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专利名称：一种实时定量pcr测量样品中染色体端粒平均长度的绝对值的试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及试剂盒，特别涉及一种实时定量PCR测量样品中染色体端粒平均长度的绝对值的试剂盒及应用。
背景技术：
端粒(Telomere)是一段DNA重复序列，位于染色体末端，可以保持染色体的完整性。1990年，Harley等证实端粒的长度可以随着细胞分裂次数的增多而逐渐变短。这一发现在端�：拖赴�衰老之间建立了紧密的联系。端粒重复序列的长度可能起着一种分子钟(molecular clock)的作用。不同年龄的人的体细胞的寿命明显不同,其端粒的长度也不相 同。是随着年龄的增长而缩短。来自新生儿的体细胞可在体外传代培养80—90代，来自70岁老人的体细胞在体外只能传代培养20 30代，而且端粒的重复序列长度也缩短很多。端粒酶(Telomerase)是细胞中负责端粒延长的一种酶,是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延长缩短的端粒(缩短的端粒其细胞复制能力受限)，从而增强体外细胞的增殖能力。但是，在正常人体细胞中，端粒酶的活性受到相当严密的调控。实验证明，体细胞里没有端粒酶的活性，所以体细胞每分裂一次，端粒也就缩短一些。随着细胞不断地进行分裂，端粒的长度将越来越短，当达到一个临界长度时，细胞染色体会失去稳定性，使细胞不能再进行分裂而进入凋亡(apoptosis)。端粒的长度决定了细胞的寿命，因此可用丢失的端粒重复序列的长度来推测细胞有丝分裂的次数，所以端粒被称为分子钟或有丝分裂钟(mitotic clock)。端粒除了涉及到染色体稳定性,细胞的衰老和死亡外,还与肿瘤的发生密切相关。在人体内的各种细胞中，生殖细胞和干细胞染色体的末端比体细胞染色体的末端长出几千个碱基对，并且在这两类细胞里能检测到端粒酶的活性。除此之外，其他所有体细胞里都未测得端粒酶的活性。惟一的例外是来源于体细胞的恶性肿瘤细胞却又重新出现了端粒酶活性，发挥其合成端粒重复序列的功能，以补偿正常的端粒序列丢失，使端粒的重复序列不会达到导致细胞死亡的临界长度，从而获得细胞的“永生性”(immortality)。这样，恶性肿瘤细胞在体内或体外都能无限制地分裂增殖。上文提到的端粒长度缩短指的是所有染色体末端端粒的平均长度。近年来，很多实验观察开始质疑端粒的平均长度与衰老之间的联系。一些研究小组提出了于端粒相关的细胞衰老是由单一或某几个短端粒引起的观点。这一观点的正确性也被越来越多的实验数据所证明。目前，研究端粒长度主要是应用TRF法(mean length of telomere restrictionfragments)。另外,有一些手段可以比较精确的研究染色体中短端粒的情况，例如基于突光原位杂交(Q-FISH)的技术,或者 STELA (single telomere length analysis)技术等。
发明内容
发明目的
本专利涉及一种实时定量PCR测量样品中染色体端粒平均长度的绝对值试剂盒及其应用。一种用RT-qPCR法测量端粒平均长度绝对值的试剂盒，其特征在于包括盒体，衬垫，PCR 反应液，Taq 酶，136B4 Forward, 36B4 Reverse, Telomere Forward, TelomereReverse，84-mer，36B4片段，衬垫上设有容器空分别放置PCR反应液，Taq酶，136B4Forward, 36B4 Reverse, Telomere Forward, Telomere Reverse,84-mer ;其中所述的36B4 Forward 的核苷酸序列为5’ CAG CAA GTG GGA AGG TGT AAT CC 3’，见 Seq NO 1 ；36B4 Reverse 的核苷酸序列为5’ CCC ATT CTA TCA TCA ACG GGT ACA A 3’，见Seq NO 2 ；Telomere Forward 的核苷酸序列为5’CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTTTGG GTT 3’，见 Seq NO 3 ；Telomere Reverse 的核苷酸序列为5’ GGC TTG CCT TAC CCTTAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT 3’，见 Seq NO :4 ;84_mer 的核苷酸序列为(TTAGGG)14的核苷酸序列为含14个TTAGGG重复序列的核苷酸片段,见Seq NO :5 ;36B4片段的核苷酸序列为5’ CAG CAA GTG GGA AGG TGT AAT CCG TCT CCA CAG ACA AGG CCA GGA CTCGTT TGT ACC CGT TGA TGA TAG AAT GGG 3’，见 Seq NO :6。 所述的PCR反应液含有PCR缓冲液、I X SYBR Green master mix，dNTPS。引物的浓度为lOOnM，84-mer和36B4片段的浓度为lug/uL;
一种用RT-qPCR法测量端粒平均长度绝对值的试剂盒的应用，其特征在于按步骤实
现
A.从人外周血细胞中获取基因组DNA;
B.使用权利要求I所述的试剂盒绘制标准曲线，用来计算RT-qPCR反应中样品端粒的总长度和反应中染色体的总拷贝数标准曲线I使用浓度梯度为lao'io^io'KT4，10_5，10_6的人工合成的84-mer寡核苷酸的RT-qPCR反应的Ct值绘制；标准曲线2使用人工合成的75 bp 36B4片段RT-qPCR反应的CT值绘制，其浓度梯度为1，10—1，10_2，10_3，10_4，1(T5,1(T6 ；
C.使用RT-qPCR扩增步骤A中获得的样品gDNA中的端粒片段和36B4基因片段，获得相应的Ct值，并根据标准曲线计算样品中端粒的总长度和样品中36B4基因的拷贝数。D.计算样品中端粒平均长度绝对值
端粒平均长度=端粒总长度/ 36B4拷贝数；
其中PCR反应条件为
95°C变性 10 min，然后 95°C 15sec，60°C I min，共 40 个循环。具体来说
I.引物设计本专利涉及的PCR引物除了常规的用于扩增端粒片段的引物对，还包括一段84 bp的寡核苷酸片段(84-mer)和一段75 bp的36B4片段。2.绘制标准曲线a)将 84-mer 梯度稀释:1,10—1,10_2,10_3,10_4,10_5,10_6,84-mer寡核苷酸链总长度计算方法如下(假设每个反应需未稀释84-mer 60pg,即60X 1(T12 g,已知 84-mer 的分子量为 26667. 2)
lmol=6. 02 X IO23 个微粒数 平均一个 84-mer 的质量为2. 6667 X IO4 / ( 6. 02 X IO23)= 0. 44 X l(T19g ;
每个PCR反应体系中未稀释84-mer总量为60 X 1(T12 / (0. 44 X 1(T19 )= I. 36 XIO9 个；由于84-mer的长度为84bp，因此每个PCR反应体系中未稀释84-mer总长度为I. 36 XIO9 X 84 = I. 18 X IO5 kb ；
同理可得不同稀释浓度84-mer在每个反应体系中的总长度，绘制标准曲线I。b)绘制75 bp的36B4片 段拷贝数标准曲线
将 75 bp 的 36B4 梯度稀释1，10' 1(T2，1(T3，1(T4，1(T5，1(T6 ；
36B4片断为75 bp，相对分子量为23268. 1，单个36B4 75 bp片段质量为2. 32681 X IO4/ ( 6. 02X IO23) = 0. 38X 10_19 g ；
假设反应体系中最高浓度75 bp的36B4含量为200 pg，那么每个反应体系中75 bp36B4的拷贝数为200 X 1(T12 / 0. 38 X 1(T19 = 5. 26X IO9 ;相当于在二倍体的染色体组中含有5. 26 X 109/2=2. 63 X IO9个36B4基因拷贝。同理可得不同稀释浓度反应体系中75 bp 36B4拷贝数，作标准曲线2。3. RT-qPCR扩增gDNA样品中端�：�36B4基因；
4.RT-QPCR扩增gDNA样品中端�：�36B4基因(内参)，并通过两个标准曲线计算gDNA样品中端粒的总长度及样品中gDNA总拷贝数，即可以计算端粒平均长度端粒平均长度=样品中端粒总长度/ gDNA总拷贝数。原理说明
I、实时荧光定量PCR (RT-qPCR)原理
无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。CT值的定义是扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。定量PCR的数学原理 理想的PCR反应
X=X0 X 2n 非理想的PCR反应
X=X0 (1+Et)n ；n:扩增反应的循环次数X :第n次循环后的产物量X0 :初始模板量Ex :扩增效率
在扩增产物达到阈值线时
Xct=X0 (I+Ex)CT,(I)
其中Xct :为荧光扩增信号达到阈值强度时所扩增产物的量，在阈值线设定以后，它为常数，设定为M ;方程式(I)两边同时取对数得
IogM=IogX0 (1+Ex)CT(2)
整理方程式(2)得
IogX0=-Iog(1+Ex)*CT+logM(3)
IogX0与CT呈线性关系，根据样品扩增的CT值可以计算出样品中的所含的模板量。2,SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是ー种只与DNA双链结合的荧 光染料。当它与DNA双链结合吋，发出荧光JAdna双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在ー个体系内，其信号強度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是I、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性吋，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧減少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。
2、RT-qPCR测量端粒长度原理
如图5所示，緑色区域为端粒区，S卩(TTAGGG) η重复序列；蓝色箭头为与端粒特异性结合的引物。由干与端粒结合的引物数量跟端粒的长度呈正相关，端粒长，其可结合的引物数量多，荧光强度大，可以理解为拷贝数多；反之则拷贝数少，荧光強度弱。所以使用RT-qPCR法，得到各个样品的CT值，即可间接反映每个样品中端粒的平均长度。有益效果
端粒的缩短被认为与细胞的衰老和癌症等疾病的发生密切相关。同时，细胞内每条染色体两端的端粒并不是以相同的速度缩短，有的端粒因为某些原因会突然大幅度变短，形成相对短的端粒。当这些短端粒达到或超过某ー极限，就会导致细胞的衰来死亡，或者如癌症等的疾病。因此，准确地检测细胞端粒长度，对预防衰老和预防癌症的发生都能起到非常大的帮助。本发明采用试剂盒形式可以方便，快捷测定端粒的平均长度的绝对值，适用エ业生产或检测。


图I.标准曲线1，用于计算每个RT-qPCR反应中端粒的总长度，横轴为端粒长度，単位为Kb，PCR反应的Ct值与端粒长度在图I所示的范围内呈线性关系。通过优化样品的浓度，使其PCR反应的CT值落在标准曲线线性范围内，应此使用此标准曲线计算所得数值等于端粒在每个PCR反应中的总长度。图2.标准曲线2，用于计算36B4在每个反应中的拷贝数，间接计算每个反应中染色体的拷贝数，即每个PCR反应中端粒的总拷贝数。横轴为36B4的拷贝数，PCR反应的CT值与36B4拷贝数的LOG值在途中所示范围内呈线性关系。图3.使用RT-qPCR法和TRF法测得的端粒平均长度绝对值的相关性。图4为本发明的示意图，其中盒体1，衬垫2，PCR反应液3，Taq酶4，136B4Forward 5， 36B4 Reverse 6， Telomere Forward 7， Telomere Revers e 9,84-mer 10，36B4片段Io图5. RT-qPCR法检测端粒长度的示意图，其中有圆圈的区域为蓝色，无圆圈区域为绿色。
具体实施例方式RT-QPCR 使用 PCR 反应液购自 Qiagen。实施例I外周血基因组DNA (gDNA)的提取
I).血液样品分装成I mL/管，干-70で储存。2).将样品解冻，每管样品加入O. 8 mL柠檬酸缓冲液，混匀后12000转离心Imin,去上清。 3).加入I mL IX柠檬酸缓冲液，震荡后12000转离心I min，去上清。4).カロ 入 375 uL O. 2M 的 Na2OAc,震荡后加入 25 uL 10% 的 SDS 和 5 uLproteinase K (20 mg/mL H2O),震荡混勻后 55 度孵育 I h。5).加入 120 uL 酚 / 氯仿 / 异戊醇(v/v :25/24/1),震荡 30 sec 后于 12000 转离心2 min。6).将水相层移至新的I. 5 mL离心管仲，加入I mL，冷的100%こ醇，混匀并于-20度孵育15 min。7). 12000转离心2 min，去上清并烘干。8).加入180 uL 10 1的TE缓冲液，震荡后于55で孵育10 min。9).加入20 uL，2M的醋酸钠溶液，混匀后加入500 uL，冷的100%こ醇，混匀后于12000转离心I min,去上清。10).用I mL，80%的こ醇洗涤沉淀，之后于12000转离心I min，去上清。11).真空干燥沉淀10 min。12).将沉淀重新溶解于200 uL TE缓冲液中，55 °C孵育过夜，获得gDNA。实施例2 RT-QPCR法测端粒平均长度的绝对值
I、ー种用RT-qPCR法测量端粒平均长度绝对值的试剂盒，包括盒体1，衬垫2，PCR反应液3，Taq 酶 4, 136B4 Forward 5, 36B4 Reverse 6, Telomere Forward 7, TelomereRevers e 9,84-mer 10，36B4片段11，衬垫2上设有容器空腔分别放置PCR反应液3，Taq酶 4, 136B4 Forward 5, 36B4 Reverse 6, Telomere Forward 7, Telomere Reverse 8,84-mer 10，36B4 片段 11 ；
其中所述的 36B4 Forward 的核苷酸序列为5’ CAG CAA GTG GGA AGG TGT AAT CC
3，；
36B4 Reverse 的核苷酸序列为5’ CCC ATT CTA TCA TCA ACG GGT ACA A 3’ ；Telomere Forward 的核苷酸序列为:5，CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGGGTT TGG GTT 3’ ；
Telomere Reverse 的核苷酸序列为5，GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TACCCT TAC CCT 3，；
84-mer的核苷酸序列为(TTAGGG) 14的核苷酸序列为含14个TTAGGG重复序列的核苷酸片段；
36B4片段的核苷酸序列为5’ CAG CM GTG GGA AGG TGT AAT CCG TCT CCA CAG ACAAGG CCA GGA CTC GTT TGT ACC CGT TGA TGA TAG AAT GGG 3’。2、利用84-mer绘制总长度标准曲线1)>84-mer的RT-qPCR反应条件RT_qPCR反应体系为20 uL，以84-mer为模板，取84-mer I uL, 100 nM 引物 Telomere Forward I uL, 100 nM引物Telomere ReverseluL,余量为 PCR 反应液。RT-qPCR 反应条件95°C 10 min, 40 个循环(95°C 15 sec, 60 °C I min)
2)、绘制标准曲线
A)将 84-mer 梯度稀释1，10ィ，1(Γ2，1(Γ3，1θΛ 1(Γ5，10'84-mer寡核苷酸链总长度计算方法如下
假设姆个反应需未稀释84-mer 60pg,即60X 1(T12 g,已知84-mer的相对分子量为26667. 2 ；
平均ー个 84-mer 的质量为2.6667 X IO4 / 6. 02 X IO23 = O. 44 X 1(Γ19 ;
每个PCR反应体系中未稀释84-mer总量为60 X 1(Γ12 / O. 44 X 1(Γ19 = I. 36X 109，因此每个PCR反应体系中未稀释84-mer总长度为1.36 X IO9X 84= I. 18 X105kb ；
同理可得不同稀释浓度84-mer在每个反应体系中的总长度，绘制标准曲线I (图1)，标准曲线方程为log (TL) =-4. 86CT+40. 14，其中TL为总长度。3、利用36B4绘制标准曲线
O 36B4 75 bp的RT-qPCR反应条件RT-qPCR反应体系为20 uL，以36B4为模板，取 36B4 IuL , 100 nM 36B4 Forward IuL, 100 nM 36B4 Reverse luL，余量为 PCR 反应液。RT-qPCR 反应条件95 °C 10 min, 40 个循环(95°C 15 sec, 60 °C I min)
将 75 bp 的 36B4 梯度稀释1，ΚΓ1，1(Γ2，1(Γ3，1θΛ 1(Γ5，1(Γ6 ；
36Β4为75 bp，相对分子量为23268. I ；
平均ー个 36B4 75 bp 质量为 2. 32681 X IO4 / 6. 02 X IO23 = 0. 38 X 1(T19 g ；
假设反应体系中最高浓度75 bp 36B4含量为200 pg，那么每个反应体系中75 bp 36B4的拷贝数为:200 X 10ィ2 / 0. 38 X 10ィ9 /2= 2. 63 X IO9 ；
同理可得不同稀释浓度反应体系中75 bp 36B4拷贝数，作标准曲线2 (图2)。标准曲线方程为log (TC) =-5. llCT+39. 57 ，其中TC为36B4基因的拷贝数。因为36B4基因是单拷贝基因，是做RT-qPCR常用的内參基因之一，所以知道了 gDNA中36B4的拷贝数就等于知道了样品中染色体的拷贝数，才可以计算端粒平均长度的绝对值。4、RT-qPCR扩增gDNA样品中端�：�75 bp的36B4 (内參)
实施例I所获得gDNA样品中端粒的RT-qPCR反应条件RT_qPCR反应体系为20 uL，gDNA I uL, 100 nM Telomere Forward I uL, 100 nM Telomere Reverse I uL (这里的引物跟84mer的引物是ー样的)，余量为PCR反应液；PCR反应条件为95°C 10 min, 40个循环(95で 15 sec, 600C I min)。步骤gDNA样品中75 bp的36B4的RT-qPCR反应条件RT-qPCR反应体系为20 uL，其中36B4 I uL ,100 nM 引物36B4 Forward I uL，100 nM 引物36B4 Reverse I uL，余量为PCR反应液。RT-qPCR反应条件95°C 10 min, 40个循环(95°C 15 sec,60°C I min)。将步骤(4)获得的gDNA样品中端�：�36B4的Ct值，分别代入两个标准曲线方程， 即 log (TL) = (CT (telomere)-40. 14) / -4. 86，其中 TL 为样品中端粒总长度；L0G (TC) = (CT(36b4)-39. 57) / -5. 11，其中TC为样品中端粒拷贝数，即可以计算端粒平均长度=端粒总长度/端�？奖词�。
因为84mer是(TTAGGG)14，相当于人工合成的端粒重复序列，与细胞中的端粒序列并无区别，所以用人工合成的端粒序列做标准曲线是可以用于计算样品中真正的端粒的长度的；同理人工合成的36B4片段也可用于计算样品中的36B4拷贝数。另外，计算平均长度的公式只是ー个简单的数学计算，比如一辆汽车行驶的日平均里程=总的行驶里程/天数，这样的公式是不用详细推导的，同理，样品中端粒的平均长度、端粒的总长度和端粒的拷贝数(即染色体拷贝数)之间的关系也是显而易见的，无需推导。对比例TRF法测端粒的平均长度(參考Aubert等，Telomere lengthmeasurement—しaveats ana a critical assessment of tne available technologiesand tools. Mutat Res. 2012 Feb I; 730 (1-2) : 59-67.)
1).将0.5ug gDNA样品用Hae III (购自NEB)酶完全消化； 2).消化后的gDNA片段由琼脂糖凝胶电泳分离，然后转移至尼龙膜上；
3).使用放射性32P标记的探针32P-(TTAGGG) 7与尼龙膜上的端粒片段杂交；
4).通过放射自显影检测各个样品端粒片段的长度。将TRF法测得的端粒长度取对数，然后将其与RT-qPCR法测得的样品端粒平均长度绝对值做图，可得如图3所示，各数据点的趋势线为一条直线，显示本专利涉及的RT-qPCR法所测得的端粒平均长度绝对值与经典的TRF法所测得的结果有很强的相关性，是可信赖的結果。
权利要求
1.一种用RT-qPCR法测量端粒平均长度绝对值的试剂盒，其特征在于包括盒体，衬垫，PCR 反应液，Taq 酶，136B4 Forward, 36B4 Reverse, Telomere Forward, TelomereReverse，84-mer，36B4片段，衬垫上设有容器空分别放置PCR反应液，Taq酶，136B4Forward, 36B4 Reverse, Telomere Forward, Telomere Reverse,84—mer ; 其中所述的36B4 Forward的核苷酸序列为Seq NO :1 ; 36B4 Reverse的核昔酸序列为Seq NO 2 ； Telomere Forward的核昔酸序列为见Seq NO 3 ； Telomere Reverse 的核昔酸序列为 Seq NO -A ； 84-mer的核苷酸序列为Seq NO 5 ； 36B4片段的核苷酸序列为见Seq NO :6。
2.根据权利要求I所述的一种用RT-qPCR法测量端粒平均长度绝对值的试剂盒，其特征在于所述的PCR反应液含有PCR缓冲液、I X SYBR Green master mix, dNTPs。
3.一种用RT-qPCR法测量端粒平均长度绝对值的试剂盒的应用，其特征在于按步骤实现 从人外周血细胞中获取基因组DNA ； 使用权利要求I所述的试剂盒绘制标准曲线，用来计算RT-qPCR反应中样品端粒的总长度和反应中染色体的总拷贝数标准曲线I使用浓度梯度为LIO'IO^IO'IO^KT5，10_6的人工合成的84-mer寡核苷酸作为模板，RT-qPCR反应的Ct值绘制；标准曲线2使用人工合成的36B4片段作为模板，RT-qPCR反应的CT值绘制，其浓度梯度为1，10—1，10_2，10_3，10_4，10_5，10_6 ;使用RT-qPCR扩增步骤A中获得的样品gDNA中的端粒片段和36B4基因片段，获得相应的Ct值，并根据标准曲线计算样品中端粒的总长度和样品中36B4基因的拷贝数；计算样品中端粒平均长度绝对值端粒平均长度=端粒总长度/ 36B4拷贝数；其中PCR反应条件为95°C变性10 min，然后95°C 15sec，60°C I min，共40个循环。
全文摘要
本发明涉及试剂盒，特别涉及一种实时定量PCR测量样品中染色体端粒平均长度的绝对值的试剂盒及应用；一种用RT-qPCR法测量端粒平均长度绝对值的试剂盒，其特征在于包括盒体，衬垫，PCR反应液，Taq酶，136B4Forward，36B4Reverse，TelomereForward，TelomereReverse，84-mer，36B4片段，衬垫上设有容器空分别放置PCR反应液，Taq酶，136B4Forward，36B4Reverse，TelomereForward，TelomereReverse，84-mer；端粒的缩短被认为与细胞的衰老和癌症等疾病的发生密切相关。同时，细胞内每条染色体两端的端粒并不是以相同的速度缩短，有的端粒因为某些原因会突然大幅度变短，形成相对短的端粒。当这些短端粒达到或超过某一极限，就会导致细胞的衰来死亡，或者如癌症等的疾病。因此，准确地检测细胞端粒长度，对预防衰老和预防癌症的发生都能起到非常大的帮助。本发明采用试剂盒可以方便，快捷测定端粒的平均长度的绝对值，使用工业生产或检测。
文档编号G01N21/64GK102660650SQ20121016516
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月25日 优先权日2012年5月25日
发明者全利, 叶亚东, 叶汝章, 张娟, 朱兆云, 朱文华, 滕凌, 潘鹂, 胡娟, 路易斯伊格纳罗, 郝小江 申请人:云南路易斯中药现代化工程技术研究中心