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专利名称：检测葡萄藻光密度值的样品前处理与测定方法
技术领域：
本发明属于葡萄藻开发利用的技术，特别涉及一种检测葡萄藻光密度值的样品前处理与测定方法。
背景技术：
微藻是地球上最早出现的光合自养生物之一，不仅对全球的物质与能量转化、生态系统平衡等起着至关重要的作用，而且近半个世纪以来已发展成以规模化养殖为基础的微藻产业，并应用于食品、医药、饲料、化工、环保、能源、材料等各行各业。基于分光光度法原理与技术建立的光密度法是国内外快速、简便、高通量测定微藻等微生物生物量常用而有效的方法，它在微藻育种、养殖、深加工等方面发挥着不可替代的重要作用[王英娟等.西北大学学报(自然科学版)，2012，42(1):60-63]。该方法的基本原理是基于大多数微藻体积小且呈单细胞状态，能在光度法检测所需时间内均匀分布于培养液中，同时在较宽的藻体密度范围内，藻液的光密度值(0D值)与生物量(如单位体积藻液的干藻重)之间呈显著的线性相关，因而通过测得待测藻液的光密度值即可按其与生物量间预先所构建的线性回归方程，推算出待测藻液的生物量。利用光密度法检测微藻生物量，不用像传统的干重法那样，每次都需要较多藻液，且需先通过过滤或离心等收获藻体，进而干燥再称重，它具有简便、快速、样品用量少、可实现活体动态检测等显著优点[崔研等.原壳小球藻生物量快速测定方法的对比研究.食品科学.2012，33(2): 253-257]。葡萄藻(Botryococcus)是一种世界广布的能源微藻，该藻因脂质的含量高(可达细胞干重85%)、且组成和结构与化石原油相近，而被誉为“油藻”，以其生产航空燃油等高品质燃料一直是近年来全球生物能源领域的研发热点之一 [Metzger & Largeau.Botryococcus brauni1: a rich source for hydrocarbons and related ether lipids.Appl Microbiol Biotechnol.2005, 66: 486 - 496]。但值得指出的是，葡萄藻细胞不像小球藻等微藻细胞那样以游离的单细胞形式存在，而通常是由几十至上百个细胞形成集落。这种集落状的细胞团因体积大且易于下沉而难以在培养液中均匀分布，从而严重影响光密度值测定的可行性与准确性。正因如此，目前在葡萄藻研发中仍多沿用传统的干重法检测其生物量，这也是导致多年来国内外葡萄藻育种、培殖和深加工等方面研发进展缓慢的重要原因之一 [Yarning Ge, et al.Growth characteristics of Botryococcusbraunii 765 under high CO2 concentration in photobioreactor.BioresourceTechnology.2011，102(1): 130 - 134]。因此，迫切需要建立一种方法，能将集落状的葡萄藻细胞团制备成能均匀分布的单细胞或由几个细胞组成的小细胞团，以满足光密度测定法对样品的要求，从而将具简便、快速、样品用量少等优势的光密度生物量测定法应用于葡萄藻的研究与开发。

发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有检测方法的不足，提供一种检测葡萄藻光密度值的样品前处理与测定方法。为解决技术问题，本发明的解决方案是:提供一种检测葡萄藻液光密度值的样品前处理方法，该方法是:取待测葡萄藻液于离心管，加入微粒型的黄单胞多糖(Xanthan gum)，并置于冰水浴中，用超声波处理将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制备成能均匀分布的单细胞或几个细胞的聚集体，以满足分光光度计测定对被测藻液均匀度的要求。本发明进一步提供了基于前述前处理的测定葡萄藻液光密度值的方法，具体包括以下步骤:(I)取4 mL待测光密度值的葡萄藻液于5 mL离心管中，再加入微粒型黄单胞多糖，并置于冰水浴中预冷；(2)预冷藻液经超声波处理10 s后，在光学显微镜下观察葡萄藻集落是否已被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体；(3)若没有，则用每次5 s的超声波进行多次处理，直至被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体，由此可计算被测葡萄藻液适宜的超声处理时间T=10+5*n，单位为S，其中η为每超声处理5 s的次数；(4)将经超声处理T秒后的葡萄藻液转移至比色皿中；(5)另取4 mL葡萄藻培养液于5 mL离心管中，加入与步骤(I)中等量的微粒型黄，进而在冰水浴条件下用与步骤(2)相同的超声波处理T秒，再将其转移至比色皿中；(6)以步骤(5)处理的培养液为空白对照，用分光光度计测定步骤(4)的藻液在560 nm处的光密度值(OD56tol),即为待测葡萄藻液的光密度值(OD56tlnm)。本发明中，微粒型黄单胞多糖的添加量为5粒，0.2 mg/粒，共I mg ;所述微粒型是指用造粒-干燥设备先将黄单胞多糖等物料制成大小均匀的圆球体颗粒、再进行干燥而获得的微粒状剂型，其单粒重可通过调整工艺参数进行调控。本发明中，设定超声波仪的频率为20 kHz，发射功率为100 W，将Φ 2型变幅杆前端2 cm浸入预冷藻液，以I s / I s (开/关)间歇超声处理15 25 S。与现有技术相比，本发明的显著优点:本发明所建的检测葡萄藻光密度值的样品前处理与测定方法，与现有方法相比，具有更加快速、准确、省时省力等优点，从而为葡萄藻的研发提供必要的技术方法。
具体实施例方式利用分光光度计测定微藻光密度值时，要求藻细胞能均匀地分布于培养液中。为将细胞呈集落状的葡萄藻制备成能均匀分布的单细胞或几个细胞的聚集体，本方法用适当功率超声波进行处理，使其尽可能分散。同时，为减少超声波对藻细胞的机械损伤，以及克服葡萄藻细胞的体积和密度比小球藻等微藻细胞的大而易下沉的难题，本方法于超声处理前在藻液中加入少量黄单胞多糖(Xanthan gum),达到了很好的效果。这主要是基于黄单胞多糖具有以下三方面特性:(I)它水溶性好、透明无色、性能稳定，在低于0.5%。浓度时，不影响藻液光密度测定；(2)它能在藻细胞表面形成膜状物，且可使超声波能量传递变得更加平缓，从而有助减少超声波对藻细胞造成的机械损伤；(3)少量黄单胞多糖即可显著增加液体的密度，从而可通过减缓藻细胞下沉，使藻细胞分布得更均匀。
下面通过具体实施例子，对本发明的实现方式进行详细描述。本发明的技术方案可以通过以下步骤实现: 1、选用样本材料:以公知的葡萄藻品系UTEX 572 (保藏单位:CultureCollection of Algae at the University of Texas at Austin ;地址:The Universityof Texas at Austin, The Culture Collection of Algae (UTEX), 205 ff.24th St.StopA6700, Austin, TX 78712-1240，USA)为材料，这株品系是实验室常用的葡萄藻，在发明人所在的浙江大学原子核农业科学研究所生物资源与分子工程实验室也有保存，可随时提供样本。2、试剂和仪器:本发明中所用的微粒型黄单胞多糖(Xanthan gum,约0.2 mg/粒)为美国Sigma公司产品，分析纯JY92-1I型超声波发生仪由宁波新芝生物科技股份有限公司生产；Ultrospec 2000型紫外可见分光光度计为美国Pharmacia公司产品；TE214S型电子天平为北京赛多利斯产品。3、检测葡萄藻光密度值的样品前处理与测定方法的主要步骤如下:(I)取4 mL待测光密度值的葡萄藻液于5 mL离心管中，再加入5粒(约I mg)微粒型黄单胞多糖(Xanthan gum),并置于冰水浴中预冷；(2)设定超声波仪的频率为20 kHz，发射功率为100 W，将Φ2型变幅杆前端2 cm浸入步骤(I)的预冷藻液，以I· S / I S (开/关)间歇超声10 S后，用玻璃吸管取约10μ 藻液在光学显微镜下观察葡萄藻集落是否已被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体；(3)若葡萄藻集落未被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体，则按步骤(2)中的方法再超声处理5 S，再用光学显微镜下观察是否已被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体；(4)重复步骤(3)，直至将葡萄藻集落分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体，由此可计算被测葡萄藻液适宜的超声处理时间Τ=10+5*η，单位为S，其中η为每超声处理5 s的次数；(5)将经超声处理T秒后的葡萄藻液转移至比色皿中；(6)另取4 mL葡萄藻培养液于5 mL离心管中，加入5粒(约I mg)微粒型黄单胞多糖(Xanthan gum),置于冰水浴中预冷,并将Φ 2型变幅杆前端2 cm浸入预冷藻液,设置超声波频率为20 kHz、发射功率为100 W，按I s / I s (开/关)间歇超声步骤⑷中得出的适宜处理时间T秒，再将其转移至比色皿中；(7)以步骤(6)处理的培养液为空白对照，用分光光度计测定步骤(5)的藻液在560 nm处的光密度值(OD56tol),即为待测葡萄藻液的光密度值(OD56tlnm)。4、结果与分析根据实验结果，葡萄藻UTEX 572藻液在含0.25%。黄单胞多糖(Xanthan gum)的情况下，经20 s (n=2)超声处理，由几十至上百个细胞形成的集落被分散成以单细胞为主、少数呈2-5个细胞的聚集体。这种经超声处理的藻液，藻细胞分布均匀，其光密度值(OD56tol)能在5 min内保持稳定，而OD56tol测量一般在2 min内就能完成。同时，实验结果显示，UTEX572藻液用本方法处理后干藻重M(g.Γ1)与OD56tlnm的线性拟合方程为M=0.4133*0D56(lnm，相关系数R2=0.998 ;而未经本方法处理直接测定OD56tol时，线性拟合方程为M=0.6313*OD560nm,相关系数R2=0.979。可见，呈集落状的葡萄藻液经本方法处理后，对其光密度值OD56tol测量的灵敏度、线性度、稳定性和可靠性等均有显著提升。作为实例，我们分别选取公知的2株葡萄藻品系UTEX 2441和UTEX B2629来验证本发明的实用性。利用本发明方法，UTEX 2441和UTEX B2629分别经15 s和25 s超声处理，即可制得以单细胞为主、少数呈2-5个细胞的聚集体，并能准确测得各自的光密度值OD560nmo这些例子进一步说明，本发明建立的检测葡萄藻光密度值的样品前处理与测定方法是有效和实用的。
权利要求
1.一种检测葡萄藻光密度值的样品前处理方法，其特征在于，该方法是:取待测葡萄藻液于离心管，加入微粒型的黄单胞多糖，并置于冰水浴中，用超声波处理将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制备成能均匀分布的单细胞或几个细胞的聚集体，以满足分光光度计测定对被测藻液均匀度的要求。
2.一种基于权利要求1所述前处理方法的测定葡萄藻液光密度值的方法，其特征在于，具体包括以下步骤: (1)取4mL待测光密度值的葡萄藻液于5 mL离心管中，再加入微粒型黄单胞多糖，并置于冰水浴中预冷； (2)预冷藻液经超声波处理10s后，在光学显微镜下观察葡萄藻集落是否已被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体； (3)若没有，则用每次5s的超声波进行多次处理，直至被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体，由此可计算被测葡萄藻液适宜的超声处理时间T=10+5*n，单位为S，其中η为每超声处理5 s的次数； (4)将经超声处理T秒后的葡萄藻液转移至比色皿中； (5)另取4mL葡萄藻培养液于5 mL离心管中，加入与步骤(I)中等量的微粒型黄，进而在冰水浴条件下用与步骤(2)相同的超声波处理T秒，再将其转移至比色皿中； (6)以步骤(5)处理的培养液为空白对照，用分光光度计测定步骤(4)的藻液在560nm处的光密度值(OD56tol),即为待测葡萄藻液的光密度值(OD56tlmi)15
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，微粒型黄单胞多糖的添加量为5粒，0.2mg/粒，共I mg ;所述微粒型是指用造粒-干燥设备先将黄单胞多糖等物料制成大小均匀的圆球体颗粒、再进行干燥而获得的微粒状剂型，其单粒重通过调整工艺参数进行调控。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，设定超声波仪的频率为20kHz，发射功率为100 W，将Φ2型变幅杆前端2 cm浸入预冷藻液，以I s / I s (开/关)间歇超声处理15 25 S。
全文摘要
本发明涉及葡萄藻开发利用的技术，旨在提供一种检测葡萄藻光密度值的样品前处理与测定方法。该方法是取待测葡萄藻液于离心管，加入微粒型的黄单胞多糖，并置于冰水浴中，用超声波处理将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制备成能均匀分布的单细胞或几个细胞的聚集体，以满足分光光度计测定对被测藻液均匀度的要求。本发明与现有方法相比，具有更加快速、准确、省时省力等优点，从而为葡萄藻的研发提供必要的技术方法。
文档编号G01N21/31GK103196714SQ20131006696
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月3日 优先权日2013年3月3日
发明者汪志平, 刘新颖, 于金鑫, 吕蓓芬, 马丽芳, 陈子元 申请人:浙江大学