专利名称：以适体为识别单元的胶体晶体凝胶非标记可视化检测方法
技术领域：
本发明涉及一种非标记可视化检测方法，特别涉及一种以适体为识别单元的胶体晶体凝胶薄膜为载体的非标记可视化检测方法。
背景技术：
生物传感器是简单、快速、廉价的重要检测工具。在生物传感器的分子识别元件中，目前应用最为成熟的就是抗体。但抗体由于制备繁琐、成本高、耗时长、保存条件苛刻、 固定化易失活等缺点使其应用受到限制。探索新型高特异高稳定的分子识别物质，建立高选择性高灵敏的生物传感技术成为现代分析化学研究的前沿课题之一。随着人类基因组计划的完成及核酸研究的发展，特别是1990年美国科学家Tuerk和Ellington筛选出首个核酸适体，随后核酸适体及SELEX技术的快速发展，抗体技术受到了前所未有的挑战。利用体外筛选技术获得的适体，由于其独特的优点，成为新一代理想的传感器识别元件，适体传感器的研究受到了科学家们的极大关注。与目前在生物医学领域中广泛应用的抗体相比，核酸适体是一种全新的分子识别方法，核酸适体不仅能和抗体一样与目标分子高效专一结合，还具有许多抗体无法比拟的优点筛选周期短，成本低、靶分子种类广泛、高特异性和高亲和力、修饰灵活、稳定性好等。 正是由于以上种种优势，适体已成为一种极富应用潜力的识别分子识别探针，可应用于各种小分子、蛋白质、及细胞检测系统的构建，为生物传感器的研究提供了一个崭新的平台。胶体晶体是由一种或多种单分散的胶体颗粒(无机或有机，尺度在微米或亚微米级)组装形成的具有二维或三维有序结构的一类物质，其最基本的特征是光子带隙。胶体晶体衍射波峰位置遵循布拉格衍射公式，即πιλ =2ndsin0，其中m为衍射级数，λ为衍射波长，η为胶体晶体的平均折射率，d为胶体晶体的晶格间距，Θ为入射光角度。由此可见， 衍射光的中心波长(即特征反射峰)与平均折射率和晶格常数有关。响应性胶体晶体是指光子带隙对外界环境的变化具有响应性的胶体晶体。自1997年Asher等开发了新型的胶体晶体化学智能传感材料以来，响应不同外界环境的胶体晶体逐渐成为胶体晶体研究领域的一大热点。胶体晶体传感器主要是利用胶体晶体能够产生布拉格衍射的性质，通过外界环境的激励改变其平均折射率或晶格常数，从而会引起衍射峰的改变。在某些情况下胶体晶体受外界刺激的响应而引起的特征反射峰的变化，可以被人的裸眼直接观察到，因此胶体晶体作为一种新的可视化传感材料在生物、化学传感等方面已崭露头角。通过胶体晶体结构的设计，目前已经有许多基于胶体晶体的传感器被制备出来。但是目前已开发的胶体晶体传感器还存在的传感器功能简单，分子识别单元抗体易失活，检测方法单一等缺点，严重制约了胶体晶体传感器的灵敏度、选择性、重复使用性和快速响应能力等性能指标。
发明内容
为了解决现有非标记可视化检测选择性差，成本高等缺点，本发明提供一种以适体为分子识别单元的胶体晶体凝胶非标记可视化检测方法。为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是一种以适体为识别单元的胶体晶体凝胶非标记可视化检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(I)胶体晶体水凝胶薄膜的制备将单分散的胶体纳米粒子加入水凝胶前聚体溶液中，调节胶体纳米粒子溶液中胶体纳米粒子的质量百分数为10% 80%，超声分散，直至胶体纳米粒子溶液产生结构色；然后加入引发剂后，灌入模具，静置O. I 2h，经紫外光照射聚合或烘箱内通过热固化法对结构色胶体溶液进行固化，即得胶体晶体水凝胶薄膜， 将所得到的胶体晶体水凝胶薄膜从模具上剥落，洗涤后置于纯水中保存；(2)适体修饰的胶体晶体水凝胶薄膜的制备通过化学键偶联方法将适体偶联在步骤(I)中洗涤后的胶体晶体水凝胶薄膜上， 制成适体修饰的胶体晶体水凝胶薄膜，将制备好的薄膜用磷酸缓冲液洗涤之后得到检测用的胶体晶体水凝胶薄膜，测定检测用的胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱；(3)目标分析物的检测将步骤(2)中得到的检测用的胶体晶体水凝胶薄膜在缓冲溶液中与待测样品混合进行适体和样品的特异性结合反应，反应完毕，洗涤后检测反应后的胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱，通过比较反应前后胶体晶体水凝胶薄膜的颜色或通过测定胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱，确定待测物质的含量。优选的，所述方法步骤(2)采用的适体为分子识别单元，为核酸适体或RNA适体中的一种或多种。优选的，所述方法步骤⑴采用胶体纳米粒子材料选自二氧化硅、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、二氧化钛、铁的氧化物、金、银中的一种或两种以上的材料；所述的水凝胶前聚体为丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、醋酸丁酸纤维素、硅氧烷甲基丙烯酸酯、氟硅甲基丙烯酸酯、全氟醚、N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯或二甲基丙烯酸乙二醇酯中的一种或两种以上的任意混合。优选的，所述方法步骤⑴中胶体纳米粒子的粒径在10纳米到500纳米之间；所述胶体纳米粒子的浓度在10% 80%。优选的，所述方法步骤(2)中适体修饰的化学键偶联方法选自氨基与氨基的反应、氨基与羧基的反应或羧基与羟基的反应中的一种或两种以上的任意组合。优选的，所述方法步骤(3)中待测样品中检测对象为离子、药物分子、毒品分子、 添加剂、小分子、神经递质、激素、蛋白质、酶、抗原抗体、细胞因子、生长因子、肿瘤标志物或各种生物分子中的一种。优选的，所述方法步骤(3)中待测样品中检测对象为汞离子、铅离子、钾离子、可卡因、凝血酶中的一种。本发明从构建胶体晶体传感器的分子识别元件入手，以核酸适体作为切入点，开发了一种新型的以适体为识别单元的胶体晶体非标记可视化检测方法。检测步骤为第一步制备胶体晶体水凝胶薄膜将单分散的胶体纳米粒子加入水凝胶前聚体溶液中，调节胶体纳米粒子溶液中胶体纳米粒子的质量百分数到10% 80%，超声分散，直至胶体纳米粒子溶液产生结构色。加入引发剂后，灌入模具，静置O. I 2h，经紫外光照射聚合或烘箱内通过热固化法对结构色胶体溶液进行固化，即得胶体晶体水凝胶薄膜，将所得到的胶体晶体水凝胶薄膜从模具上剥落，洗涤后置于纯水中保存。第二步，制备适体修饰的胶体晶体水凝胶薄膜通过化学键偶联方法将适体偶联在步骤(I)中制得的胶体晶体水凝胶薄膜上，制成适体修饰的胶体晶体水凝胶薄膜，将制备好的薄膜用缓冲液洗涤之后，测定胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱。第三步，检测将步骤(2)中得到的检测用的胶体晶体水凝胶薄膜在缓冲溶液中与待测样品混合进行适体和样品的特异性结合反应，反应完毕，洗涤后比较反应前后胶体晶体水凝胶薄膜的颜色或通过测定胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱，确定待测物质的含量。待测样品可以是离子、药物分子、毒品分子、添加剂、小分子、神经递质、激素、蛋白质、酶、抗原抗体、细胞因子、生长因子、肿瘤标志物或各种生物分子中的任意一种。本发明以适体为识别单元的胶体晶体凝胶非标记可视化检测方法采用的载体为胶体晶体水凝胶薄膜。所述的胶体晶体凝胶薄膜中的分子识别单元是核酸适体或RNA适体中的一种或多种。方法中所述的胶体纳米粒子材料选自二氧化硅、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、二氧化钛、铁的氧化物、金、银中的一种或两种以上的材料；所述的水凝胶前聚体为丙烯酰胺、 甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、醋酸丁酸纤维素、硅氧烷甲基丙烯酸酯、氟硅甲基丙烯酸酯、全氟醚、N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯或二甲基丙烯酸乙二醇酯中的一种或两种以上的任意混合。所述胶体纳米粒子的粒径在10纳米到500纳米之间；所述胶体纳米粒子的浓度在10% 80%。方法中所述的适体修饰的化学键偶联方法可以是氨基与氨基的反应、氨基与羧基的反应或羧基与羟基的反应中的一种或两种以上的任意组合。所述的检测对象为离子(如汞离子、铅离子、钾离子等)、药物分子、毒品分子(如可卡因)、添加剂、小分子、神经递质、 激素、蛋白质、酶(如凝血酶)、抗原抗体、细胞因子、生长因子、肿瘤标志物或各种生物分子中的任意一种。本发明的以适体为分子识别单元的胶体晶体凝胶非标记可视化检测方法与现有的非标记可视化检测方法相比较具有以下优点(I)本发明以适体为分子识别单元，适体分子的可设计性、高选择性、高灵敏度、高稳定性、可修饰性以及广泛的检测对象等优点，使得胶体晶体膜的稳定性大大提高，副反应干扰现象�。币部梢月悴煌觳庋镜男枰�。(2)本发明将适体与胶体晶体凝胶薄膜相结合，利用适体结合目标分子后构象的变化而导致的胶体晶体凝胶光子带隙的变化来进行检测。光子带隙的变化所带来的胶体晶体膜颜色的变化能直接被人眼所鉴别，使得检测工具大大简化，检测成本大大降低。(3)本发明中，待检的目标分子无需进行标记或其他的预处理，可以简化检测步骤，减小因目标分子标记所带来的失活等影响。(4)胶体晶体凝胶薄膜高度的亲水性、高含水量、优良的生物相容性及刺激响应性，可以使检测灵敏度大大提高。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述图I为以适体为识别单元的胶体晶体凝胶检测过程示意图。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例I适体修饰的胶体晶体凝胶薄膜检测环境水样中的重金属离子Hg2+I、制备胶体晶体水凝胶薄膜将直径为200纳米的单分散二氧化硅胶体纳米粒子加入丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的混合溶液中(29 1，摩尔比)，调节二氧化硅的质量百分数为30%，超声分散，直至胶体纳米粒子溶液产生透亮鲜艳的结构色；向这种溶液中加入光引发剂1173(0. 1%，质量体积比)，充分混匀后，通过氮气5min，取500微升体积的胶体溶液加入模具内，静置20min， 4°C下高压汞灯照射15min，即得胶体晶体水凝胶膜。 2、制备适体修饰的胶体晶体水凝胶薄膜将第一步所制备的胶体晶体凝胶膜在O. IM的NaOH(10% N, N，N'，N'-四甲基乙二胺)溶液中还原Ih后，用2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液洗涤，在MES缓冲液中加入I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化还原膜后，加入两端带氨基修饰的汞离子的适体偶联制成适体修饰的胶体晶体水凝胶薄膜，将制备好的薄膜用磷酸盐缓冲液洗涤之后，测定胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱。3、Hg2+检测将制备得到的凝胶薄膜用三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲溶液洗涤后，在O. 5ml的 Tris缓冲液中与待测水样混合，35°C反应lh。反应完毕后，用Tris缓冲液洗涤，根据反应前后胶体晶体水凝胶薄膜的颜色或通过测定胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱，确定环境水样中萊离子的含量。实施例2使用适体修饰的胶体晶体凝胶薄膜检测毒品可卡因I、制备胶体晶体水凝胶薄膜将直径为150纳米的单分散聚苯乙烯胶体纳米粒子加入聚乙二醇双丙烯酸酯与丙烯酰胺的混合溶液中(I 10，摩尔比)，调节聚苯乙烯的质量百分数为40%，超声分散， 直至胶体纳米粒子溶液产生透亮鲜艳的结构色；向这种溶液中加入光引发剂907(0. 1%, 质量体积比)，充分混匀后，通过氮气lOmin，取500微升体积的胶体溶液加入模具内，静置 10min，4°C下高压汞灯照射20min，即得胶体晶体水凝胶膜。2、制备适体修饰的胶体晶体水凝胶薄膜将第一步所制备的胶体晶体凝胶膜在O. 3M的NaOH溶液中还原30min后，用磷酸盐(PBS)缓冲溶液洗涤，在PBS缓冲液中加入EDC/NHS试剂活化还原膜后，加入两端带氨基修饰的可卡因的适体偶联制成适体修饰的胶体晶体水凝胶薄膜，将制备好的薄膜用PBS缓冲液洗涤之后，测定胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱。
3、可卡因的检测将制备得到的凝胶薄膜用PBS缓冲溶液洗涤后，在O. 5ml的PBS缓冲液中与待测样品混合，35°C反应lh。反应完毕后，用PBS缓冲液洗涤，根据反应前后胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱，确定样品中可卡因的含量。实施例3使用适体修饰的胶体晶体凝胶薄膜检测血小板衍生生长因子I、制备胶体晶体水凝胶薄膜将直径为100纳米的单分散聚甲基丙烯酸甲酯胶体纳米粒子加入10% (质量体积比)的PEGDA溶液中，调节聚甲基丙烯酸甲酯的质量百分数为50%，超声分散，直至胶体溶液产生透亮鲜艳的结构色；向这种溶液中加入引发剂过硫酸胺(O. 1%，质量体积比)和加速剂TEMED (O. 1%,质量体积比)，充分混匀后，通过氮气30min，取500微升体积的胶体溶液加入模具内，静置30min，与烘箱中40V聚合40min，即得胶体晶体水凝胶膜。2、制备适体修饰的胶体晶体水凝胶薄膜将第一步所制备的胶体晶体凝胶膜在O. 2M的KOH溶液中还原50min后，用Tris 缓冲溶液洗涤，在Tris缓冲液中加入EDC/NHS试剂活化还原膜后，加入两端带氨基修饰的血小板衍生生长因子的适体偶联制成适体修饰的胶体晶体水凝胶薄膜，将制备好的薄膜用 Tris缓冲液洗涤之后，测定胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱。3、血小板衍生生长因子的检测将制备得到的凝胶薄膜用Tris缓冲溶液洗涤后，在I. Oml的Tris缓冲液中与待测样品混合，4°C反应2h。反应完毕后，用Tris缓冲液洗涤，根据反应前后胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱，确定样品中血小板衍生生长因子的含量。实施例4使用适体修饰的胶体晶体凝胶薄膜检测凝血酶I制备胶体晶体水凝胶薄膜将直径为250纳米的单分散二氧化硅胶体纳米粒子加入聚乙二醇双丙烯酸酯和甲基丙烯酸羟乙酯的混合溶液中(质量体积比I : 5)的溶液中，调节二氧化硅的质量百分数为60%，超声分散，直至胶体溶液产生透亮鲜艳的结构色；向这种溶液中加入光引发剂1173(0. 1%，质量体积比)和光引发剂907 (O. I%，质量体积比)，充分混匀后，通过氮气 15min,取500微升体积的胶体溶液加入模具内，静置150min，4°C下高压汞灯照射20min，即得胶体晶体水凝胶膜。2制备适体修饰的胶体晶体水凝胶薄膜将第一步所制备的胶体晶体凝胶膜在O. 2M的NaOH(含5% TEMED)溶液中还原 Ih后，用Tris缓冲溶液洗涤，在Tris缓冲液中加入EDC/NHS试剂活化还原膜后，加入两端带氨基修饰的凝血酶的适体偶联制成适体修饰的胶体晶体水凝胶薄膜，将制备好的薄膜用 Tris缓冲液洗涤之后，测定胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱。3凝血酶的检测将制备得到的凝胶薄膜用Tris缓冲溶液洗涤后，在I. Oml的Tris缓冲液中与待测样品混合，4°C反应lh。反应完毕后，用Tris缓冲液洗涤，根据反应前后胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱，确定样品中凝血酶的含量。上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种以适体为识别单元的胶体晶体凝胶非标记可视化检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)胶体晶体水凝胶薄膜的制备将单分散的胶体纳米粒子加入水凝胶前聚体溶液中， 调节胶体纳米粒子溶液中胶体纳米粒子的质量百分数为10% 80%，超声分散，直至胶体纳米粒子溶液产生结构色；然后加入引发剂后，灌入模具，静置O. I 2 h，经紫外光照射聚合或烘箱内通过热固化法对结构色胶体溶液进行固化，即得胶体晶体水凝胶薄膜，将所得到的胶体晶体水凝胶薄膜从模具上剥落，洗涤后置于纯水中保存；(2)适体修饰的胶体晶体水凝胶薄膜的制备通过化学键偶联方法将适体偶联在步骤(I)中洗涤后的胶体晶体水凝胶薄膜上，制成适体修饰的胶体晶体水凝胶薄膜，将制备好的薄膜用磷酸缓冲液洗涤之后得到检测用的胶体晶体水凝胶薄膜，测定检测用的胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱；(3)目标分析物的检测将步骤(2)中得到的检测用的胶体晶体水凝胶薄膜在缓冲溶液中与待测样品混合进行适体和样品的特异性结合反应，反应完毕，洗涤后检测反应后的胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱，通过比较反应前后胶体晶体水凝胶薄膜的颜色或通过测定胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱，确定待测物质的含量。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述方法步骤(2)采用的适体为分子识别单元，为核酸适体或RNA适体中的一种或多种。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述方法步骤(I)采用胶体纳米粒子材料选自二氧化硅、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、二氧化钛、铁的氧化物、金、银中的一种或两种以上的材料；所述的水凝胶前聚体为丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、 醋酸丁酸纤维素、硅氧烷甲基丙烯酸酯、氟硅甲基丙烯酸酯、全氟醚、N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯或二甲基丙烯酸乙二醇酯中的一种或两种以上的任意混合。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述方法步骤(I)中胶体纳米粒子的粒径在10纳米到500纳米之间；所述胶体纳米粒子的浓度在10% 80%。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述方法步骤(2)中适体修饰的化学键偶联方法选自氨基与氨基的反应、氨基与羧基的反应或羧基与羟基的反应中的一种或两种以上的任意组合。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述方法步骤(3)中待测样品中检测对象为离子、药物分子、毒品分子、添加剂、小分子、神经递质、激素、蛋白质、酶、抗原抗体、细胞因子、生长因子、肿瘤标志物或各种生物分子中的一种。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述方法步骤(3)中待测样品中检测对象为汞离子、铅离子、钾离子、可卡因、凝血酶中的一种。
全文摘要
本发明公开了一种以适体为识别单元的胶体晶体凝胶非标记可视化检测方法，该方法采用胶体晶体水凝胶薄膜为载体，使适体与胶体晶体凝胶薄膜结合，通过适体与目标检测物之间高特异性、高灵敏的结合来对目标分子进行检测。在适体结合目标分子后，适体构象的改变导致胶体晶体凝胶体积的变化，凝胶体积的变化直接体现在胶体晶体反射峰即胶体晶体颜色的变化，即待测物质的有无或多少由胶体晶体凝胶薄膜的反射峰位移或颜色来体现。这种基于适体的胶体晶体水凝胶薄膜非标记可视化检测方法具有灵敏度高，特异性好，操作简单、检测成本低廉等优点。
文档编号G01N21/75GK102590185SQ20121000717
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者上官凤栖, 叶宝芬, 程瑶, 谢卓颖, 赵远锦, 顾忠泽 申请人:东南大学
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