 8-1.5μπι。这些是选择标准。在本文所提供的非限制性实例中，除非另有规定，否则样品在染色后150到180秒 (即在染色2分钟后不久)成像。此外，对于邪4灰度级(或介于60-2MGL之间)的“微 生物物体”的最大荧光强度校准曝光时间。曝光时间调整为0. 8秒。使用平均计算和标准偏差(以％表示)测定数量值。MM本发明是基于以下了解可繁殖(可培养)微生物细胞可将细胞外细胞壁的脂质 部分内化于细胞内并进行浓缩一段时间(比不可培养的微生物细胞快)。膜运输速率和其 细胞内浓度水平与细胞活性有关，在可繁殖微生物中极高。因此，发明者已设想这一现象可 用于区别样品中有活力的可繁殖细胞和定量所述细胞的量。Tl和Τ2的测定图1展示直到信号达到平台期时FM1-43的累积是在染色后约120秒。因此这个 时间点标记为Tl。稳定细胞内染料累积在平台期开始115到550秒的时间窗内维持稳定。换句话说， 细胞混合物的细胞内隔室内的荧光染料累积在115秒后变得稳定且照那样保持至少550 秒。因此，已确定，对于液体样品中的大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌(Sp. Aeruginosa)的定 量测定，约115至约550秒的时间窗是有效测量窗T2。CFU当量的测定
处理如上文所述用于测定CFU当量的12个微生物样品的影像，从其中选择满足预 定选择标准的物体(即当通过对应于12- 像素、2M灰度级的最大强度的光学显微镜观察 时,大小为0. 8-1. 5 μ m)。所选物件的强度的所测定均方根值以及通过常规HPC方法获得的CFU/ml计数包 括在表1A-1B中。基于对于原料制剂获得的CFU/ml计数测定近似浓度。通过位置(A、B或 C)和每一位置的样品数目(X1、X2或X3)鉴别不同样品。表IA 细菌混合物样品的分析
权利要求
1.一种用于测定测试样品中指示可培养的微生物细胞的数目的数量值的方法，所述方 法包含(i)使容易携带可培养的微生物细胞的所述测试样品与至少一种能够缔合所述微生 物细胞的膜的信号发射剂接触，所述接触将持续预定的第一时间段(Tl)，所述第一时间段 (Tl)足以使所述信号发射剂内化于所述微生物细胞中，达到使得由所述样品发射的信号基 本上达到平台期的水平；(ii)从所述测试样品中去除未内化的信号发射剂；(iii)在所述第一时间段(Tl)后，于第二时间段(1 期间，且在此期间所述信号基本 上保持在所述平台期，由所述样品内信号发射物体检测发射信号的可培养细胞，所述检测 是基于针对所述可培养细胞而预定的选择参数；和(iv)根据所述所选的信号发射物体，测定所述测试样品中指示可培养细胞的数目的数量值。
2.根据权利要求1所述的方法，其包含在用所述信号发射剂对所述样品进行染色之 前，从所述测试样品中去除至少一部分液体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述液体去除是借助过滤或离心中的一种或一种 以上进行。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中所述样品包含一种或一种以 上类型的微生物细胞。
5.根据权利要求1至45中任一权利要求所述的方法，其中所述信号发射剂为发光剂或 光发射剂。
6.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的方法，其包含使所述样品与至少一种其 它信号发射剂接触，所述其它信号发射剂对怀疑存在于所述样品中的所选微生物细胞具有 特异性。
7.根据权利要求6所述的方法，其包含检测由所述样品中的每一信号发射剂所发射的 信号，和由所述信号测定所述样品中指示可培养的特定微生物细胞的数目的数量值。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其用于测定多个数量值，每一个值都将指示所述样 品中某一特定微生物细胞或一组特定微生物细胞的数目。
9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的方法，其中所述选择参数包含两个或两 个以上选自以下的参数由信号发射物体发射的信号的强度、所述信号发射物体的尺寸、所 述信号发射物体的形态。
10.根据权利要求9所述的方法，其中仅检测至少一信号强度低于预定上限且尺寸在 物体尺寸范围内的信号发射物体。
11.根据权利要求9所述的方法，其中仅检测至少一信号强度在预定强度范围内且尺 寸在物体尺寸范围内的信号发射物体。
12.根据权利要求9至11中任一权利要求所述的方法，其包含针对所述所选的物体计 算所述数量值。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述数量值包含所述所选物体的均方根强度。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中将所述数量值标准化以与菌落形成单元 (CFU)计数对应，所述经标准化的数量值为CFU当量。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述标准化包含用所述数量值乘以预定的细胞 特异性标准化因子，得到所述CFU当量。
16.一种用于测定等效于测试样品中可培养的微生物细胞的数目的数量值的试剂盒， 所述试剂盒包含(i)至少一种能够缔合微生物细胞的膜的信号发射剂，( )有关使所述至少一种信号发射剂与所述样品接触达第一时间段(Tl)的说明，所 述第一时间段(Tl)足以使所述信号发射剂内化于所述微生物细胞中，达到使得由所述样 品发射的信号基本上达到平台期的水平；(iii)有关从所述样品中去除未缔合的信号发射剂的说明；(iv)有关由所述样品内信号发射物体检测和选择发射信号的可培养细胞的说明，所述 检测是基于针对所述可培养细胞而预定的选择参数，所述检测和选择是在所述Tl后于第 二时间段0 期间进行，并且在此期间，所述信号基本上保持在所述平台期；(ν)有关使用所述所选的信号发射物体来由此测定所述测试样品中指示可培养细胞的 数目的数量值的说明。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其包含有关在用所述信号发射剂对所述样品进行 染色之前，从所述样品中去除至少一部分所述液体的说明。
18.根据权利要求16或16所述的试剂盒，其包含超过一种信号发射剂。
19.根据权利要求16至18中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述信号发射剂为发光 剂或光发射剂。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述信号发射剂为荧光染料。
21.根据权利要求16至20中任一权利要求所述的试剂盒，其包含选择参数，和有关使 用至少两个所述选择参数从所述样品内信号发射物体中选出发射信号的可培养的微生物 细胞的说明。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述选择参数包含预定的信号强度上限、信 号强度范围、在预定的信号发射物体的尺寸范围内的尺寸和信号发射形态。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其包含有关使用至少两个所述选择参数仅选择信 号强度低于预定的上限或在物体尺寸范围内并且尺寸在预定尺寸范围内的信号发射物体 的说明。
24.根据权利要求15至23中任一权利要求所述的试剂盒，其包含有关由所述所选的物 体计算所述数量值的说明。
25.根据权利要求M所述的试剂盒，其中所述说明包含计算所述所选物体的均方根强 度，以便由此获得所述数量值。
26.根据权利要求16至25中任一权利要求所述的试剂盒，其包含有关用标准化因子使 所述数量值标准化以获得菌落形成单元(CFU)计数当量的说明。
27.根据权利要求沈所述的试剂盒，其包含一个或一个以上预定的标准化因子，以及 有关使用所述预定的标准化因子，由测量的数量值推导出所述CFU当量的说明。
28.一种用于测定测试样品中指示可培养的微生物细胞的数目的数量值的系统，所述 系统包含(i)载体，其用于固定所述样品，并允许样品与一种或一种以上信号发射剂接触；( )检测器，其用于检测所述样品内信号发射物体，并输出其对应的数据；(iii)存储单元，其包含具有预定的选择参数和多个预定的标准化因子的数据库，每一 选择参数和每一标准化因子对于某一微生物细胞或对于某一组微生物细胞具有特异性；(iv)处理单元，其用于接收来自所述检测器的输出数据、来自所述存储单元的一个或 一个以上所述参数和所述标准化因子，并用所述参数和所述标准化因子处理所述输出数 据，以测定所述样品中指示所述可培养的微生物细胞的数目的所述数量值。
29.根据权利要求观所述的系统，其中所述载体包含用于从所述样品中滤出至少一部 分液体的过滤器。
30.根据权利要求观或四所述的系统，其中所述检测器包含用于捕捉所述测试样品内 信号发射物体的影像的照相机。
31.根据权利要求30所述的系统，其中所述处理单元经配置以由从所述检测器接收的 数据测定所检测的每一信号发射物体的信号强度、信号发射物体的尺寸、信号发射物体的 形态。
32.根据权利要求观至31中任一权利要求所述的系统，其中所述处理单元经配置以选 择信号强度低于预定的强度阈值且尺寸在预定尺寸范围内的信号发射物体。
33.根据权利要求观至31中任一权利要求所述的系统，其中所述处理单元经配置以选 择信号强度在预定强度范围内且尺寸在预定范围内的信号发射物体。
34.根据权利要求32或33所述的系统，其中所述处理单元经配置以基于由所述所选的 信号发射物体所发射的强度的均方根输出数量值。
35.根据权利要求观至34中任一权利要求所述的系统，其中所述处理单元经配置以用 从所述数据库检索到的标准化因子使所述数量值标准化。
36.根据权利要求观至35中任一权利要求所述的系统，其包含具有一种或一种以上信 号发射剂的卡匣，所述系统经过预先编程，从而允许所述卡匣将所述一种或一种以上信号 发射剂释放到所述载体中，并允许所述一种或一种以上信号发射剂与所述载体中的测试样 品接触。
37.根据权利要求观至35中任一权利要求所述的系统，其包含卡匣阵列，所述卡匣各 自携带信号发射剂，所述系统经过预先编程，从而允许将一种或一种以上信号发射剂从所 述卡匣阵列释放到所述载体中。
38.一种机器可读的程序存储装置，其明确地体现可由所述机器执行的指令程序，以执 行用于测定测试样品中指示可培养的微生物细胞的数目的数量值的方法，所述方法包含(i)使容易携带可培养的微生物细胞的所述测试样品与至少一种能够缔合所述微生 物细胞的膜的信号发射剂接触，所述接触将持续预定的第一时间段(Tl)，所述第一时间段 (Tl)足以使所述信号发射剂内化于所述微生物细胞中，达到使得由所述样品发射的信号基 本上达到平台期的水平；(ii)从所述测试样品中去除未内化的信号发射剂；(iii)在所述第一时间段(Tl)后，于第二时间段(1 期间，且在此期间所述信号基本 上保持在所述平台期，由所述样品内信号发射物体检测和选择发射信号的可培养细胞，所 述检测是基于针对所述可培养细胞而预定的选择参数；和(iv)根据所述所选的信号发射物体，测定所述测试样品中指示可培养细胞的数目的数量值。
39.根据权利要求38所述的程序存储装置，其可由所述机器执行以执行根据权利要求 1至15中任一权利要求所述的方法。
40.一种计算机程序，其包含当所述程序在计算机上运行时执行根据权利要求1至15 中任一权利要求所述的所有步骤的计算机程序代码构件，所述计算机程序是在程序存储装 置中体现。
全文摘要
本发明提供用于测定测试样品中指示例如大肠杆菌(E.Coli)、绿脓杆菌(Ps.Aeroginosa)或微生物细胞混合物等可培养的微生物细胞的数目的数量值(例如总微生物计数)的方法、试剂盒和系统，所述方法包含(i)使容易携带可培养的微生物细胞的所述测试样品与至少一种能够缔合所述微生物细胞的膜的信号发射剂接触，所述接触将持续预定的第一时间段(T1)，所述第一时间段(T1)足以使所述信号发射剂内化于所述微生物细胞中，达到使得由所述样品发射的信号基本上达到平台期的水平；(ii)从所述测试样品中去除未内化的信号发射剂；(iii)在所述第一时间段(T1)后，于第二时间段(T2)期间，且在此期间所述信号基本上保持在所述平台期，由所述样品内信号发射物体检测发射信号的可培养细胞，所述检测是基于针对所述可培养细胞而预定的选择参数；和(iv)根据所述所选的信号发射物体，测定所述测试样品中指示可培养细胞的数目的数量值。所述试剂盒包含一种或一种以上所述信号发射剂及其使用说明。本发明还提供一种机器可读的程序存储装置，其明确地体现可由所述机器执行的指令程序，以便执行所述方法；以及一种计算机程序，其包含用于执行所述方法的计算机程序代码构件。
文档编号G01N33/50GK102089419SQ200980126982
公开日2011年6月8日 申请日期2009年7月9日 优先权日2008年7月10日
发明者埃隆·卡普兰, 弗拉迪米尔·格鲁克曼 申请人:塔康特精确有限公司
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