专利名称：紫外分光光度法检测人免疫球蛋白Fc段生物学活性的方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及ー种廉价且微量检测血液制品人免疫球蛋白Fe段生物学活性的方法，即用紫外分光光度法检测人免疫球蛋白Fe段生物学活性的方法。
背景技术：
人免疫球蛋白G (Human Immunoglobulin G, IgG),抗体分子,在血衆免疫球蛋白中占75%,由血衆B细胞合成和分泌。免疫球蛋白Fe片段(Fragment crystallizableregion)，是细胞表面受体和某些补体系统蛋白相互作用的抗体尾部区域部分，能激活免疫系统，与IgG的药物有效性相关。生产过程中的纯化、病毒灭活、超滤、过滤，以及制品存放 都能够导致IgG分子生物活性降低和退化。主要表现为IgG的Fe功能改变，并最终导致抗体活性包括中和病毒、细菌和毒素(白喉、破伤风)及调理作用和诱发吞噬作用衰减。—般通过特异性抗体(免疫球蛋白)Fab段与红细胞上已包被的相应抗原结合，抗体暴露出Fe段补体Clq的结合位点，从而激活后续的补体各成分，最终导致红细胞的细胞膜受到攻击、破裂，释放出血红蛋白。通过溶血反应动力学曲线，计算IgG激活补体活性的功能指数(IF。)，以此測定IgG供试品Fe段生物学活性。据统计，2011年我国各种IgG制品市场销售额占血液制品总额的约50%，大于60亿元。2008-2011年，我国血液制品各种IgG市场批发供应量大于5100万瓶，但是对于IgG的Fe段生物学活性測定暂时还未开展。IgG的最主要的生物学功能是对微生物的调理作用，正常的调理作用需要IgG能识别吞噬细胞表面Fe受体，这首先要求IgG要有完整的Fe段功能，与微生物特异结合的抗体(Fab)通过IgG完整的Fe段与吞噬细胞的受体相结合，形成抗原-抗体-吞噬细胞的连锁结合，促成吞噬细胞对微生物的接触及吞噬(调理作用)。IgG对自身免疫性疾病的免疫调节机制也往往通过Fe片段来完成，包括效应细胞Fe受体的竞争性抑制、抑制性Fe Y R II B受体的诱导及FcRn受体饱和作用等。目前文献报道的方法无论从检测成本还是检测通量都不适合实现IgG的Fe段生物学活性測定可行性和普及性。现行IgG的Fe段生物学活性測定情况，例如《欧洲药典7. O》用风疹抗原和鞣酸化的压积红细胞制备敏化红细胞用于IgG的Fe生物学活性检测，该法要求风疹抗原凝血単位要求大于256个单位，而浓缩的风疹抗原国内难以购买，国外产品Aalto Bio AW6088风疹病毒抗原Img价格大约是15000人民币，其检测成本非常惊人；《2010版中华人民共和国药典》用白喉类毒素或腮腺炎病毒鞣酸化的压积红细胞用于IgG生物学活性检测，该法缺点ー是没有办法提高检测通量只能单个样品检测，浪费人力和物力，不利于IgG活性检测的普及；缺点ニ是白喉类毒素使用和购买存在原料试剂来源的问题，而腮腺炎病毒使用需要安全级别BSL-2生物安全实验室，对于专业技术操作和实验室硬件条件要求较高，也不利于IgG的Fe段生物学活性检测的普及；2000年RamasamyI等发现了流式细胞方法评估IgG的Fe片段功能活性检测，对于专业技术操作和实验室硬件条件要求较高，也不利于IgG的Fe段生物学活性检测的普及；2004年Vrdoljak A等用破伤风类毒素作为抗原代替难以获得的高滴度的风疹病毒抗原，測定IgG制剂Fe段生物学功能的方法；2009年Georgakopoulos T等用冰冻的红细胞代替,需要连续的新鲜人红细胞测定IgG制剂Fe段生物学功能的方法；2012年，Georgakopoulos T等用Kodecyte技术将CMV抗原包被到红细胞上，得到标准化制备敏化红细胞，用于快速检测IgG制剂Fe段的方法。以上各种方法在敏化红细胞的病毒抗原标记和IgG的Fe段生物学活性检测通量方面均作了不同程度的探索，但是均未能成功建立一种廉价且高通量检测IgG的Fe段生物学活性的方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术和方法所存在的上述不足比如检测成本偏高，检测通量偏低或者检测方法专业性强，本发明提供一种廉价微量紫外分光光度法量检测IgG Fe段生物学活性的方法。
其技术方案为
紫外分光光度法检测人免疫球蛋白Fe段生物学活性的方法，包括敏化红细胞的抗原选择；检测仪器选择；数据处理；
上述敏化红细胞抗原选择用百白破联合疫苗替代，具体步骤如下
I.敏化红细胞的制备
A液，取健康人抗凝0型血3人份以上混合，用PBS缓冲液洗涤3次，最后一次以每分钟2000转离心10分钟分离红细胞。取适量积压红细胞悬浮于I. 3mg/L鞣酸PBS缓冲液中，溶液的体积比为1:40，置于37°C水浴中轻摇30分钟后再用PBS缓冲液洗涤3次，最后用PBS缓冲液制备成体积百分数为2. 5%红细胞悬浮液；
B液，用吸附无细胞百白破联合疫苗与体积百分数为1%氯化铬溶液0. 25ml混合，溶液的体积比为10:1，混合后，置于37°C水浴中轻摇15分钟；
将A液、B液按体积比1:4混合，置于37°C水浴中轻摇30分钟；离心，去上清液，用PBS缓冲液将沉淀的敏化红细胞洗涤3次，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将悬浮红细胞溶液调节至适宜浓度即使其在波长541nm处的吸光度为1.0±0. I。2.參考品和供试品溶液的制备
用0. 5mol/L氢氧化钠溶液将參考品和样品pH调节至6. 8 7. 0，再用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将供试品IgG浓度稀释至每Iml含40mg蛋白含量(根据溶液实际情况操作)。3.测定法
用GE公司Ultrospec 6300pro紫外/可见光分光光度计或相同精度水平的紫外/可见光分光光度测定取供试品溶液0. 45ml，加入敏化红细胞悬液0. 050ml，混匀，置于37°C水浴中轻摇30分钟。离心，去上清液，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液Iml洗涤红细胞，共洗3次。末次离心后弃上清液400 iil，向沉淀中加入300 ill预热到37°C的牛白蛋白-巴比妥缓冲液，充分混匀，2分钟后再加入已稀释至每Iml含150 units的CH5tl (血清总补体活性)的豚鼠补体100 yl，混匀后立即照紫外-可见光分光光度法在波长541nm处测定起始吸光度(As)，启动SWIFT II反应动カ曲线测定软件swftrk. exe，每隔I分钟测定I次，既得供试品在波长541nm处的吸光度与时间的溶血反应动力学曲线。当吸光度越过了曲线的内曲点后即可停止測量。參考品及阴性对照(牛白蛋白-巴比妥缓冲液)可平行操作，根据GE公司Ultrospec 6300pro仪器检测通量,一次可实现处理8个样品。按公式(I)分别计算出參考品、供试品和阴性对照曲线斜率。按公式(2)计算供试品激活补体的功能指数(IF。)S，=Sexp/As (I)
IFc=100%X [(S/ -Sc，)/ (Sr，-Sc，)] (2)
公式中S’为用As修正Sexp得到的曲线斜率；
.........As分别为供试品、參考品及阴性对照在波长541nm处测定的起始吸光度；
............Sraip分别为根据供试品、參考品及阴性对照各自的溶血反应动力学曲线分别
计算出相邻3点间的曲线最大斜率；
Ifc为供试品激活补体的功能指数；
S/为供试品曲线斜率；
S。’为阴性对照曲线斜率；
S/为參考品曲线斜率。上述紫外分光光度法检测人免疫球蛋白Fe段生物学活性的方法，检测仪器选择，所述样品检测用GE公司Ultrospec 6300pro紫外/可见光分光光度计或相同精度水平的紫外/可见光分光光度计来測定，替代普通紫外分光光度计单个样品的測定，实现检测通量最高达到8倍提升。上述的紫外分光光度法检测人免疫球蛋白Fe段生物学活性的方法，其特征在于，标记抗原选择用吸附无细胞百白破联合疫苗，标记抗原敏化浓度为1ml、敏化红细胞悬浮液用50 u I吸附无细胞百白破联合疫苗。上述的紫外分光光度法检测人免疫球蛋白Fe段生物学活性的方法，其特征在于，数据采集处理选用Ultrospec 6300pro软件SWIFT II,数据分析处理选用微软Officeexcel 2003o本发明的有益效果本发明的技术方案使现行IgG Fe段生物学活性測定，降低检测成本，缩短检测时间，检测通量从原来单个样品检测提高8倍，而且其检测结果和2010版第3部中华人民共和国药典附录X P人免疫球蛋白Fe段生物学活性測定法检测结果比较，本发明的检测结果在合理的理论范围内。在紫外分光光度法检测人免疫球蛋白活性的方法发明中，用吸附无细胞百白破联合疫苗替代欧洲药典7. 0提及的风疹抗原或2010版第3部中华人民共和国药典提及的白喉类毒素或腮腺炎病毒,用GE公司Ultrospec 6300pro紫外/可见光分光光度计或相同精度水平的紫外/可见光分光光度计替代通用型752紫外分光光度计，既能有效降低用于敏化红细胞标记抗原成本，又能提高IgG Fe段生物学活性检测的通量8倍。该方法有效降低检测成本，缩短样品检测时间，提高检测样品的通量，为实现人免疫球蛋白Fe段生物学活性測定可行性和普及性奠定基础。
图I通用型752紫外分光光度法和GE公司Ultrospec 6300pro紫外分光光度法比较 图2通用型752紫外分光光度法反应动カ曲线 图3 GE公司Ultrospec 6300pro紫外分光光度法反应动カ曲线图。
具体实施例方式下面结合具体附图和实施例对本发明的方法作进ー步详细地说明。实施例I :通用型752紫外分光光度法
I.敏化红细胞的制备
A液，取健康人抗凝0型血3人份以上混合，用PBS缓冲液洗涤3次，最后一次以每分钟2000转离心10分钟分离红细胞。取适量积压红细胞悬浮于I. 3mg/L鞣酸PBS缓冲液中，溶液的体积比为1:40，置于37°C水浴中轻摇30分钟后再用PBS缓冲液洗涤3次，最后用PBS缓冲液制备成体积百分数为2. 5%红细胞悬浮液；
B液，用吸附无细胞百白破联合疫苗与体积百分数为1%氯化铬溶液0. 25ml混合，溶液的体积比为10:1，混合后，置于37°C水浴中轻摇15分钟；
将A液、B液按体积比1:4混合，置于37°C水浴中轻摇30分钟；离心，去上清液，用PBS缓冲液将沉淀的敏化红细胞洗涤3次，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将悬浮红细胞溶液调节至适宜浓度即使其在波长541nm处的吸光度为1.0±0. I。2.參考品和供试品溶液的制备
用0. 5mol/L氢氧化钠溶液将參考品和样品pH调节至6. 8 7. 0，再用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将供试品IgG浓度稀释至每Iml含40mg蛋白含量(根据溶液实际情况操作)。3.测定法
通用型752紫外分光光度法取供试品溶液0. 9ml，加入敏化红细胞悬液0. 1ml，混匀，置于37°C水浴中轻摇30分钟。离心，去上清液，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液Iml洗涤红细胞，共洗3次。末次离心后弃上清液800 iil，向沉淀中加入600 ill预热到37°C的牛白蛋白-巴比妥缓冲液，充分混匀，2分钟后再加入已稀释至每Iml含150 units的CH5tl (血清总补体活性)的豚鼠补体200 yl，混匀后立即照紫外-可见光分光光度法在波长541nm处測定起始吸光度(As)，之后，每隔I分钟测定I次，既得供试品在波长541nm处的吸光度与时间的溶血反应动力学曲线。当吸光度越过了曲线的内曲点后即可停止測量。分别取參考品及阴性对照(牛白蛋白-巴比妥缓冲液)0. 9ml,自“加敏化红细胞悬液0. 1ml”起，同法操作。按公式(I)分别计算出參考品、供试品和阴性对照曲线斜率。按公式(2)计算供试品激活补体的功能指数(IF。)
S，=Sexp/As (I)
IFc=100%X [(S/ -Sc，)/ (Sr，-Sc，)] (2)
公式中S’为用As修正Sexp得到的曲线斜率；
As分别为供试品、參考品及阴性对照在波长541nm处测定的起始吸光度；
Sraip分别为根据供试品、參考品及阴性对照各自的溶血反应动力学曲线分别计算出相邻3点间的曲线最大斜率；
Ifc为供试品激活补体的功能指数；
S/为供试品曲线斜率；
S。’为阴性对照曲线斜率；
S/为參考品曲线斜率。
实施例2 =Ultrospec 6300pro紫外分光光度法，I.敏化红细胞的制备
A液，取健康人抗凝O型血3人份以上混合，用PBS缓冲液洗涤3次，最后一次以每分钟2000转离心10分钟分离红细胞。取适量积压红细胞悬浮于I. 3mg/L鞣酸PBS缓冲液中，溶液的体积比为1:40，置于37°C水浴中轻摇30分钟后再用PBS缓冲液洗涤3次，最后用PBS缓冲液制备成体积百分数为2. 5%的红细胞悬浮液；
B液，用吸附无细胞百白破联合疫苗与体积百分数为1%氯化铬溶液0. 25ml混合，溶液的体积比为10:1，混合后，置于37°C水浴中轻摇15分钟；
将A液、B液按体积比1:4混合，置于37°C水浴中轻摇30分钟；离心，去上清液，用PBS缓冲液将沉淀的敏化红细胞洗涤3次，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将悬浮红细胞溶液调节至适宜浓度即使其在波长541nm处的吸光度为1.0±0. I。
2.參考品和供试品溶液的制备
用0. 5mol/L氢氧化钠溶液将參考品和样品pH调节至6. 8 7. 0，再用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将供试品IgG浓度稀释至每Iml含40mg蛋白含量(根据溶液实际情况操作)。3.测定法
GE公司Ultrospec 6300pro紫外分光光度法取供试品溶液0. 45ml，加入敏化红细胞悬液0. 050ml，混匀，置于37°C水浴中轻摇30分钟。离心，去上清液，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液Iml洗涤红细胞，共洗3次。末次离心后弃上清液400 iil，向沉淀中加入300 U I预热到37°C的牛白蛋白-巴比妥缓冲液，充分混匀，2分钟后再加入已稀释至每Iml含150units的CHki (血清总补体活性)的豚鼠补体100 yl，混匀后立即照紫外-可见光分光光度法在波长541nm处测定起始吸光度(As)，启动SWIFT II反应动カ曲线测定软件swftrk. exe，每隔I分钟测定I次，既得供试品在波长541nm处的吸光度与时间的溶血反应动力学曲线。当吸光度越过了曲线的内曲点后即可停止測量。參考品及阴性对照(牛白蛋白-巴比妥缓冲液)可平行操作，根据GE公司Ultrospec 6300pi~O仪器检测通量，一次可实现处理8个样品。按公式(I)分别计算出參考品、供试品和阴性对照曲线斜率。按公式(2)计算供试品激活补体的功能指数(IF。)
S，=Sexp/As (I)
IFc=100%X [(S/ -Sc，)/ (Sr，-Sc，)] (2)
公式中S’为用As修正Sexp得到的曲线斜率；
As分别为供试品、參考品及阴性对照在波长541nm处测定的起始吸光度；
Sraip分别为根据供试品、參考品及阴性对照各自的溶血反应动力学曲线分别计算出相邻3点间的曲线最大斜率；
Ifc为供试品激活补体的功能指数；
S/为供试品曲线斜率；
S。’为阴性对照曲线斜率；
S/为參考品曲线斜率。4. GE公司Ultrospec 6300pro紫外分光光度法的验证
我们为了验证GE公司Ultrospec 6300pro紫外分光光度法可行性和准确性,一共做过三次实验，分别计算相关实验数据。通过通用型752紫外分光光度法数据和Ultrospec6300pro紫外分光光度法检测法数据比较，对我们新建实验方法可行性和准确性进行数学统计学分析。数据统计结果见表I。表I通用型752紫外分光光度法和Ultrospec 6300pro紫外分光光度法比较表
另外，我们计算通用型752测定数据和新发明三次测定结果均值求数据差值，并计算数据均差-1. 37% ;数据差值标准偏差-1. 28% ;数据差值方差0. 02%。新发明的检测结果在合理的理论范围内。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式
，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
权利要求
1.紫外分光光度法检测人免疫球蛋白Fe段生物学活性的方法，其特征包括敏化红细胞的抗原选择，检测仪器选择，数据处理；其中敏化红细胞抗原选择用百白破联合疫苗替代；具体步骤如下 (1).敏化红细胞的制备 A液，取健康人抗凝O型血3人份以上混合，用PBS缓冲液洗涤3次，最后一次以每分钟2000转离心10分钟分离红细胞；取适量积压红细胞悬浮于I. 3mg/L鞣酸PBS缓冲液中，溶液的体积比为1:40，置于37°C水浴中轻摇30分钟后再用PBS缓冲液洗涤3次，最后用PBS缓冲液制备成体积百分数为2. 5%的红细胞悬浮液； B液，用吸附无细胞百白破联合疫苗与体积百分数为1%氯化铬溶液O. 25ml混合，溶液的体积比为10:1，混合后，置于37°C水浴中轻摇15分钟； 将A液、B液按体积比1:4混合，置于37°C水浴中轻摇30分钟；离心，去上清液，用PBS 缓冲液将沉淀的敏化红细胞洗涤3次，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将悬浮红细胞溶液调节至适宜浓度即使其在波长541nm处的吸光度为I. 0±0. I : (2).参考品和供试品溶液的制备 用O. 5mol/L氢氧化钠溶液将参考品和样品pH调节至6. 8 7. 0，根据溶液实际情况操作时，再用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将供试品IgG浓度稀释至每Iml含40mg蛋白含量; (3)·测定法 用GE公司Ultrospec 6300pro紫外/可见光分光光度计或相同精度水平的紫外/可见光分光光度测定取供试品溶液O. 45ml，加入敏化红细胞悬液O. 050ml，混匀，置于37°C水浴中轻摇30分钟；离心，去上清液，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液Iml洗涤红细胞，共洗3次；末次离心后弃上清液400 μ 1，向沉淀中加入300μ I预热到37°C的牛白蛋白-巴比妥缓冲液，充分混匀，2分钟后再加入已稀释至每Iml含150 units的血清总补体活性CH5tl的豚鼠补体200 μ 1，混匀后立即照紫外-可见光分光光度法在波长541nm处测定起始吸光度As，启动SWIFT II反应动力曲线测定软件swftrk. exe,每隔I分钟测定I次，既得供试品在波长541nm处的吸光度与时间的溶血反应动力学曲线；当吸光度越过了曲线的内曲点后即可停止测量；参考品及阴性对照的牛白蛋白-巴比妥缓冲液可平行操作，根据GE公司Ultrospec 6300pro仪器检测通量,一次可实现处理8个样品；按公式(I)分别计算出参考品、供试品和阴性对照曲线斜率；按公式(2)计算供试品激活补体的功能指数IF。S，=Sexp/As (I)IFc=100%X [(S/ -Sc，)/ (Sr，-Sc，)] (2) 公式中S’为用As修正Sexp得到的曲线斜率；.........As分别为供试品、参考品及阴性对照在波长541nm处测定的起始吸光度； ............Sraip分别为根据供试品、参考品及阴性对照各自的溶血反应动力学曲线分别计算出相邻3点间的曲线最大斜率； Ifc为供试品激活补体的功能指数； S/为供试品曲线斜率； S。’为阴性对照曲线斜率； S/为参考品曲线斜率。
2.根据权利要求I所述的紫外分光光度法检测人免疫球蛋白Fe段生物学活性的方法，其特征是检测仪器选择，要求样品检测用GE公司Ultrospec 6300pro紫外/可见光分光光度计或相同精度水平的紫外/可见光分光光度计来测定，替代普通紫外分光光度计单个样品的测定，实现检测通量最高达到8倍提升。
3.根据权利要求I所述的紫外分光光度法检测人免疫球蛋白Fe段生物学活性的方法，其特征是标记抗原选择用吸附无细胞百白破联合疫苗，标记抗原敏化浓度为1ml、敏化红细胞悬浮液用50 μ I吸附无细胞百白破联合疫苗。
4.根据权利要求I所述的紫外分光光度法检测人免疫球蛋白Fe段生物学活性的方法，其特征检测过程中的数据采集、处理选用Ultrospec 6300pro软件SWIFT II,数据分析处理选用微软 Office excel 2003。
全文摘要
本发明公开了紫外分光光度法检测人免疫球蛋白Fc段生物学活性的方法，方法通过用吸附无细胞百白破疫苗替代成本高且不容易获得的标记抗原用于敏化红细胞，用GE公司Ultrospec6300pro紫外/可见光分光光度计于样品检测，及仪器自带软件做数据处理，本发明实验证明三次检测结果自身标准偏差范围0.06～15.92%，方差范围0.00～1.69%。紫外分光光度计结果和新发明三次检测平均值结果比较数据均差-1.37%；数据差值标准偏差-1.28%；数据差值方差0.02%，本发明的检测结果在合理的理论范围内，确是一种廉价且微量检测血液制品人免疫球蛋白Fc段生物学活性的方法。
文档编号G01N21/31GK102854160SQ20121031672
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者杨刚, 刘欣晏, 陈云华, 袁靖, 张学俊, 李长清 申请人:贵州泰邦生物制品有限公司, 中国医学科学院输血研究所
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