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专利名称：转bar/pat基因植物及其衍生产品的快速检测试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分析测试方法，确切地说是一种利用免疫亲和层析技术对转bar/pat基因植物及其加工产品中PAT蛋白的快速检测方法。属于免疫学和食品安全检测技术领域。
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背景技术：
在转基因植物研制开发或对转基因产品进行筛选或安全性评价时，往往需要对转入外源基因进行定性或半定量测定。bar/ pat基因均为抗除草剂基因，编码同一蛋白一膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)。该基因广泛应用于基因工程育种中的抗除草剂基因，也是遗传转化中的标记基因，它使植物抵抗以L-phosphiothricin(PPT)为活性成分的除草剂。近年来，全球种植的转基因作物面积和比例连年增加，而其中的抗除草剂作物占全球转基因作物的85%。由于抗除草剂标记在商业化转基因植物应用广泛，随着转基因食品的快速发展，国外转PAT/bar基因的作物和食品的大量进入我国，转PAT/bar基因的食品检测技术是转基因食品安全性评价的重要技术平台，其研究具有重要的意义。

发明内容
植物中的除草剂抗性是由外源bar I pat基因所表达的PAT蛋白产生的，本检测方法是针对转基因植物中bar/pat基因表达的PAT蛋白。本发明采用免疫层析法快速检测样品中PAT蛋白，整个过程只需5-10分钟。试纸条质量稳定，保存期可达一年。适用于大豆、玉米、棉花、油菜、苜蓿等农作物中转基因成分的快速定性检测。本发明的目的是提供一种具有简便、准确、快速、灵敏度和特异性高、经济实用、适合于现场检测等特点的转抗除草剂植物的快速检测试纸条。为了达到本发明的目的采取如下技术方案·. 一块bar I pat基因表达的PAT蛋白IgG抗体快速检测试纸，在塑料支撑板上粘贴上样品垫，上样垫的一端紧密连接含有胶体金标记的PAT单克隆抗体的胶体金垫，胶体金垫的另一端紧密连接硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线(T线)和质控线(C线)，检测线为包被在硝酸纤维素膜(NC膜)上的PAT单克隆抗体，质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG抗体，在检测线和质控线之间且距检测线2. 5 3mm处划有指示线用于标识加样位置，硝酸纤维素膜的另一端紧密连接吸样垫形成试纸条，试纸条也可以装入塑料卡中形成卡式包装。所述PAT单克隆抗体是由杂交瘤细胞株4C2分泌的/ /蛋白单克隆抗体，该细胞株已于2012年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC No. 6341。该/ /蛋白单克隆单抗具有高特异性、与其他转基因材料或表达蛋白无交叉反应，效价高，达到IO7以上。
所述的上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫为吸水滤纸。所述的植物中bar/pat基因快速检测试纸,其特征在于所述的抗PAT蛋白单克隆抗体的包被方法为以O. 01MpH7. 2磷酸盐缓冲液(PBS)将抗PAT蛋白单抗配制成I. 5mg/ml的溶液，有喷膜机在NC膜下部以I. 3ul/cm的参数进行划线，包被T线，同时在NC膜上部包被羊抗鼠IgG作为C线，划线后将NC膜在干燥间(温度20 25°C，湿度小于30%)干燥8 10小时。所述的快速bar/PAT蛋白检测试纸条,其特征在于所述的PAT蛋白抗体标记胶体金颗粒的方法为以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30 50nm的胶体金溶液，制备完成后取IOOml胶体金液放在烧杯中，用O. 2MK2C03调至pH8. 2，按IOOml胶体金溶液加入O. 5mg PAT单克隆抗体，室温搅拌2小时，加入终浓度O. I %酪蛋白钠，O. I %聚乙二醇20000封闭20min，12000转离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至66. 7ml，按Iml溶液铺16cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间温度20 25°C，湿度小于30%干燥2 4小时，制成胶体金垫，备用。 试纸条的装配方法为在干燥室内温度20 25°C，湿度小于30%，取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧距边缘Imm搭接胶体金垫，在胶体金垫另一侧距边缘2mm搭接粘贴上样垫；在NC膜C线一侧距边缘I. 5mm处搭接吸样垫。然后用裁剪机将贴好的塑料板切成3_或4_宽的试纸条。检测方法将被检植物/材料(Img-IOOmg)研磨，加入装有Iml碳酸盐缓冲液的离心管中，将制备好的试纸条部分插入离心管中，溶液的浸没高度为标示线以下，若样品中含有Bar基因抗原则被胶体金一PAT抗体捕获，并扩散到NC膜上，与NC上的抗体形成Ab-Ag-胶体金形成复合物，当被捕获的胶体金复合物达到一定数量时，则形成一条肉眼可见的T线，C线作为试剂的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。用肉眼直接观察在10分钟内C、T线的出现情况，并判定检测结果。根据上样的检测结果,确定试纸的最佳标记pH值为8. 2,最佳标记量为O. 5mg每IOOml胶体金溶液，最佳的胶体金工作液为pH9. O的Tris-柠檬酸缓冲液，含O. 2%的酪蛋白，5%蔗糖，O. 2%的BSA，O. 2%的吐温，最佳的抗PAT蛋白单克隆抗体包被浓度为I. 5mg/ml ο 20分钟内判读结果。样本检测
以ELISA试剂为对照，20份阳性抗除草剂材料，包括玉米、大豆、水稻，不同转基因成分含量的样品。本试剂检测出阳性20份，灵敏度为O. 1%。50份阴性样本中，本试剂检测出阴性50份，特异性为100%。本发明转抗除草剂bar/pat基因植物快速检测试纸的优点
①特异性强，敏感性高。该胶体金层析检测试纸条以胶体金标记高亲和力的多克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对抗体的特异性和亲和力影响很�。�且具有较高的标记率。且本发明试纸应用了高特异性和高效价的由CGMCC No. 6341杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。因此，试纸条具有较强的特异性和较高的敏感性，检出最低限量可达到O. 25ng。②简便、快速、时效性强。使用胶体金层析检测试纸条和试纸卡，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，试纸条加入被检样品液后，在15分钟内即可判定检测结果。
③结果显示形象、直观、准确。检测试纸条均以显示红色线T线和C线作为检测结果阳性和阴性标记，即在包被膜上显示一条红色线C线时，表示在被检样品中含有被检物，显示两条红色线T线和C线时，表示在被检样品中不含被检物。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。④节省费用，适用范围广，便于推广。使用检测试纸条，比用仪器分析和ELISA试剂盒的费用大幅下降。另外，试纸条的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括专业检验，海关检疫，卫生检疫，质量监测，加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。


图I利用该单抗进行转bar基因棉花Western blot检测 I为阴性细胞株对照；2为转bar基因棉花总蛋白；3为非转基因棉花总蛋白4为转EPSPS基因玉米种子总蛋白。图2该单抗在Elisa检测特异性的结果。图3该单克隆抗体在检测不同转Bar成分含量的检测灵敏度结果。图4为转bar/pat基因植物及其衍生产品的快速检测试纸条结构示意图。图5检测样品结果判断示意图。图6试纸条检测转基因植物中PAT蛋白I为阴性水稻2为转bar基因水稻。
具体实施例方式鼠抗bar/PAT蛋白单克隆抗体的制备
用蛋白量为200 μ g纯化bar/PAT蛋白，腹腔注射BALB/C小白鼠，用福氏完全佐剂；经15天后进行二次相同剂量免疫，用福氏不完全佐剂；再15天后进行三次免疫，用加倍剂量的纯蛋白不加佐剂；3天后取脾细胞进行融合。将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按10 : I的比例，在无血清的DMEM培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50% PEG3350作为融合剂，在37 °C下加Λ O. 6ml，融合2min，用DMEM培养基终止融合后，1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬�。�分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37°C，5% C02的细胞培养箱中培养。细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10% -50%时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔。筛选出的特异性强阳性孔用常规的有限稀释法克�。�获得单抗细胞株4C2。细胞株4C2进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存。 取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射O. 3-0. 5ml降植烧，7-10天后腹腔注入5-10 X IO5个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，2000rpm离心3min,收集上清液，即为单克隆抗体腹水。辛酸-硫酸铵盐析法纯化单克隆抗体，-70°C保存。4C2细胞株制备得单克隆抗体，即为可专一识别PAT蛋白的抗体。单克隆抗体的效价测定 I)包被将分离纯化的PAT蛋白用包被缓冲液进行稀释，加入酶标板中(IOOul/孔)，PAT蛋白的包被浓度为10ug/ml ;37°C孵育2h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。将Ig非转基因大豆叶片总蛋白加入IOml包被缓冲液中，在研钵中研磨，得到阴性对照液，将阴性对照加入酶标板中(IOOul/孔)，即为阴性对照孔；37°C孵育2h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。封闭
每孔加入IOOul含5%脱脂奶粉的磷酸缓冲液，37°C孵育30min，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。3)每孔加入IOOul上述纯化得到的单克隆抗体或其稀释液(用酶标抗体稀释缓冲液进行稀释)，37°C孵育2h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。4)每孔加入IOOul酶标二抗工作液，37°C孵育2h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。 5)每孔加入IOOul底物溶液，室温避光孵育60min后，用酶标仪测定450nm波长下的吸收值。将吸收值为阴性对照孔两倍以上的孔判断为阳性孔。杂交瘤细胞培养上清、小鼠腹水及纯化后抗体的效价见表I。表I单克隆抗体的效价
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3.本发明的单抗采用转印免疫印迹方法检测转基因植物表达PAT蛋白。)种子总蛋白的提取转bar基因棉花、非转基因棉花、转EPSPS玉米种子各lg，采用HEPES buffer直接提取蛋白，具体方法为加入预冷的提取液I mL，混悬后冰上静置3 4 h，4°C、12 000 r/min，离心20 min，上清液置于_80°C冰箱中备用。) SDS-PAGE蛋白质电泳
3)转膜
4)封闭及杂交
封闭转膜结束后，小心取出凝胶和膜，可将凝胶再用考马斯亮蓝染色以判断转移情况。将膜放入TBST洗一次，再置于丽春红染色液中，在室温下染色5min，用双蒸水洗膜至水变清无色蛋白条带清晰。将膜放入盛有封闭液(5%的脱脂奶粉)的容器中，室温摇床封闭Ih0一抗孵育根据抗体说明书以适当比例(1:1000)用5%的脱脂奶粉稀释一抗，每张膜约4ml。将封闭后的PVDF膜小心放入杂交袋内，然后加入配好的一抗溶液，，小心排除气泡，室温下摇床缓慢摇荡孵育l_3h。孵育后将膜取出，用TBST摇床洗膜3次，每次5min，以去除残留的一抗。二抗孵育用5%的脱脂奶粉按二抗说明书比例稀释二抗(1:4000)，将PVDF膜小心置于杂交袋中，每张膜加4ml 二抗溶液，避免气泡产生，封好杂交带口，室温摇床孵育2h。孵育后将膜取出，用TBST摇床洗膜3次，每次5min。5)曝光鉴定；在暗室中取出一张X光胶片，根据荧光强弱调整曝光时间，一般为l-5min。曝光后，打开暗盒取出X光胶片，显影、定影并冲洗胶片。6)将胶片进行扫描,用Quantity One图像分析软件分析目标条带的光密度值。图I为利用该单抗进行转bar基因的棉花Western blot检测,结果表明，该单克隆抗体能够特异识别植物中表达PAT蛋白。本发明的单抗采用双抗夹心ELISA法，检测转基因材料。取不同转基因成分的转基因玉米品系，Btl76 (转bar基因玉米)、Mon810 (转CrylAb基因抗虫玉米)、GA21 (转EPSPS基因玉米)、T25 (转pat基因玉米)籽粒分别与非转基因玉米混合成样品材料。样品材料中转基因成分质量比分别为1%、10%、100%。分别取样品材料Ig加入IOml样品预冷的抽提缓冲液lmL，并研磨。混悬后冰上静置3 4 h，4°C、12000r/min,离心20 min,上清液置于_80°C冰箱中备用。·
单克隆抗体的特异性鉴定
I.兔PAT蛋白多抗制备方法如下
选体重2. Okg左右、雄性、健康的家兔3只，免疫前耳缘静脉采血分离血清作为阴性对照，-80°C保存备用。免疫程序如下首免，抗原与等量弗氏完全佐剂充分乳化后，皮下多点注射，Img/只。二免(第15日)，用加弗氏不完全佐剂的抗原进行免疫，部位为双后脚掌，500yg/只。三免(第30日)，剂量同上，免疫部位为肿大的胭淋巴结。加强免疫(第37日)，不加佐剂，剂量同上。加强免疫一周后心脏采血并分离血清，用间接ELISA检测抗体水平。效价为1:32000，心脏采血，分离血清，加入O. 01%的叠氮钠，过滤除菌，_80°C保存备用。辛酸一硫酸铵法提纯兔抗bar基因蛋白IgG高免血清，将血清3000rpm离心30min，弃沉淀；按1:2的比例将离心后的血清与醋酸盐缓冲液(O. 06M，pH=5. O)混合，用O. IM HCl调节pH值至4. 5。4°C下边搅拌边加入辛酸(每mL血清加入75 μ I辛酸)，搅拌30min, 4°C静止2h, 12000rpm离心30min,弃沉淀；上清液用IM NaOH调pH值至7. 4,边搅拌边加入4°C放置的饱和(NH4)2SO4,使其浓度达45%，4°C静置Ih以上；4°C 12000rpm离心30min弃上清，沉淀用少量PBS (O. 01Μ,ρΗ=7· 4)溶解，在O. 01M,pH=7. 4 PBS溶液中4°C透析过夜，期间换液3-5次，5%BaC12检测透析液中S042-存留情况；4°C 12000rpm离心30min，吸取上清于-20°C保存。将粗纯物进一步用亲和层析法进行纯化，步骤如下平衡加起始缓冲液平衡柱床至进入与洗出液PH值相同；上样样品经滤膜滤过，取5mL上柱，轻轻振荡5min，竖直放置。待所有悬浮物沉淀后，吸出上清；洗脱加起始缓冲液5mL，轻轻振荡5min，竖直放置。待所有悬浮物沉淀后，吸出上清。反复操作3次。加洗脱缓冲液3mL，轻轻振荡5min，竖直放置。待所有悬浮物沉淀后，吸出上清。反复操作2次。收集洗脱液，每毫升洗脱液加70 μ L中和缓冲液。提纯前和提纯后的兔抗bar基因蛋白IgG高免血清纯度鉴定采用普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE )，并用测定抗体浓度。2.兔抗PPV IgG与McAb最佳工作浓度的确定
用方阵试验确定兔抗bar基因蛋白多抗与McAb最佳工作浓度。单抗双夹心ELISA的一般流程兔抗bar基因IgG包被-洗板-封闭-洗板-加样-洗板-加McAb-洗板-加酶标二抗-洗板-显色-终止-判定结果。具体步骤如下包被用包被液将兔抗bar基因 IgG 作 I: 100、I: 200、I: 400、I: 800、I: 1600、I: 3200、I: 6400 稀释，100 μ L/孔，每个稀释度一行，37°C包被2h后或4°C过夜；弃掉孔内液体，用洗涤液洗涤3次，5min/次，拍干；封闭用39^八作封闭剂，100^ /孔，并去除各孔内可能产生的气泡，37°C封闭3h，同上洗涤三次，拍干；加样，100 μ L/孔，同时设PBS空白对照，37°C作用40min，同上洗漆三次，拍干；加 McAb 用稀释液将 McAb 作 1:25、1:50、1: 100、I: 200、I: 400、I: 800、I 1600稀释，加入酶标板中，IOOyL/孔，每个稀释度作两列，同时设PBS空白对照，37°C作用40min，同上洗涤三次，拍干；加酶标二抗加入I: 5000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100 μ L/孔，37°C作用40min，同上洗涤三次，拍干；显色与终止，加入新配制的TMB底物显色液IOOyL /孔，室温避光显色10_15min，加入终止液(2M H2S04溶液)，50 μ L/孔，在酶标仪上读取0D450nm。以阳性孔OD值接近1，P/Ν值最大时，兔抗PPV IgG和McAb的最大稀释度为其最佳工作浓度。确定的兔抗PPV IgG包被浓度为1:3200 ;单抗稀释倍数为1:800。双抗夹心Elisa检测该单抗对于转基因植株中PAT蛋白的特异性
分别将样本液Btl76、Mon810、GA21和T25 (1%、10%、100%)作为待测样本液进行如下实验提取的植物蛋白(包括叶片和种子的提取液)，每孔100 μ L加于微量反应板，4°C过夜 包被，洗涤缓冲液洗涤后，以每孔100 μ L加入3% BSA封闭液，37°C封闭3h，PBST洗涤，杂交瘤细胞培养上清，每孔100 μ L加于微量反应板，SP2/0细胞培养上清液作为阴性对照。37°C作用60min，洗涤，加入酶标二抗，37°C作用60min，洗涤，加入新配制的TMB底物显色液每100 μ L，室温避光显色10-15min，2mol/L H2SO4 ;每孔50 μ L终止反应，酶标检测仪测定0D450nm各孔的吸收值。结果见图2。上述结果说明，制备获得的单抗与非转bar基因植物不发生交叉反应，对转bar基因植物具有较强的特异性。该单抗仅对PAT蛋白有特异性反应，而与Bt蛋白、EPSP无特异性反应，说明用这单抗具有检测bar/PAT蛋白良好的特异性。单克隆抗体的灵敏度鉴定
样本制备将Btl76 (bar基因阳性材料)，与其非转基因玉米亲本籽粒，按照质量比进行混合，制备转基因成分分别为100%、10%、5%、1%、0. 1%、0. 01%、0%的待测样品。选用Mon810(未含有bar基因的转基因玉米品系)为阴性对照，其与非转基因玉米的混合比例同上。采用HEPES buffer直接提取蛋白，具体方法为加入预冷的提取液I mL，混悬后冰上静置3 4 h，4°C、12 000 r/min，离心20 min，上清液置于_80°C冰箱中备用。分别将将含有10%，5%，1%，O. 1%，O. 01%, O. 001%、0%的转bar基因成分的种子提取植物蛋白提取液，稀释浓度为lOyg/mL，作物样本液，进行Elisa检测实验(步骤同特异性检测实验)，结果见图3。该实验结果表明利用本发明获得的单克隆抗体
5.胶体金标记bar基因蛋白单克隆抗体的制备 I)胶体金标记
采用改良的柠檬酸三钠还原法，其过程为在搅拌条件下，98 mL去离子水加热至65°C后，加入I. 5 mL 1%的氯金酸，继续加热，待温度上升至95°C时，加入2mL 1%的柠檬酸三钠，当溶液呈酒红色时停止加热，冷却后，4°C避光保存。取胶体金溶液，pH7. 2 7. 5，金颗粒大小20 30nm。将bar基因蛋白单克隆抗体O. 5mg/mLlul加入胶体200ul金溶液中，混合均勻，即得金标鼠抗蛋白单克隆抗体溶液。经纯化及浓缩，用稀释液稀释4倍后备用。2)试纸条的组装整个测试条由2层吸水玻璃纤维，I层硝酸纤维素膜，吸水滤纸及白色塑料垫板组成。将吸水纸、包被NC膜(包被有单克隆抗体和羊抗兔IgG)、喷涂玻璃纤维(金标抗体)从上到下依次固定于白色塑料板上。裁取40 mm X5 mm的吸水纸，将吸水纸、包被NC膜、喷涂玻璃纤维膜、样品垫从上到下依次固定在带有粘合剂的PVC背板上，切成5mm宽的试纸条，室温干燥备用，即成测试条。将做好的测试条与干燥剂一起装入铝箔袋内，密封贮存。如图3所示。3)测试样品检测
检测前，将样品磨碎并加水或提取液提�。�溶解获取蛋白。检测时，先将样品垫浸在已提取好的蛋白样品溶液中，样品溶液在毛细吸收作用下由样品垫沿NC膜向吸收垫流动。样品溶液中的特定蛋白在流经结合垫时首先与其中胶体金标记的抗体发生抗原-抗体的特异性的结合作用，流经检测带时抗原-抗体复合物被固定在检测带上的捕获抗体结合，聚集形成肉眼可见的金标条带，显示检测结果为阳性。过量的金标抗体继续流动被固定在控制带上的第二抗体结合聚集形成条带，显示检测的结果有效。4)灵敏度试验
将抗原按0、0.25、0.5、1.0、5.0、10、20、40、80 ng/ ml稀释浓度进行检测，检测线出现红色的最低可测定量，即为此试剂条的灵敏度。当抗原浓度> O. 25时，出现明显的阳性红带；>0.5，出现明显的强阳性带。因此本试纸条的检测灵敏度为O. 25ng。5)稳定性试验
测试条在不启封条件下，分别检测37°C存放2周、室温存放18个月后的试纸条。结果显示，对O. 1%的转基因成分检测灵敏度无明显影响。图6为应用本发明的组装试纸条，并进行的转bar基因水稻和阴性水稻的检测结果。表明该试纸条可用于免疫层析法检测转bar基因植物材料。
权利要求
1.一种快速检测植物中抗除草剂转基因成分的胶体金试纸，其特征在于由底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、单克隆抗体金标垫、上样垫组成；底板中部粘贴硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条检测线和一条控制线，底板一端粘贴单克隆抗体金标垫和上样垫，另一端粘贴吸水垫，其中，单克隆抗体金标垫一末端搭接硝酸纤维素膜的一末端，另一末端搭接上样垫的一末端，硝酸纤维素膜的另一末端搭接吸水垫一末端。
2.根据权利要求I所述的快速检测植物中抗除草剂转基因成分的胶体金试纸，所述抗除草剂转基因是转bar/pat基因。
3.根据权利要求I或2所述的一种快速检测植物中抗除草剂转基因成分的胶体金试纸，其特征在于控制线是由羊抗鼠多克隆抗体包被制成。
4.根据权利要求I或2所述的快速检测植物中抗除草剂转基因成分的胶体金试纸，其特征在于检测线是由PAT蛋白单克隆抗体包被制成，该PAT蛋白单克隆抗体由保藏号为CGMCC No. 6341的杂交瘤细胞株分泌。
5.根据权利要求I或2所述快速检测植物中抗除草剂转基因成分的胶体金试纸，其特征在于金标垫是由PAT蛋白单克隆抗体作胶体金标记，该PAT蛋白单克隆抗体由保藏号为CGMCC No. 6341的杂交瘤细胞株分泌。
6.根据权利要求4所述快速检测植物中抗除草剂转基因成分的胶体金试纸，其特征在于金标垫是由PAT蛋白单克隆抗体作胶体金标记，该PAT蛋白单克隆抗体由保藏号为CGMCCNo. 6341的杂交瘤细胞株分泌。
7.根据权利要求I所述的快速检测植物中抗除草剂转基因成分的胶体金试纸，其特征在于吸水纸用双层吸水纸。
8.权利要求I或2所述的快速检测植物中抗除草剂转基因成分的胶体金试纸在抗除草剂转基因植物检测中的用途。
9.权利要求I或2所述的快速检测植物中抗除草剂转基因成分的胶体金试纸在抗以L-phosphiothricin为活性成分的除草剂的转基因植物检测中的用途。
10.权利要求I或2所述的快速检测植物中抗除草剂转基因成分的胶体金试纸在转基因食品检测中的用途。
11.权利要求I或2所述的快速检测植物中抗除草剂转基因成分的胶体金试纸在抗以L-phosphiothricin为活性成分的除草剂的转基因食品检测中的用途。
12.权利要求I或2所述的快速检测植物中抗除草剂转基因成分的胶体金试纸在检测转bar/mi基因植物中的用途。
13.权利要求I或2所述的快速检测植物中抗除草剂转基因成分的胶体金试纸在检测转bar/mi基因食品中的用途。
14.一种转基因检测试剂盒，其特征在于包含权利要求I或2所述的快速检测植物中抗除草剂转基因成分的胶体金试纸。
15.如权利要求14所述的检测试剂盒，所述转基因为转如r/PAT基因。
全文摘要
本专利利用自主知识产权的bar/pat单克隆抗体和胶体金标记技术，平行移动免疫亲和层析一步法，快速检测样本中PAT蛋白的特异性检测试条。本发明采用的克隆抗体由杂交瘤细胞4C2分泌，其保藏编号为CGMCCNo.6341。检测试条包括:高蛋白亲和性的纤维素膜作为系统反应的载体和显示反应结果，样本垫吸取待检测样本并为反应系统提供适合的反应条件，胶体金垫为胶体金标记抗体的固相载体，吸水垫吸收检测后的样本，塑料基板作为反应体系的支撑板，不同规格的双面和单面胶带用于固定各反应膜和吸水材料于支撑板上，透明保护胶带用于固定和保护样本垫和胶体金垫，彩色标志胶带作为该检测试条的特征标识。本发明的免疫胶体金试纸，可为判定待检测样本是否含转基因植物样本(转bar/pat基因)提供直接证据，对转基因筛选和转基因安全评价，具有较为广泛的应用价值。
文档编号G01N33/558GK102879574SQ20121040440
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者龙丽坤, 李飞武, 张明, 王月华 申请人:吉林省农业科学院, 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司