专利名称：改进的糖基化测定、糖分析阵列和测定系统的制作方法
技术领域：
本申请涉及改进的糖基化测定(分析)。
背景技术：
寡糖和多糖是由单糖(糖)单元通过糖苷键互相连接而组成的聚合物。这些聚合物具有可根据单糖亚单元的线性序列进行描述的结构，其称为多糖的二维结构。也可根据由它们的组分单糖亚单元在三个维度形成的结构来描述多糖。与DNA或蛋白的链一样，糖链具有两个不同的末端。在糖链的情况下，这些是还原性末端(相当于线性糖分子的醛基)和非还原性末端。然而，与蛋白和DNA不同，多糖一般
被支化，其中基本上多糖中的每个糖单元均可作为可选的支化点。存在许多结合于糖的蛋白。许多这些蛋白特异性地结合于特定短单糖序列或二糖序列。凝集素是与糖结合的蛋白的一大家族。已表征了许多植物凝集素并在研究中使用。也表征了许多哺乳动物凝集素。抗体是特异性识别特定分子结构的蛋白。与凝集素一样，抗体也可识别糖结构。糖苷酶是能够切割糖链中糖苷键的酶。糖苷酶也可特异性识别特定寡糖序列。糖基转移酶是将糖单元转移至受体分子的酶。在体内，这些受体分子是增长的聚糖结构。多糖的结构测定对糖生物学的发展非常重要。糖生物学的研究涉及包括细菌细胞壁、血液聚糖的对象，涉及与病毒性疾病如HIV感染，自身免疫病如胰岛素依赖型糖尿病和类风湿性关节炎，以及如在癌症中发生的异常细胞生长有关的生长因子和细胞表面受体结构。青霉素的发现强调了糖分子的重要性，青霉素是细菌细胞壁糖分子合成的抑制齐U，并且可能是迄今为止所发现的最成功的抗生素。另一个实例是肝素的医学应用，肝素是能抑制血液凝固的粘多糖，并且目前广泛用于医药中。医学上重要的糖分子的另外的实例包括粘多糖(GAG)、硫酸乙酰肝素、单克隆抗体、细胞因子(例如，IL-8、TNF、和最成功的ΕΡ0)、趋化因子(例如酸性成纤维细胞生长因子)和不同的生长因子。上述细胞因子、趋化因子和生长因子也能够结合于GAG和其它多糖，因此也可以被认为是凝集素。多糖的结构复杂性阻碍它们的分析。例如，认为糖类通过非模板依赖性机理进行合成。在缺少结构信息的情况下，研究人员因此必须假设构建单元选自目前已知的任意糖单元。此外，这些单元可能在合成过程中例如通过加入硫酸酯基团而被修饰。在没有测量该碳水化合物结构信息的能力的情况下，研究人员无法确定细胞群体例如组织中真实的、正确的糖基化模式。此外，这些单元可能在合成过程中例如通过加入硫酸酯基团而被修饰，使得仅仅了解添加了哪些类型的糖并不能提供全貌。此外,糖单元间的连接是多样的。如果所连接的糖单元是己糖，则该糖可以连接至Cl、C2、C3、C4或C6原子中的任一个。而且，与Cl原子的连接可能为α构型或β构型。此外，许多糖之间的结构上的差异是微小的，因为糖单元可能仅仅通过羟基的位置区别于另一个(差向异构体)。在体内，糖基化是组织依赖性的，并可以随着细胞状态而显著变化。在体外，糖基化强烈地取决于生长条件细胞类型，养分浓度，PH，细胞密度和年龄可以影响糖蛋白的糖基化模式。糖型的数量及其在细胞内的相对丰度受到单个蛋白的固有结构性质以及可用的糖基化酶的全部性质(包括其类型、浓度、动力学特征、区室化)的影响。已显示该全部性质在细胞状态改变时发生变化(例如，致癌性转化)。
实用新型内容本申请提供了改进的糖基化测定。该改进的测定能够提供更准确的结果。这些改进的实例包括但不限于对测定系统的测定优化改进；涉及阵列改进的K指纹阵列格式；与检测系统的改进有关的QC监测和校正；阵列和系统的测定外标志(out of assay flag)的 实施。根据至少一些实施方式，提供了糖分析阵列，包括平面基板和存在于所述基板的表面上多个预定位置的多种糖结合剂，所述多种糖结合剂中的每一种存在于所述表面上的多个独立的预定位置，其中所述多个独立的预定位置涉及所述位置的所述糖结合剂在浓度曲线中的多个浓度；所述平面基板适于接触包括糖蛋白的样品，使得所述糖蛋白与至少一种糖结合剂特异性结合并形成可检测的结合复合物，以便根据所述浓度曲线来确定非特异性结合的基线。根据至少一些实施方式，提供了一种糖分析阵列，其特征在于，包括平面基板；和多个接触部，所述多个接触部存在于所述平面基板的表面上的多个预定位置处，在所述多个接触部中设置有多种糖结合剂，所述多种糖结合剂设置在所述平面基板的预定位置中；所述多种糖结合剂中的每一种存在于所述表面上的多个独立的预定位置，其中所述多个独立的预定位置设置有在浓度曲线中的多个浓度的所述糖结合剂；所述平面基板被设置成与包括糖蛋白的样品接触，使得所述糖蛋白在所述多个接触部处与至少一种糖结合剂特异性结合并形成可检测的结合复合物，以便根据所述浓度曲线确定用于非特异性结合的基线。可选地，所述接触部选自圆形、椭圆形、方形的凹槽、凹陷或孔。可选地，可通过结合信号对所述可检测的结合复合物进行检测，并且其中在所述浓度曲线中，所述结合信号在糖结合剂浓度总数的至少五个中是线性的。可选地，所述平面基板具有凹陷或孔。可选地，所述平面基板包括膜、玻璃或塑料中的至少一种。可选地，所述平面基板为衍生化的。可选地，所述阵列进一步包括在所述平面基板上的多个标记的预定位置，以提供高信号来支持所述阵列在与所述样品接触后的图像分析。可选地，所述阵列进一步包括多种糖结合剂，在所述平面基板的预定位置中作为校正标准。可选地，所述平面基板被分为多个衬垫，并且其中每一个衬垫包括独立的多个校正标准。可选地,所述糖结合剂包括凝集素或抗体,或其修饰的成分或组合。可选地，所述基板上的每种凝集素的浓度范围为O. 01mg/ml至10mg/ml。可选地，所述浓度范围为O. 001mg/ml至10mg/ml。可选地，所述浓度范围为0. 01mg/ml至5mg/ml。可选地，每个位置具有斑点尺寸直径，并且其中所述斑点尺寸直径在0. 05mm至75mm的范围内。可选地，每个位置具有斑点尺寸直径，并且其中所述斑点尺寸直径在80微米至2500微米的范围内。可选地，所述糖蛋白包括IgG抗体或片段。可选地，每个位置所述IgG的量在I. 8-12 μ g的范围内。可选地，在用于将所述IgG抗体或片段与所述糖结合剂接触的溶液中，所述IgG浓度在O. 001微摩尔至100微摩尔的范围内。可选地，所述溶液包括去污剂，以展开所述IgG抗体或片段并暴露至少一种聚糖。根据本申请的至少一些实施方式，提供了用如本文所述的多个阵列进行糖基化测 定的测定系统，其包括用于进行所述糖基化测定的试剂盒，通过结合信号来检测所述可检测的结合复合物以获得结合数据的检测器，以及测定优化�？椋溆糜诒冉喜慰际莺痛友诽堑鞍谆竦玫乃鼋岷鲜荩酝ü扑阕罴涯鼗钚裕饬拷鲇胙诽堑鞍撞藕诺哪兀约巴ü牖谑褂么罅垦防嘈痛唇ǖ氖笛槿范ǖ氖菘饫炊ㄒ宓募扑愕幕呦啾冉隙扑阍夭Ｆ尘爸担慈范ê鲜实牟舛ㄌ跫�。根据本申请的至少一些实施方式，提供了一种用于进行糖基化测定的测定系统其特征在于，包括-多个阵列，-测定执行模块，所述多个阵列连接至所述测定执行模块(104)，或容纳在所述测定执行1吴块中；-检测器，连接至所述测定执行模块，通过所述检测器检测所述糖结合剂与样品蛋白的结合；-测定数据分析仪，与所述检测器通信或连接至所述检测器；-测定外标志模块；连接至所述测定数据分析仪或者与所述测定数据分析仪通信；以及-测定优化模块，连接至所述测定数据分析仪或者与所述测定数据分析仪通信；其中，所述多个阵列中的每一个包括_平面基板；和-多个接触部，所述多个接触部存在于所述平面基板的表面上的多个预定位置处，在所述多个接触部中设置有多种糖结合剂，所述多种糖结合剂设置在所述平面基板的预定位置中；所述多种糖结合剂中的每一种存在于所述表面上的多个独立的预定位置，其中所述多个独立的预定位置设置有在浓度曲线中的多个浓度的所述糖结合剂；所述平面基板被设置成与包括糖蛋白的样品接触，使得所述糖蛋白在所述多个接触部处与至少一种糖结合剂特异性结合并形成可检测的结合复合物，以便根据所述浓度曲线确定用于非特异性结合的基线。可选地，所述接触部选自圆形、椭圆形、方形的凹槽、凹陷或孔。可选地，所述阵列插入或提供至所述测定执行�？椋裳〉赜糜诓舛ㄓ呕鲆淮�。可选地，所述检测器与所述测定执行模块组合或与所述测定执行�？榉挚�。可选地，所述检测器与所述测定数据分析仪组合或与所述测定数据分析仪分开。可选地，所述测定优化�？榘ㄊ菘猓鍪菘獍敫行巳さ牡鞍自诓煌笛樘跫虏舛ǖ慕岷嫌泄氐氖�。可选地，所述测定优化�？榻邮瞻渌囟ɡ嘈偷鞍椎挠呕笛榻峁奈募�。可选地，所述测定优化�？楦菀韵虏问械囊桓龌蚨喔鼋徊饺范ê鲜实牟舛ㄌ跫糜谖掠返鞍缀吞墙岷霞恋慕岷鲜奔�、温度和缓冲液的PH值；糖结合剂信号、信号比、当暴露为非最佳时发生反应的一组指定的糖结合剂、背景值以及与校正标准背景相比较的背景值；样品缓冲液中的去污剂浓度；以及样品蛋白浓度。可选地，所述测定优化�？槎匝诽堑鞍着ǘ�、基板格式和测定格式进行优化。可选地，所述样品糖蛋白包括IgG抗体，并且其中所述测定优化�？槿范↖gG样品抗体是否具有Fab糖基化或O-连接糖基化，以便实施特异优化条件，以及发出有关这样的糖基化存在的警告。可选地，所述测定优化�？槿范ㄊ┘佑谒鲅诽堑鞍椎谋┞度芤旱牧浚渲兴� 述暴露溶液具有用于展开蛋白的本领域中已知百分比的去污剂，其选自由胆酸盐、脱氧胆酸盐、C16TAB、LysoPC, CHAPS、两性表面活性剂(兼性离子洗涤剂，Zwittergent)、辛基糖苷、洋地黄皂苷、芦布若尔、C12E8、曲拉通X-100 (Triton X-100)、诺乃P-40SDS (十二烷基硫酸钠)、和吐温-80组成的组。可选地，所述测定优化模块确定涉及以下中的一个或多个的条件矩阵最优化暴露溶液浓度0. 001至1%，最优化温度50-80°C，预处理温育的最优化时间1分钟至I小时。可选地，该系统进一步包括至少一个QC (质量控制)监测，其选自由通过前景均一性、背景均一性、平均中位密度间的相似性、饱和水平进行的斑点评估；根据阵列背景、对照斑点、阵列内重现性对整个平面基板的质量进行评估的阵列验证；样品和校正位置之间归一化的评估；整个阵列信号的测定组成的组。可选地，该系统进一步包括作为校正样品而施加于多个包含所述糖结合剂的预定位置的校正蛋白，以根据黄金指纹标准，通过所述测定优化�？槔葱Ｕ墙岷霞恋姆从π�。可选地，所述测定优化�？榭筛菟鲅诽堑鞍子胨鲂Ｕ返慕岷闲藕诺谋冉侠慈范ú舛ㄍ獗曛�。可选地，所述测定优化�？楦菟霾舛ㄍ獗曛痉⒊鼍妗３橇碛泄娑ǎ舜κ褂玫乃屑际鹾涂蒲跤锞哂杏氡旧昵胨袅煊虻钠胀际跞嗽蓖ǔＫ斫庀嗤暮�。虽然可在本申请的实施或测试中使用与本文所述的相似或等同的方法和材料，但下面描述合适的方法和材料。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容均以引用方式并入本文中。这些包括但不限于WO00/68688 和 W001/84147(US20060194269, US20070092915, US7056678 和 US7132251)， WO02/37106 (US20040132131)，和 WO 02/44714 (US7079955 和 US20040153252)。在冲突的情况下，以本说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，并不旨在是限制性的。
此处仅通过举例的方式，参考附图对本申请进行描述。在现在对图的详细内容进行具体参考的情况下，强调以实施例的方式显示详细内容并且仅用于对本申请的优选实施例进行描述性讨论，并且是为了提供认为最有用的和最容易理解本申请的原理和概念方面的描述而提出的。在这方面，与基本理解本申请所必需的细节相比，未试图更加详细地显示本申请的结构细节，图所附的描述使得如何使本申请的几种形式在实践中体现对本领域技术人员是显而易见的。在图中图I示出了根据本申请的至少一些实施方式的示例性阵列；图2示出了根据本申请的至少一些实施方式的示例性系统；图3涉及用于根据本申请的至少一些实施方式的示例性凝集素的示例性印刷浓度；图4示出了用于图2的系统操作的示例性QC和校正过程，以及图5示出了测试优化实验布局、样品和阵列类型与不同的测试样品暴露条件结合的结果，其实验是使用示例性的IgG抗体，阿瓦斯汀，通过上述系统针对一个阵列类型(一个衬垫载玻片或多个衬垫载玻片)进行测试的。
具体实施方式
本申请是改进的糖基化测定。根据本申请的优选实施方式，可能可选地且优选地根据与本申请共有的美国专利号7，056，678进行这样的测定，此处以参考方式并入本文，如同在本文中完全阐述一样。例如，该专利描述了用于糖的结构分析的方法，包括在表面上设置多个必需的序列特异性和/或位点特异性结合剂，使表面与待分析的糖的混合物接触，例如来自细胞或组织的特定区室的糖分子的提取物；洗涤或以其他方式去除未结合的糖或糖片段；将之前获得的必需序列特异性和/或位点特异性标志物，或必需序列特异性和/或位点特异性标志物的混合物添加到表面上；获得结合于表面的标志物的一个或多个图像；以及衍生(导出)与通过图像分析的糖的鉴定有关的信息。在一个方面，本申请提供了一种糖分析阵列102，其特征在于，包括平面基板I ;和多个接触部10，所述多个接触部存在于所述平面基板I的表面上的多个预定位置处，在所述多个接触部10中设置有多种糖结合剂，所述多种糖结合剂作为在所述平面基板I的预定位置中的分析样品上的聚糖结构的检测器；所述多种糖结合剂中的每一种存在于所述表面上的多个独立的预定位置10，其中所述多个独立的预定位置10设置有在浓度曲线中的多个浓度的所述糖结合剂；所述平面基板I被设置成与包括糖蛋白的样品接触，使得所述糖蛋白在所述多个接触部10处与至少一种糖结合剂特异性结合并形成可检测的结合复合物，以便根据所述浓度曲线确定用于非特异性结合的基线。在另一方面，提供了一种用于进行糖基化测定的测定系统100，其特征在于，包括-多个阵列102，所述多个阵列102中的每一个包括平面基板I;和多个接触部10，所述多个接触部10存在于所述平面基板I的表面上的多个预定位置处，在所述多个接触部10中设置有多种糖结合剂，所述多种糖结合剂设置在所述平面基板I的预定位置中；所述多种糖结合剂中的每一种存在于所述表面上的多个独立的预定位置10，其中所述多个独立的预定位置10设置有在浓度曲线中的多个浓度的所述糖结合剂；所述平面基板I被设置成与包括糖蛋白的样品接触，使得所述糖蛋白在所述多个接触部10处与至少一种糖结合剂特异性结合并形成可检测的结合复合物，以便根据所述浓度曲线确定用于非特异性结合的基线；-测定执行�？�104，所述多个阵列102连接至所述测定执行�？�104，或容纳在所述测定执彳丁I旲块104中；-检测器105，连接至所述测定执行�？�104，通过所述检测器105检测所述糖结合剂与样品蛋白的结合；-测定数据分析仪106，与所述检测器105通信或连接至所述检测器105；-测定外标志�？�107;连接至所述测定数据分析仪106或者与所述测定数据分析仪106通信；以及-测定优化�？�108，连接至所述测定数据分析仪106或者与所述测定数据分析仪 106通信。可选地，所述接触部10选自圆形、椭圆形、方形的凹槽、凹陷或孔。可选地，所述阵列102插入或提供至所述测定执行�？�104。 可选地，所述检测器105与所述测定执行�？�104组合或与所述测定执行�？�104分开。可选地，所述检测器105与所述测定数据分析仪106组合或与其分开。可选地，所述测定优化�？�108包括数据库，所述数据库包含与感兴趣的蛋白在不同实验条件下测定的结合有关的数据。可选地，所述测定优化�？�108接收包含其它特定类型蛋白的优化实验结果的文件。其上设置有结合剂的表面可以包括，例如珠或阵列，或多孔板(例如96孔板)，但优选包括平面基板。平面基板(优选具有凹陷或孔)上的阵列可选地可以包括膜、玻璃或塑料表面等中的任一种。可选地可以通过获得标志物的图像并生成待分析的多糖的识别位点图来检测糖结合标志物的结合，以衍生(导出)样品结构上的部分结构分布，从而衍生涉及多糖的至少部分序列信息。标志物可选地可以包括色原结合剂，使得通过结合剂与例如复合物的结合来提供图像，所述图像是在基板表面显像的颜色。可替换地，标志物可能是标记的结合剂，使得根据来自标记的信号提供标志物的图像。可通过例如使用滤光器、激光扫描仪或通过摄影和/或数字化图像来获得图像。用于测定样品例如细胞或人类IgG的糖基化模式或“指纹”的另外的方法和测定还披露在美国专利申请号20050186645中，其也与本申请共有，将其以参考方式并入本文，如同在本文中完全阐述一样。该申请描述了一种通过将糖分子添加到连接有一种或多种糖结合剂(此处还称作第一糖结合剂)的基板上来获得关于糖分子的碳水化合物含量信息的方法。鉴定了与糖分子结合的第一糖结合剂，并且所得的结合信息用于生产糖分子的指纹。本申请的必需序列特异性和/或位点特异性结合剂可以包括，例如凝集素(例如有色凝集素、荧光凝集素、生物素标记的凝集素)或抗体(例如，荧光抗体、生物素标记的抗体、或酶标记的抗体)。可使用至少五个凝集素实施方法或测定，例如，5、IO、15、20、25、30、
35、40、45或50个凝集素，虽然可以可选地使用任意数量的凝集素，例如约5个凝集素至约100个或更多的凝集素。例如，可以可选地使用以4-8组重复(或任意其他合适的重复组)印在膜涂覆的载玻片上的一组20-30个凝集素实施该方法，或者可替换地在能够提供每个印刷的凝集素的剂量应答的浓度范围内。将完整糖蛋白的样品应用于阵列，并通过使用任意荧光团直接标记或通过使用针对蛋白部分-例如抗体，或碳水化合物部分-凝集素的荧光团标记的探针来检测其结合模式。所得的指纹是高度特有的样品的糖基化模式。每个都具有其特异识别模式的大量的凝集素，可确保指纹对糖基化模式的变化的高灵敏性。可以使用许多荧光标记，如FITC、罗丹明、Cy3、Cy5、或任意Alexa染料。此处将这些荧光标记和染料标记统称为“色原标记”。此外，可使用本领域中已知的生物素-亲和素系统和/或使用任意其它合适的标记类型进行标记。在如上述进行分析之前，可以可选地对糖分子进行修饰。本申请的方法和测定可以可选地在整个细胞中进行。可替换地，方法和测定可在细胞制品中进行(非完整细胞材料)，例如膜蛋白提取物、细胞匀浆、或粗制膜混合物。在包括使用完整细胞的实施方式中，优选首先对细胞进行固定。例如，通过添加在索伦森氏缓冲液(Sorenson’s buffer),pH 为 7. 3 (Tousimis Research Corp. ,Rockville,Md)中的I %戊二醛的溶液，在24-48小时后用索伦森氏缓冲液洗涤，细胞可固定在RPMI培养基的悬浮液中，(如例如描述在Sanders et al,A high-yield technique for pr印aringcells fixed in suspension for scanning electron microscopy,The Journal of CellBiology, Volume 67，1975，pages 476480 中)。可替换地，可通过在环境温度下将细胞浸入PBS/3. 7%甲醛中60分钟对细胞进行固定，随后用蒸懼水洗搽细胞(如例如描述在Nimrichter et al, Intact cell adhesionto glycan microarrays, Glycobiology, vol. 14，no. 2 ；pp. 197-203，2004 中)。当然，可以可选地进行任何类型的细胞固定过程，以允许检测糖结合剂与细胞的
彡口口 本申请的方法可以可选地并优选地在体外进行。本申请的方法和测定可以可选地并优选地使用Qproteome Glycoprofiling试剂盒(Qiagen,美国)或任意GlycoScope型试剂盒实施。使用了精心挑选的大量数据集、已表征的糖蛋白、和一大组酶合成的这些蛋白的糖变异体，通过分析超过80个凝集素的组对在这样的试剂盒中使用的凝集素进行选择。在可能的情况下，根据单糖特异性对阵列上的凝集素进行分组；表示为“复合物”的组中的凝集素不与单糖结合，但可与复杂N-连接聚糖结合。下面详细描述各组和每组内凝集素间的差异。复合物该组中的凝集素可识别位于复杂N-连接复合聚糖的三甘露糖基核心的两个α -甘露糖残基中任一个的分支。由于该组中某些凝集素结合聚糖结构的大部分，因此它们对不同的天线末端是敏感的。表示为复合物(I)和复合物(4)的凝集素倾向于2，6_支化结构；凝集素复合物(3)倾向于2，4_支化结构，而凝集素复合物(2)以相似亲和力识别两种结构。GlcNAc该组中的凝集素与N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)结合，并且其β 4_连接的寡聚物具有随后者的链长增加而增加的亲和力。该组中两种凝集素的碳水化合物特异性不存在差异，但观察到其结合模式中的差异，并且可能源于样品的非碳水化合物部分。Gl c/Man该凝集素组是甘露糖结合凝集素的子组(参见下面)，并且由于它们除了与甘露糖结合以外还与葡萄糖结合，因此表示为Glc/Man结合凝集素。该组中的所有凝集素与双天线复合N-连接聚糖以高亲和力结合。将其对双天线结构的亲和力进行比较，凝集素Glc/Man(I)和(2)以较低的亲和力结合于高甘露糖聚糖，而凝集素Glc/Man(3)将以较高的亲和力结合于高甘露糖聚糖。甘露糖该组由特异性结合于甘露糖的凝集素组成。这些凝集素可以以较低的亲和力结合于高甘露糖结构，并且可识别双天线复合结构的核心甘露糖。末端GlcNAc该凝集素特异性地识别末端GIcNAc残基。a -Gal这些凝集素结合于末端α -半乳糖(a -Gal)。凝集素a -Gal (I)可与α -半乳糖和a -GalNAc ( α -N-乙酰半乳糖胺)两者结合，并且可结合于N和O-连接聚糖。凝集素a-Gal (3)主要与以N-连接天线为基础的Galili抗原(Galal_3Gal)结合。β -Gal这些凝集素特异性结合于末端(非唾液酸化的)β -半乳糖残基。Gal/GalNAc这些凝集素对末端半乳糖和N-乙酰半乳糖胺残基是特异性的。该组内的不同凝集素对于半乳糖和N-乙酰半乳糖胺的相对亲和力有所不同。来自该组的凝集素(2)和(5)几乎专门地与Gal结合；凝集素⑴、(3)和(4)几乎专门地与GalNAc结合。组中的其余凝集素对GalNAc/Gal的相对亲和力顺序为(8) >
(7)> (6)。岩藻糖来自该组的凝集素以各种连接与岩藻糖残基结合。凝集素岩藻糖(6)优先与1-2连接的岩藻糖结合；凝集素岩藻糖(8)优先与1-3和1-6连接的岩藻糖结合；凝集素岩藻糖(12)和(13)优先与Fucl-4G1CNAC结合(路易斯A抗原)。由于空间位阻，这些凝集素通常不与完整糖蛋白上的N-连接寡糖的核心岩藻糖
彡口口 唾液酸唾液酸凝集素与带电荷的唾液酸残基反应。也观察到该组的成员对其它酸性基团(如硫酸盐化)具有中级特异性。凝集素唾液酸(I)主要识别2-3连接的唾液酸；凝集素唾液酸(4)主要识别2-6连接的唾液酸。应当理解，仅以讨论为目的提供这些用于检测糖基化的方法和测定的实例，并且不用于以任何方式限制本申请，可在本申请中可选地使用任何其它合适的方法和/或测定。参照附图和所附描述及以下实施例可以更好地理解本申请的原理和操作。[0112]实施例I对测定系统的测定优化改进该实施例涉及对测定系统的测定优化改进。该测定系统通�？捎糜诓舛ㄓ糜谛矶嗖煌嘈偷鞍椎奶腔�。然而，发现了针对一种类型蛋白的该系统的特异性改进，其优选涉及抗体，并且优选人类IgG抗体。已惊人地发现这些蛋白的糖分析需要暴露隐藏在蛋白结构中的聚糖，而这可通过特异性改进的糖分析系统实现。系统限定了最佳暴露条件，并带领使用者通过优化过程，包括测定参数和分析参数。系统调节阵列以及使用调节的阵列进行检测的相关阵列条件，并且包括样品缓冲液中的最佳暴露温度和暴露溶液浓度，优化方案和软件。系统优选验证了所选的最佳暴露处理与通过传统方法例如HPLC和/或通过如下更详细描述的对照获得的参比结果相比，能够实现准确的糖分析。虽然优选针对图2所述的测定系统进行完整分析，但可选地在通过HPLC或其它测定分析前对蛋白进行消化。可使用具有或不具有HPLC参比的方案，以允许使用者进行内部校正或以简单方式校正。该系统优选具有测定软件以及有关方案和样品。·如图I中所示，本申请的糖分析阵列102包括平面基板I ;和多个接触部10，所述多个接触部10存在于所述平面基板I的表面上的多个预定位置处，在所述多个接触部10中设置有多种糖结合剂，所述多种糖结合剂根据它们的结合特异性在所述平面基板I的预定位置中作为糖类和聚糖的检测器；所述多种糖结合剂中的每一种存在于所述表面上的多个独立的预定位置10，其中所述多个独立的预定位置10设置有在浓度曲线中的多个浓度的所述糖结合剂；所述平面基板I被设置成与包括糖蛋白的样品接触，使得所述糖蛋白在所述多个接触部10处与至少一种糖结合剂特异性结合并形成可检测的结合复合物，以便根据所述浓度曲线确定用于非特异性结合的基线。如图2所示，提供测定系统100以进行糖基化测定。测定系统100具有多个阵列102，每个都包括固体(优选平面)基板，在该固体基板上以预定顺序提供多个序列或位点特异性的糖结合剂(对于该顺序的格式的非限定性实例，参见下面的实施例2)。这样的结合剂包括但不限于抗体、凝集素等。这样的凝集素的非限定性实例先前已描述。固体基板可以可选地包括多孔膜，例如硝酸纤维素，或非多孔基板，例如玻璃(如本领域中已知的，优选对后一类型的基板进行衍生化以允许蛋白稳固地与其结合)。可选地可以根据如下实施例2所述的K指纹阵列格式来制备阵列102。优选通过基于测定方案和测定优化方案中的具体说明的试剂盒的组分对阵列102进行处理，例如包括一种或多种如本文所述的洗涤和/或封闭缓冲液(blockingbuffers)。可以可选地将阵列102插入(或以其他方式提供至)测定执行�？�104，用于自动制备和执行如本文所述的测定方案。在测定执行�？�104中，将样品蛋白施加于每个阵列102上，接着进行一个或多个洗涤步骤。可选地，在施加样品蛋白前，还进行一次或多次封闭、平衡和/或洗涤步骤。“封闭”是指施加缓冲液以阻断非特异性相互作用。也可以在样品蛋白施加于阵列102后可选地进行这样的封闭。以下也将阵列102称为“载玻片”。在施加样品蛋白后以及可选地在一个或多个洗涤步骤后，通过检测器105检测糖结合剂与样品蛋白的结合。应注意，样品蛋白可选地在没有糖结合剂的情况下首先结合于阵列102，并且之后施加糖结合剂，但在任何情况下，均通过检测器105对糖结合剂和样品蛋白之间的复合物的形成进行检测。检测器105可选地可以与检测执行模块104组合或可以可替换地与其分尚。检测器105优选接收直接指示结合的原始信号；例如，如果使用比色指示器来检测结合复合物的形成，则可选地用检测器105进行图像分析以获得原始结合信号。可选地并且优选地，随后用测定数据分析仪106分析数据以确定结合是否确实发生。检测器105与测定数据分析仪106连通，但可能可选地与测定数据分析仪106组合或可替换地与其分离。通过计算糖结合剂信号例如凝集素信号，并且通过计算凝集素信号比来测量结合。例如，如下文中的某些实施例所述，认为可选的校正结果或QC(质量控制)因素能够确定结合是否发生。可选地，如实施例4所述，测定外标志�？�107对任何异常的或“离群”结果进行标志，并且也检测测定相关的问题；还如下文更详细地描述的，通过进一步考虑可能可选地排除这些结果。 随后测定优化�？�108接收结合结果。测定优化�？�108优选包括数据库，其含有与感兴趣的蛋白在不同实验条件下测定的结合有关的数据，在本实施例中感兴趣的蛋白为IgG抗体。测定优化�？�108优选接收含有其它特定类型蛋白如IgG抗体的优化实验结果的文件。文件优选包括涉及以下内容的数据校正标准在不同暴露条件的基质中的所需样品(不同暴露溶液浓度和不同暴露温度)参比样品用于这样的实验的实验布局的非限定性实例(例如参见图5)为图5示出了优化/暴露校正实验结果的实例。该实验优选进行一次，以利用样品确定用于未来实验的最佳条件。下面的表示出了实验布局(具有相关测试暴露条件的所需载玻片和样品)。当进行实验时，如图5所示，通过具有另外的信息如用户名、日期等的系统来产生一组结果/糖分析。将图5所示的报告加载(上传)到用于分析的测定优化软件�？椋⑶腋孟低巢砻饔糜谠诵形蠢床舛ǖ淖罴烟跫谋ǜ妗�
I号衬垫/载2号衬塾3号衬塾/ 4号衬垫/ 5号衬垫/ 6号衬垫/ 7号衬垫/ 8号衬垫/ 玻片(顶部/载玻片载玻片载玻片载玻片载玻片载玻片载玻片 衬垫/第I载(底部衬
玻片)________垫)
培养基暴露无暴露培养基暴培养基暴低暴露溶高暴露溶高暴露溶高暴露溶 溶液浓度％处理露溶液浓露溶液浓液浓度％液浓度％液浓度％液浓度％
(低温。C) 测试IgG度％(低度％ (低(低温。C)(低温°C)(高温。C)(低温。C)
校正标准温°() 温°() 测试IgG 测试IgG 测试IgG 参比样品
(已提供)测试IgG 测试IgG(已提供)每个衬垫或载玻片与材料的类型和/或材料和特定样品暴露条件的组合有关，因而与产生实验条件设定的实验组有关。例如，对于衬垫载玻片(如载玻片数量为2)，在特定暴露条件(温度、暴露溶液浓度和暴露时间)下，在每片载玻片上均存在一种材料。在载玻片之间提供共享的校正标准以实现校正数据。多衬垫载玻片具有一个基板，如一个平面基板，但具有多个子区域。对于这样的载玻片，第一衬垫通常为校正标准。可选地，独立衬垫可具有样品、参比标准和对照。可在相同载玻片或衬垫/子区域中提供多于一个的具有不同检测剂(例如具有不同颜色的比色剂)的探针。此外，如果可提供，则测定优化模块108还可以可选地接收对存在于阵列102中的相同蛋白样品和至少一种糖结合蛋白的比较性HPLC(高效液相色谱)数据；可选地根据本领域中已知的一种或多种方法来获得数据。然后测定优化�？�108将所有可用的参比数据和获自样品蛋白的实际数据进行比较，以通过计算最佳凝集素活性，测量仅当样品暴露时产生信号的凝集素，以及通过与基于使用大量样品类型创建的实验确定的数据库来定义的计算的基线相比较而计算载玻片背景值，来确定最合适的测定条件。这样的参数的非限定性实例包括用于温育样品蛋白和糖结合剂的结合时间、温度和缓冲液的暴露溶液浓度值；凝集素(糖结合剂)信号、信号比、当暴露为非最佳时发生反应的一组指定的凝集素、背景值以及与校正标准背景相比较的背景值；样品缓冲液中的 ES(暴露溶液)浓度(例如样品缓冲液体积的O. 01%);和样品蛋白浓度。测定优化模块108也可特异性确定IgG样品抗体蛋白是否具有Fab糖基化或O-连接糖基化；如果有，则实施特异优化条件。对使用者发出有关该糖基化存在的警告，该糖基化的存在可能对结果的准确性产生负面影响。可选地，对一个或多个以下的其它参数进行优化-样品浓度-载玻片格式-测定格式-解释算法(脚本)为了将测定定制为特异性mAb (抗体)并允许Fe (免疫分子)相关聚糖的最大化暴露而进行优化。优化包括至少三个参数的校正暴露溶液浓度，温度和暴露预处理的温育时间，以将聚糖暴露于阵列凝集素。暴露溶液可以可选地包括任何适合将未暴露的聚糖结构进行暴露的成分，其会以其他方式被封闭。可选地且优选地，溶液含有去污剂；更优选地，去污剂选自包括胆酸盐、脱氧胆酸盐、C16TAB、LysoPC、CHAPS、两性表面活性剂(兼性离子洗漆剂，Zwittergent、SDS>辛基糖苷、洋地黄皂苷、芦布若尔、C12E8、曲拉通X-100 (Triton X-100)、诺乃P-40、和吐温-80的组，其比例均为用于展开蛋白的本领域已知的百分比。由于蛋白序列的差异可能影响抗体的生化和结构特性，因此暴露条件可能会随着单克隆抗体不同而稍微变化。待控制的条件矩阵可以可选地包括优化暴露溶液浓度0. 001%至1%优化温度50_80°C预处理温育的优化时间I分钟至I小时通过如本文所述的软件方法自动地进行最佳条件的选择。实施例2多浓度阵列格式多浓度阵列格式涉及对其本身物理阵列的改进，以获得更优化的结合结果。与先前阵列类型中的单一浓度相比，该新型网格格式在阵列上使用了针对每个凝集素(或抗体-糖结合剂)而印刷的浓度曲线。开发多浓度格式以便提高系统重现性并生成更精确的信号。不希望限于封闭列表中，多浓度阵列格式还提供了至少以下改进指纹和解释水平的更高的重现性在某些非特异性结合的情况下，用于定义基线的改进和更可靠的方式多浓度格式能够解决各种问题， 例如“凝集素零点”，重现性和样品浓度，这些问题对于高背景或低信号可以是非常重要的。对该问题的解决使得印刷在阵列上的糖结合剂的量得以降低。多浓度格式定义了每个结合剂有多个斑点，包括用于每个糖结合剂如凝集素的浓度曲线，因而每个阵列需要更多斑点。为了实现该目标，对阵列格式进行修饰，并且使每个凝集素包括另外的斑点。也将板格式进行改变以包括所有改进的自动图像分析所需的浓度和其它标记斑点。添加更多斑点可能降低自动图像分析软件精确地检测阵列上的斑点并定位虚拟测量网格(设置斑点值并计算指纹)的能力。为了提高图像分析能力，可能提供其它的标记斑点，包括在处理的阵列扫描过程中提供高信号的预标记蛋白。如上所述，多浓度格式针对每个糖结合剂例如凝集素定义浓度曲线。在该非限定性实施例中，针对印刷在多个斑点之上的阵列的固体基板上的凝集素的量，给出了浓度曲线。优选地，对于阵列基板上的每个凝集素(糖结合剂)，存在多个不同的斑点，其与不同蛋白浓度相关。可选地，浓度范围为O. 01mg/ml至10mg/ml ;优选地,该范围为O. 038mg/ml至
3.5mg/ml,并且更优选地为O. 05mg/ml至lmg/ml (作为每毫升点样溶液中的凝集素的毫克量给出)。例如，凝集素ConA的浓度在图3中给出，具有7种不同的浓度(因而在物理基板上有7个不同斑点，每个含有凝集素的量在表中给出)。多浓度印刷格式用于计算载玻片上每种凝集素的信号曲线。如上所述，系统100优选自动测定哪些浓度是可接受的；如果信号和线性存在问题，则可以可选地忽略曲线中多达2个浓度点(在浓度的总数之内)。所计算的曲线和信号的质量决定所提交指纹的错误值。预计结合信号在凝集素浓度总数的至少五个中呈线性；该参数是通过测定优化�？�108测定的参数之一，并且是选择如实施例I所述的特定实验条件组的标准之一。通过接触或非接触印刷，可选地在阵列上制备多浓度格式，如先前所述优选平面基板。如其名称所示，接触印刷涉及将包覆有含有糖结合剂的溶液的固体装置如针头与平面基板的表面接触。非接触印刷可能例如可选地涉及喷洒或含有糖结合剂的溶液的其它分布方式，以使糖结合剂沉积在平面基板上。对于接触印刷,斑点尺寸直径优选从O. 05mm至75mm变化。对于非接触印刷,斑点尺寸直径优选从80微米至2500微米变化。“直径”指的是斑点的最长轴(尺寸)；斑点不需要呈圆形或关于它们的轴对称。根据每个斑点的样品蛋白的量，对于IgG蛋白，推荐的IgG量在I. 8-12 μ g的范围内。推荐的IgG浓度在O. OOl微摩尔至100微摩尔的范围内；特别优选O. I μ M。实施例3QC监测和校ιΗQC(质量控制)监测和校正涉及测定系统的改进。QC监测识别在系统100的工作流程的湿(载玻片处理)和干(扫描)阶段中的技术问题。检测的主要问题是载玻片质量、扫描质量、副本间的相关性(如果有)和图像分析步骤过程中的问题。提供给使用者实验中的载玻片和样品的数值得分(对于技术质量，等级为0-1，而对于图像分析网格校正质量，等级为-100至-200)。在提供每个样品的报告中提供了关于每个得分的内部成分的更详细的信息。计算阶段:算法的计算阶段以测试载玻片上的每个斑点开始；每个斑点根据其均一性和背景水平接收得分。在该过程中可排除某些斑点。然后根据其平均斑点质量，两个相同子块间的相关性和其它技术参数，对整个载玻片进行打分。下一阶段是测试副本载玻片间的相关性(两个样品载玻片，或两个对照载玻片)。如果副本相关性很差，则系统会自动选择更好的载玻片作为计算的基础。下表总结了用于计算载玻片得分的主要监测；应当注意，下表是用于一种载玻片类型的实例，并且对于其它的载玻片格式和/或表面类型可以是不同的。
权利要求1.一种糖分析阵列，包括平面基板和存在于所述基板的表面上多个预定位置的多种糖结合剂，所述多种糖结合剂中的每一种存在于所述表面上的多个独立的预定位置，其中所述多个独立的预定位置涉及所述位置的所述糖结合剂在浓度曲线中的多个浓度；所述平面基板适于接触包括糖蛋白的样品，使得所述糖蛋白与至少一种糖结合剂特异性结合并形成可检测的结合复合物，以便根据所述浓度曲线确定用于非特异性结合的基线。
2.一种糖分析阵列(102)，其特征在于，包括 平面基板(I);和 多个接触部(10)，所述多个接触部(10)存在于所述平面基板(I)的表面上的多个预定位置处，在所述多个接触部(10)中设置有多种糖结合剂，所述多种糖结合剂设置在所述平面基板(I)的预定位置中；所述多种糖结合剂中的每一种存在于所述表面上的多个独立的预定位置(10)，其中所述多个独立的预定位置(10)设置有在浓度曲线中的多个浓度的所述糖结合剂；所述平面基板(I)被设置成与包括糖蛋白的样品接触，使得所述糖蛋白在所述多个接触部(10)处与至少一种糖结合剂特异性结合并形成可检测的结合复合物，以便根据所述浓度曲线确定用于非特异性结合的基线。
3.根据权利要求I或2所述的阵列，其中，所述平面基板具有凹陷或孔。
4.根据权利要求3所述的阵列，其中，所述平面基板包括膜、玻璃或塑料中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的阵列，其中，所述平面基板是衍生化的。
6.根据权利要求I或2所述的阵列，其中，所述阵列进一步包括在所述平面基板上的多个标记的预定位置，以提供高信号来支持所述阵列在与所述样品接触后的图像分析。
7.根据权利要求6所述的阵列，其中，所述阵列进一步包括多种糖结合剂，在所述平面基板的预定位置作为校正标准。
8.根据权利要求7所述的阵列，其中，所述平面基板被分成多个衬垫，并且其中每一个衬垫包括独立的多个校正标准。
9.根据权利要求I或2所述的阵列，其中，所述糖结合剂包括凝集素或抗体。
10.根据权利要求9所述的阵列，其中，所述基板上的每种凝集素的浓度范围为O. 001mg/ml 至 10mg/ml。
11.根据权利要求10所述的阵列,其中，所述浓度范围为O.01mg/ml至10mg/ml。
12.根据权利要求11所述的阵列，其中，所述浓度范围为0.01mg/ml至5mg/ml。
13.根据权利要求10所述的阵列，其中，每个位置具有斑点尺寸直径，并且其中所述斑点尺寸直径在0. 05mm至75mm的范围内。
14.根据权利要求10所述的阵列，其中，每个位置具有斑点尺寸直径，并且其中所述斑点尺寸直径在80微米至2500微米的范围内。
15.根据权利要求13或14所述的阵列，其中，所述糖蛋白包括IgG抗体或片段。
16.根据权利要求15所述的阵列，其中，每个位置所述IgG量在I.8-12 μ g的范围内。
17.根据权利要求16所述的阵列，其中，在用于使所述IgG抗体或片段与所述糖结合剂接触的溶液中，所述IgG浓度在O. 001微摩尔至100微摩尔的范围内。
18.根据权利要求17所述的阵列，其中，所述溶液包括去污剂，用于展开所述IgG抗体或片段并暴露至少一种聚糖。
19.根据权利要求I或2所述的阵列，其中，所述平面基板具有凹陷或孔。
20.根据权利要求I或2所述的阵列，其中，所述糖结合剂包括凝集素或抗体。
21.一种用根据权利要求1-20中任一项所述的多个阵列进行糖基化测定的测定系统，包括用于进行所述糖基化测定的试剂盒，通过结合信号来检测所述可检测的结合复合物以获得结合数据的检测器，以及测定优化�？椋霾舛ㄓ呕？橛糜诒冉喜慰际莺痛友诽堑鞍谆竦玫乃鼋岷鲜荩酝ü扑阕罴涯鼗钚�、测量仅与样品糖蛋白产生信号的凝集素、以及通过与基于使用大量样品类型创建的实验确定的数据库来定义的计算的基线相比较而计算载玻片背景值，来确定合适的测定条件。
22.一种用于进行糖基化测定的测定系统(100)，其特征在于，包括 多个阵列(102)， 测定执行模块(104)，所述多个阵列(102)连接至所述测定执行�？�(104)，或容纳在所述测定执行�？�(104)中； 检测器(105)，连接至所述测定执行�？�(104)，通过所述检测器(105)检测所述糖结合剂与样品蛋白的结合； 测定数据分析仪(106)，与所述检测器(105)通信或连接至所述检测器(105)； 测定外标志�？�(107);连接至所述测定数据分析仪(106)或者与所述测定数据分析仪(106)通信；以及 测定优化�？�(108)，连接至所述测定数据分析仪(106)或者与所述测定数据分析仪(106)通信； 其中，所述多个阵列(102)中的每一个包括 平面基板(10);和 多个接触部(10)，所述多个接触部(10)存在于所述平面基板(I)的表面上的多个预定位置处，在所述多个接触部(10)中设置有多种糖结合剂，所述多种糖结合剂设置在所述平面基板(I)的预定位置中；所述多种糖结合剂中的每一种存在于所述表面上的多个独立的预定位置(10)，其中所述多个独立的预定位置(10)设置有在浓度曲线中的多个浓度的所述糖结合剂；所述平面基板(I)被设置成与包括糖蛋白的样品接触，使得所述糖蛋白在所述多个接触部(10)处与至少一种糖结合剂特异性结合并形成可检测的结合复合物，以便根据所述浓度曲线确定用于非特异性结合的基线。
23.根据权利要求22所述的测定系统，其中，所述样品糖蛋白包括IgG抗体，并且其中所述测定优化�？槿范↖gG样品抗体是否具有Fab糖基化或O-连接糖基化，使得实施特异优化条件，并发出有关这样的糖基化存在的警告。
24.根据权利要求23所述的测定系统，其中，所述测定优化模块确定待施加于所述样品糖蛋白的暴露溶液的量，其中所述暴露溶液具有用于展开蛋白的本领域已知百分比的去污剂，所述去污剂选自由十二烷基硫酸钠、胆酸盐、脱氧胆酸盐、C16TAB、LysoPC, CHAPS、两性表面活性剂、辛基糖苷、洋地黄皂苷、芦布若尔、C12E8、曲拉通X-100、诺乃P-40、和吐温-80组成的组。
25.根据权利要求24所述的测定系统，其中，所述测定优化�？槿范ㄉ婕耙韵轮械囊桓龌蚨喔龅奶跫卣笥呕┞度芤号ǘ�0. 001%至1%，优化温度50-80°C，预处理温育的优化时间1分钟至I小时。
26.根据权利要求21或22或23-25中任一项所述的测定系统，进一步包括至少一个质量控制监测，其选自由通过前景均一性、背景均一性、平均中位密度间的相似性、饱和水平的斑点评估；根据阵列的背景、对照斑点、阵列内重现性对整个平面基板的质量进行评估的阵列验证；样品和校正位置之间的归一化的评估；整个阵列信号的确定组成的组。
27.根据权利要求21或22或23-25中任一项所述的测定系统，进一步包括作为校正样品而应用于多个包含所述糖结合剂的预定位置的校正蛋白，以根据黄金指纹标准，通过所述测定优化�？槔葱Ｕ墙岷霞恋姆从π�。
28.根据权利要求27所述的测定系统，其中，所述测定优化�？楦菟霾舛ㄍ獗曛痉⒊鼍�。
29.根据权利要求2所述的阵列，其中，所述接触部(10)选自圆形、椭圆形、方形的凹槽、凹陷或孔。
30.根据权利要求22所述的测定系统，其中，所述接触部(10)选自圆形、椭圆形、方形的凹槽、凹陷或孔。
31.根据权利要求22所述的测定系统，其中，所述阵列(102)插入或提供至所述测定执行�？�(104)。
32.根据权利要求22所述的测定系统，其中，所述检测器(105)与所述测定执行�？�(104)组合或与所述测定执行模块(104)分开。
33.根据权利要求22所述的测定系统，其中，所述检测器(105)与所述测定数据分析仪(106)组合或与所述测定数据分析仪(106)分开。
34.根据权利要求22所述的测定系统，其中，所述测定优化�？�(108)包括数据库，所述数据库包含与感兴趣的蛋白在不同实验条件下测定的结合有关的数据。
35.根据权利要求22所述的测定系统，其中，所述测定优化模块(108)接收包含其它特定类型蛋白的优化实验结果的文件。
专利摘要本申请提供一种改进的糖基化检测法、糖分析阵列和测定系统。该糖分析阵列(102)包括平面基板(1)；和多个接触部(10)，多个接触部存在于平面基板(1)的表面上的多个预定位置处，在多个接触部(10)中设置有多种糖结合剂，多种糖结合剂在平面基板(1)的预定位置中起糖类和聚糖检测器和结合剂的作用；多种糖结合剂中的每一种存在于表面上的多个独立的预定位置(10)，其中多个独立的预定位置(10)设置有在浓度曲线中的多个浓度的糖结合剂；平面基板(1)被设置成与包括糖蛋白的样品接触，使得糖蛋白在多个接触部(10)处与至少一种糖结合剂特异性结合并形成可检测的结合复合物，以便根据浓度曲线确定用于非特异性结合的基线。
文档编号G01N33/68GK202471720SQ20112033992
公开日2012年10月3日 申请日期2011年9月9日 优先权日2011年9月9日
发明者戴维·达布什, 查南·希梅尔法布, 约瑟夫·柯亨, 耶胡迪特·阿莫尔, 耶萨亚胡·亚基尔, 艾拉纳·贝尔泽尔, 艾里斯·利德尔, 阿尔贝纳·萨莫科夫利斯基 申请人:普若康尼(以色列)有限公司
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