专利名称：一种检测莱克多巴胺的方法及其专用化学发光免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测莱克多巴胺的方法及其专用化学发光免疫试剂盒。
背景技术：
目前动物性食品安全已成为全世界关注的焦点，其中兽药残留问题是影响动物 性食品安全的最主要因素之一，由于动物样本成分复杂，待测物浓度较低，而且大多数取 样量很少，这就对分析方法的选择性和灵敏度提出了更高的要求。化学发光免疫分析 (Chemiluminescence analysis,CL1A)技术将高灵敏的化学发光技术与高特异性的免疫反 应结合起来，具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、不需要十分昂贵的仪器设备 等特点。CLIA不需要外来光源，具有比荧光免疫分析更高的信噪比，比常规的酶联免疫吸附 检测方法的抗背景干扰能力强，其灵敏度比ELISA高1至2个数量级，检测范围可达6个数 量级，自动化程度高，提高了分析方法的精密度，CLIA已经成为一种先进的痕量或超痕量物 质的检测技术。CLIA在兽医学、医学、食品分析等方面将会有更广阔的应用前景。莱克多巴胺(Ractopamine，RAC)是一种苯乙醇胺类β -肾上腺素受体激动剂，具 有松弛支气管平滑肌的作用，主要用于治疗猪、牛等的支气管哮喘等疾病。当使用量为临床 治疗剂量的5-10倍时，具有促进蛋白质合成和脂肪分解的作用，可显著体高胴体瘦肉率和 饲料报酬，且对猪的饲养效应尤为明显。但是，莱克多巴胺毒副作用较大，当累计摄入量超 过一定值时，会导致人、畜肌肉震颤、心动过速、心律失常等中毒症状，欧盟和中国等国家均 禁止其作为饲料添加剂使用，但在畜牧生产上的常有非法应用的情况，导致其在畜禽产品 中残留，�：诮】�。动物组织中莱克多巴胺残留的检测方法主要采用气相色谱法、液相色谱法、气相 色谱_质谱法、液相色谱_联质谱法、酶联免疫法等。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测莱克多巴胺的方法及其专用化学发光免疫试剂盒。本发明提供的检测莱克多巴胺的化学发光免疫试剂盒，包括莱克多巴胺特异性抗 体、包被原和标准品溶液；所述包被原为莱克多巴胺半抗原与载体蛋白的偶联物，其结构式 所述试剂盒还包括发光液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标 抗抗体；所述试剂盒由莱克多巴胺特异性抗体、包被原、标准品溶液、发光液、浓缩洗涤液、 浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标抗抗体组成。
所述莱克多巴胺特异性抗体为莱克多巴胺单克隆抗体或莱克多巴胺多克隆抗体， 所述莱克多巴胺单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No. 3776的对莱克多巴胺的单克隆杂交瘤 细胞株RAC分泌的抗体。所述标准品溶液中标准品的浓度为0 μ g/L、0. 1 μ g/L、0. 5 μ g/L、1 μ g/L、10 μ g/L 或100 μ g/L，所述标准品为莱克多巴胺；所述发光液由A液和B液组成，发光液A液为过氧化氢；发光液B液为鲁米诺溶 液；所述浓缩洗涤液是将0. 05g叠氮化钠和IOOmL浓度为0. 02M、pH为7. 4的磷酸盐 缓冲液混合得到溶液；所述浓缩复溶液是将0. Ig牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 05mol/L、pH为7. 4的 磷酸盐缓冲液混合得到的溶液；所述包被缓冲液是pH值为9. 6的浓度为0. 03mol/L的碳酸盐缓冲液。所述封闭液是将0. Olg叠氮化钠、IOg牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 03mol/L、 PH值为7. 4磷酸盐溶液混合得到的溶液。所述包被原是按照如下方法制备得到的所述包被原是按照如下方法制备得到 的1、将每34mg莱克多巴胺半抗原、15mg琥珀酸酐、2mL 二甲基甲酰胺和ImL吡啶混合， 25°C搅拌12小时，将得到的产物干燥，得到残留物；II、将26. 2μ L三乙胺与所述残留物 混合，得到混合物，将混合物在0°C条件下搅拌IOmin ；III、向步骤II得到的产物中加入 15 μ L氯甲酸异丁酯，25°C搅拌lh，得到的产物溶液记作溶液A ；IV、将40mg载体蛋白溶于IOmL 0. 1Μ、ρΗ 8. 5的硼酸钠溶液中，得到的产物溶液记 作溶液B ；V、将溶液A加入到溶液B中，25°C下反应12小时，将得到的产物透析，得到所述包 被原；所述莱克多巴胺半抗原的结构式如式II所示 所述莱克多巴胺半抗原为莱克多巴胺。所述载体蛋白为鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白，优选为卵清 蛋白；所述酶标记抗抗体为酶标记羊抗鼠抗抗体。本发明的另一个目的是提供一种检测莱克多巴胺的方法。本发明提供的方法包括以下步骤1)样品前处理将每2g动物组织勻浆，与IOmL甲醇混合，旋涡振荡lmin，以3000g的速度离心 5min，将ImL上清液氮气干燥，再加入ImL复溶液溶解，再向其中加入ImL正己烷混合，3000g离心5min，取下层溶液即为待测样本溶液；所述动物组织为猪肉或者猪肝；或取每IOmL猪尿以3000g离心5min，取上清液，用复溶液稀释10倍后获得待测 样本溶液；所述复溶液为将所述浓缩复溶液用0. 05mol/L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液稀释 10倍得到的；2)利用上述的检测莱克多巴胺的化学发光免疫试剂盒检测步骤1)中的样本溶液。由保藏号为CGMCC No. 3776的对莱克多巴胺的单克隆杂交瘤细胞株RAC分泌的莱 克多巴胺单克隆抗体也是本发明保护的范围。保藏号为CGMCC No. 3776的对莱克多巴胺的单克隆杂交瘤细胞株RAC也是本发明 保护的范围。该细胞株为对莱克多巴胺的单克隆杂交瘤细胞株RAC，均于2010年4月12 日保藏保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号 为CGMCC NO. 3776。莱克多巴胺的通用名称为莱克多巴胺，化学名称为4-[3-[2_羟基-2_(4-羟基苯 基)-乙基]氨基丁基]苯酚盐酸盐。本发明的实验证明，本发明制备的化学发光免疫试剂盒主要采用间接竞争CLIA 方法定性或定量检测莱克多巴胺的残留量，该试剂盒的主要内容物采用了方便使用的工作 液形式，工作液保存性及稳定性好；利用本发明试剂盒检测莱克多巴胺的残留量的方法，可 用于检测动物组织如猪肉、猪肝、猪尿等样品中莱克多巴胺的残留量，具有样品前处理过程 简单、操作简便、费用低廉、特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，能够现场监控且适合大 量样本的筛查。因此本发明检测方法及其专用试剂盒将在动物源性食品中莱克多巴胺的残 留检测中发挥重要作用。
图1为莱克多巴胺标准曲线图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中各试剂盒的检测原理如下当在化学发光板微孔上预包被莱克多巴胺半抗原与载体蛋白的偶联物时，加入样 本溶液或标准品溶液后，再加入莱克多巴胺抗体溶液，样本中残留的莱克多巴胺或莱克多 巴胺标准品与化学发光板上包被的莱克多巴胺偶联抗原竞争莱克多巴胺抗体，加入酶标记 抗抗体进行放大作用，加入发光液反应，样本发光强度值与样本中莱克多巴胺的含量成负 相关，与标准曲线比较即可得出样本中莱克多巴胺的残留量。实施例1、化学发光免疫试剂盒的制备及其检测方法一、化学发光免疫试剂盒包括(1)将包被原溶解于包被缓冲液中得到的，其中包被原在包被原溶液中的浓度为0. 08μ g/mL ；包被原为莱克多巴胺半抗原与卵清蛋白的偶联物。(2)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液用稀释液稀释辣根过氧化物酶 标记的羊抗鼠抗抗体得到的，稀释度为1 1000;稀释液为50mL牛血清白蛋白和950mL磷酸盐缓冲液混合得到；所述磷酸盐缓冲液 的浓度为0. 02M, pH值为7.4。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体购自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.产品目录号为 115-035-003。(3)莱克多巴胺标准品溶液将标准品溶于稀释液中得到的，其中标准品在莱克 多巴胺标准品溶液的浓度分别为O μ g/L，0. 1 μ g/L，0. 5 μ g/L，1 μ g/L，10 μ g/L，100 μ g/ L，稀释液为pH7.4、0.05M的磷酸盐缓冲液。莱克多巴胺标准品为莱克多巴胺，购自 Dr. Ehrenstorfer GmbH，产品货号为 C 16805000。(4)发光液发光液由A液和B液组成，发光液A液为过氧化氢，SmL/瓶，1瓶；发 光液B液为鲁米诺溶液，SmL/瓶，1瓶。(5)莱克多巴胺单克隆抗体工作液将单抗溶于稀释液中得到的，单抗与稀释液 的配比为1 2000。单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No. 3776的对莱克多巴胺的单克隆杂 交瘤细胞株RAC产生。稀释液为25g酪蛋白、0. 03g叠氮化钠和IOOOmL磷酸盐缓冲液混合得到。(6)浓缩洗涤液将0. 05g叠氮钠化钠与IOOmL浓度为0. 02M、pH为7. 4的磷酸盐 缓冲液混合得到。(7)浓缩复溶液将0.^牛血清白蛋白与1001^浓度为0.0511101/1、？!1值为7.4 的磷酸盐缓冲液混合而成。400mL/瓶，1瓶。(8)包被缓冲液pH值为9. 6的浓度为0. 03mol/L的碳酸盐缓冲液。(9)封闭液将0. Olg叠氮化钠、IOg牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 03mol/L、pH 值为7. 4的磷酸盐溶液混合而成。二、试剂盒的制备1、化学发光板的制备(1)莱克多巴胺半抗原莱克多巴胺结构中含有羟基，可以与载体蛋白质直接偶联，因此不用进行结构改 造，可以直接作为半抗原。所述莱克多巴胺半抗原的结构式如式II所示 (2)包被原的制备采用琥珀酸酐法将莱克多巴胺半抗原和卵清蛋白偶联得到包 被原。a、将34mg莱克多巴胺、15mg琥珀酸酐、2mL 二甲基甲酰胺和ImL吡啶混合，25°C下搅拌12小时，同时进行氮吹；再向残留物中加入26. 2μ L三乙胺得到混合物，将混合物在 0°C条件下搅拌IOmin ；然后加入15 μ L氯甲酸异丁酯，25°C搅拌lh，得到活化RAC溶液；b、将活化RAC溶液逐滴加入到预先冷冻的蛋白溶液，置于25°C下反应12小时，然 后在浓度为0. 1M、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中透析3天，得到包被原，所述蛋白溶液为将 40mg卵清蛋白OVA溶于IOmL浓度为0. 1M、pH为8. 5的硼酸钠溶液得到的蛋白溶液。用包被缓冲液将步骤(2)得到的包被原(即莱克多巴胺半抗原(莱克多巴胺)和 卵清蛋白偶联物)稀释成0. 08μ g/mL，每孔加入100μ 1，37°C温育2h，倾去包被液，用稀释 20倍的洗涤液洗涤2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150 μ 1封闭液，37°C温育lh， 倾去孔内液体，干燥后获得包被有包被原的化学发光板，用铝膜真空密封保存。所述包被原为莱克多巴胺半抗原与载体蛋白的偶联物，其结构式如式I所示 2、莱克多巴胺单克隆抗体的制备(1)免疫原合成将莱克多巴胺半抗原和牛血清白蛋白通过琥珀酸酐法偶联得到免疫原。具体制备过程如下与包被原的制备方法相同，不同的是将卵清蛋白替换为牛血 清白蛋白BSA。(2)动物免疫与细胞融合采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以步骤2的(1)获得的免疫原进行免疫，免疫剂 量为IOOyg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多 点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四 免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。取免疫BALB/c小鼠脾细胞，按5 1比例(数量配比)与SP2/0骨髓瘤细胞(融 合。采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克 隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为RAC。经筛选得到能稳定分泌莱克多巴胺单克隆抗体的对莱克多巴胺的单克隆杂交瘤 细胞株RAC，已于2010年4月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称CGMCCJia 北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号 为 CGMCC No. 3776。(3)细胞冻存和复苏将上述单克隆杂交瘤细胞株RAC CGMCC No. 3776用冻存液 制成5X IO6个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立 即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。(4)单克隆抗体的制备与纯化增量培养法将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用下述 辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20°C保存。所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠得到的细胞 培养基，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20% (体积百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2% (质量百分含量)；所述细胞培养基的PH为7. 4。辛酸-饱和硫酸铵法1) 50 %饱和度盐析取上述细胞培养液5mL，加等量 0. 01mol/L、pH7. 4的PBS (1L溶液中含有磷酸二氢钾0. 27g，12水合磷酸氢二钠2. 86g，氯化 钾0. 2g，氯化钠8. Sg)混勻，然后逐渐滴加等体积的饱和硫酸铵(pH7. 4)溶液(使硫酸铵溶 液的饱和度达到50% )，边加边搅拌，室温放置30min，3000g离心30min，弃上清液留沉淀。 2)33%饱和度盐析在步骤1)得到的沉淀中分别加入5mL 0. Olmol/LPBS (1L溶液中含有磷 酸二氢钾0. 27g，12水合磷酸氢二钠2. 86g，氯化钾0. 2g，氯化钠8. 8g)溶解沉淀，再加饱和 硫酸铵溶液达到33%饱和度，边加边搅拌，室温放置30min，弃上清液留沉淀。重复操作2 次。3)脱盐取0. 01mol/L、pH7. 4的PBS (1L溶液中含有磷酸二氢钾0. 27g，12水合磷酸氢 二钠2. 86g，氯化钾0. 2g，氯化钠8. Sg)溶解步骤2)得到的沉淀，装于透析袋中，悬于盛有 0. 01mol/L、pH7. 4的PBS (1L溶液中含有磷酸二氢钾0. 27g，12水合磷酸氢二钠2. 86g，氯化 钾0. 2g，氯化钠8. Sg)的烧杯中脱盐，放置于4°C，每天换液3-4次，BaCl2检测直至透 析液中无硫酸根离子为止。4)透析完毕，3000g离心5min，取上清液得到纯化的莱克多巴胺 单克隆抗体，_20°C冰箱保存。三、用步骤一所述试剂盒检测样品中残留的莱克多巴胺的方法方法如下1、样品前处理样品为猪肉、猪肝、猪尿等样本。将2g动物组织勻浆，与IOmL甲醇混合，旋涡振荡lmin，以3000g的速度离心5min， 将ImL上清液氮气干燥，再加入ImL复溶液溶解，再向其中加入ImL正己烷混合，3000g离心 5min，取下层溶液即为待测样本溶液；进行试验分析。或取IOmL猪尿以3000g离心5min，取200 μ 1上清液，用复溶液稀释10倍后获得 待测样本溶液；进行试验分析；所述复溶液为将所述浓缩复溶液用0. 05mol/L、pH值为7. 4 的磷酸盐缓冲液稀释10倍得到的。2、检测向步骤一获得的包被有包被原(莱克多巴胺半抗原与卵清蛋白偶联物)的化学发 光板微孔中加入莱克多巴胺标准品溶液或样本溶液50 μ 1，再加入莱克多巴胺单克隆抗体 工作液50μ 1，用盖板膜封板，37°C恒温箱中反应30min ；倒出孔中液体，每孔加入250 μ 1洗 涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干；每孔加入辣根过氧 化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液IOOmL, 37°C恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复 洗涤步骤；每孔加入发光液A液过氧化氢，发光液B液鲁米诺溶液，用化学发光免疫分析仪， 测定每孔发光强度值。3、结果分析用所获得的每个浓度的标准品溶液的发光强度平均值(B)除以第一个标准溶液 (0标准)的发光强度值(BO)再乘以100%，即百分发光值。计算公式为百分发光值(％) = (B/BO) X 100%以莱克多巴胺标准品溶液的浓度(μ g/L)的半对数值为X轴，百分发光值为Y轴， 绘制标准曲线图(图1)。用同样的办法计算样品溶液的百分发光值，相对应每一个样品的 浓度则可从标准曲线上读出样本中莱克多巴胺的残留量。本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业 软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程只需1. 5小时可以完成。按照上述方法获得三批试剂盒(01批、02批、03批)。实施例2、试剂盒灵敏度、准确度和保存期试验一、试剂盒灵敏度实验对零标准溶液(即稀释液为pH7. 4、0. 05M的磷酸盐缓冲液)进行20次检测，测定 结果的平均值加上3倍标准差作为试剂盒的最低检测限。表1零标准测定结果统计表μ g/L 由表1可知，试剂盒的最低检测限为0. 1 μ g/L。二、标准品精密度试验从实施例1中所述的三批试剂盒(01批、02批、03批)中每批抽取10个试剂盒，
测定ι μ g/L标准品溶液的发光强度值，计算变异系数。检测方法与实施例ι中实验三所述一致。实验设3次重复，结果如表2所示，表明变异系数范围在5. 2% 15. 之间，符 合精密度小于或等于20%的规定。表2标准可重复性试验(CV % ) - 三、样本精密度和准确度试验1、样品精密度试验将不含莱克多巴胺的猪肉、猪肝、猪尿按照实施例1的方法进行样品前处理后，添 加莱克多巴胺标准品，使其在检测样品中的终浓度为2μ g/kg。从实施例1中所述的三批 试剂盒(01批、02批、03批)中每批抽取3个试剂盒，进行实验，每个实验重复5次，分别计 算变异系数，结果如表3-5所示(各表中的数值为5次重复的平均值)。结果表明猪肉、猪 肝、猪尿样本的变异系数均小于20%，符合了《农业部文件》农医发200517号附件2试 剂盒备案参考评判标准中第四点精密度和准确度的精密度标准。表3猪肉样本可重复性试验
表4猪肝样本可重复性试验
表5猪尿样本可重复性试验
2、样本准确度试验将不含莱克多巴胺的猪肉、猪肝、猪尿按照实施例1中所述的样品前处理方法进 行处理，然后向每种组织中加入莱克多巴胺标准品溶液，使其终浓度分别为5μ g/kg(L)和 20yg/kg(L)；然后用实施例1中所述的试剂盒检测猪肉、猪肝、猪尿中莱克多巴胺，每个浓 度做4个平行，分别计算准确度(准确度=实测值/添加值)。结果如表6所示，表明各样 本以5μ g/kg(L)、20y g/kg(L)莱克多巴胺添加回收率均在65. 2% -87. 8%之间。表6试剂盒的准确度 四、交叉反应率试验选择与莱克多巴胺有类似结构和类似功能的7种药物测定交叉反应率。通过各种 药物的标准曲线分别得到其50%抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反应率。 交叉反应越�。敲创耸约梁卸岳晨硕喟桶返募觳馓匾煨跃驮胶�。交叉反应率(％)=(抑制50%莱克多巴胺的浓度/抑制50%的莱克多巴胺类似 物浓度)* 100%表7试剂盒的特异性 实验结果表明，本发明所研制的试剂盒对莱克多巴胺的特异性好。五、试剂盒保存期试验试剂盒保存条件为2_8°C，保存6个月后，测定试剂盒的50%抑制浓度、莱克多巴 胺实际添加测定，结果表明试剂盒的50%抑制浓度均在正常范围之内。考虑在运输和使用 过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37°C保存的条件下放置6天，进行加速老化 实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放 入-20°C冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂 盒可以在2-8°C至少可以保存6个月以上。
权利要求
一种检测莱克多巴胺的化学发光免疫试剂盒，包括莱克多巴胺特异性抗体、包被原和标准品溶液；所述包被原为莱克多巴胺半抗原与载体蛋白的偶联物，其结构式如式I所示(式I)。FSA00000216102600011.tif
2.根据权利要求1所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括发光 液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标抗抗体；所述试剂盒由莱克多巴胺特异性抗体、包被原、标准品溶液、发光液、浓缩洗涤液、浓缩 复溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标抗抗体组成。
3.根据权利要求1或2所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述莱克多巴胺特 异性抗体为莱克多巴胺单克隆抗体或莱克多巴胺多克隆抗体，所述莱克多巴胺单克隆抗体 是由保藏号为CGMCC No. 3776的对莱克多巴胺的单克隆杂交瘤细胞株RAC分泌的抗体。
4.根据权利要求1-3中任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述标准品溶液中标准品的浓度为ο μ g/L、0. 1 μ g/L、0. 5 μ g/L、l μ g/LUO μ g/L或 100 μ g/L，所述标准品为莱克多巴胺；所述发光液由A液和B液组成，发光液A液为过氧化氢；发光液B液为鲁米诺溶液； 所述浓缩洗涤液是将0. 05g叠氮化钠和IOOmL浓度为0. 02M、pH为7. 4的磷酸盐缓冲 液混合得到溶液；所述浓缩复溶液是将0. Ig牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 05mol/L、pH为7. 4的磷酸 盐缓冲液混合得到的溶液；所述包被缓冲液是PH值为9. 6的浓度为0. 03mol/L的碳酸盐缓冲液。 所述封闭液是将0. Olg叠氮化钠、IOg牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 03mol/L、pH值 为7. 4磷酸盐溶液混合得到的溶液。所述酶标抗抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体。
5.根据权利要求1-4中任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述包被原是按照如下方法制备得到的1、将每34mg莱克多巴胺半抗原、15mg琥珀酸 酐、2mL 二甲基甲酰胺和ImL吡啶混合，25°C搅拌12小时，将得到的产物干燥，得到残留物；II、将26.2μ L三乙胺与所述残留物混合，得到混合物，将混合物在0°C条件下搅拌IOmin ；III、向步骤II得到的产物中加入15μ L氯甲酸异丁酯，25°C搅拌lh，得到的产物溶液记作 溶液A ；IV、将40mg载体蛋白溶于IOmL0. 1Μ、ρΗ 8. 5的硼酸钠溶液中，得到的产物溶液记作溶 液B ；V、将溶液A加入到溶液B中，25°C下反应12小时，将得到的产物透析，得到所述包被原；所述莱克多巴胺半抗原的结构式如式II所示
6.根据权利要求1-5中任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述莱克多巴胺半抗原为莱克多巴胺。
7.根据权利要求1-6任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述载体蛋白为鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白，优选为卵清蛋白。
8.—种检测莱克多巴胺的方法，包括以下步骤1)样品前处理将每2g动物组织勻浆，与IOmL甲醇混合，旋涡振荡lmin，以3000g的速度离心5min， 将ImL上清液氮气干燥，再加入ImL复溶液溶解，再向其中加入ImL正己烷混合，3000g离心 5min，取下层溶液即为待测样本溶液；所述动物组织为猪肉或者猪肝；或取每IOmL猪尿以3000g离心5min，取上清液，用复溶液稀释10倍后获得待测样本 溶液；所述复溶液为将所述浓缩复溶液用0. 05mol/L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液稀释10倍 得到的；2)利用权利要求1-7中任一所述的检测莱克多巴胺的化学发光免疫试剂盒检测步骤 1)中的样本溶液。
9.由保藏号为CGMCCNo. 3776的对莱克多巴胺的单克隆杂交瘤细胞株RAC分泌的莱克 多巴胺单克隆抗体。
10.保藏号为CGMCCNo. 3776的对莱克多巴胺的单克隆杂交瘤细胞株RAC。
全文摘要
本发明公开了一种检测莱克多巴胺的方法及其专用化学发光免疫试剂盒。本发明提供的检测莱克多巴胺的化学发光免疫试剂盒，包括莱克多巴胺特异性抗体、包被原和标准品溶液；所述包被原为莱克多巴胺半抗原与载体蛋白的偶联物。本发明的检测方法，具有样品前处理过程简单、操作简便、费用低廉、特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，能够现场监控且适合大量样本的筛查。
文档编号G01N21/76GK101915845SQ201010244260
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月3日 优先权日2010年8月3日
发明者史为民, 吴聪明, 张素霞, 曹兴元, 汤树生, 沈建忠, 王战辉, 程林丽 申请人:中国农业大学
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