专利名称：萘肼无机酸盐或萘肼有机酸盐在作为基质辅助激光解吸电离质谱中基质的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种萘肼无机酸盐或萘肼有机酸盐在作为基质辅助激光解吸电离质谱中基质的应用，属于质谱检测技术领域。
背景技术：
自1988年Karas et al.和Tanaka et al.报道米用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD1-TOF MS)技术可以有效的进行生物大分子质谱的分析以来，MALD1-T0FMS技术备受各国研究者的青睐。但由于MALD1-TOF MS技术常用的基质都是小分子有机化合物，如0-腈基-4-羟基肉桂酸(0^)、2，5-二羟基苯甲酸(0耶)、芥子酸(5六)、3-羟基-2-吡啶甲酸(3-HPA)、蒽三酚(DI)和3-氨基喹啉(3-AQ)等。在分析过程中，由于上述基质分子在m/z〈500的范围内容易发生碎裂及分子之间的缔合等产生严重的基质背景干扰现象，因此，采用这些基 质不能有效的分析m/z〈500的小分子化合物。为了避免基质背景干扰现象的产生，研究者们通过对MALD1-TOF MS机理的研究提出了许多可行的改进方法。如先后引入无机物基质、聚合物基质、混合基质等新基质或通过对多孔硅表面进行化学修饰从而采用无基质解吸/电离方法来克服以有机小分子作为基质分析小分子化合物的不足。采用无机物如二氧化钛作为基质分析样品时，得到的信号峰不仅有质子化的样品分子峰、还有样品分子和碱金属形成的加合物的峰等多种峰；用石墨烯作为基质，分析样品时，灵敏度较低。由于聚合物的合成步骤较多，如果用聚合物作为基质分析样品，不能充分体现MALD1-TOF MS分析样品快速、高效的特点。采用质子海绵作为基质只能分析有机酸类化合物。在多孔硅表面发生解吸/电离时首先要在硅晶表面进行刻蚀使其产生纳米结构的表面，在这样的表面虽然可以直接分析多肽和抗病毒药物，但由于这种表面的重复使用效果不好，因此就需要在同样的纳米结构表面上进行反复处理以得到能重复使用的表面。此夕卜，对多孔硅表面进行化学修饰耗时较长而且经过修饰多孔硅重复使用时分析效果会大大下降。因此，提供一种操作方法简单，成本低廉，适用范围广，在小于m/z 500内没有或只有很低背景峰的基质以及样品制备分析方法，是对当前基于MALDI的质谱分析的重要和有力补充。具有广泛的实用意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种萘肼无机酸盐或萘肼有机酸盐在作为基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI)中基质的应用。本发明提供的萘肼无机酸盐或萘肼有机酸盐在作为基质辅助激光解吸电离质谱中基质的应用中，所述基质辅助激光解吸电离质谱为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD1-TOF MS)，但与其他质谱分析仪器也兼容。
上述的应用中,所述萘肼无机酸盐可为萘肼盐酸盐、萘肼硝酸盐、萘肼磷酸盐或萘餅硫酸盐等；所述萘肼有机酸盐可为萘肼三氟乙酸盐、萘肼乙酸盐、萘肼甲酸盐、萘肼柠檬酸盐或萘肼草酸盐等；所述萘肼无机酸盐和萘肼有机酸盐上的肼基团均为I位取代或2位取代。 上述的应用中，所述基质辅助激光解吸电离质谱中的待测物质的分子量小于500。上述的应用中，所述基质辅助激光解吸电离质谱中的待测物质可为单糖、寡糖、糖肽、糖醇、糖脂、脂类化合物、金属离子、核酸、有机酸、留体类化合物和胺类化合物中任一种。上述的应用中，所述单糖和寡糖具体可为D (+)木糖、D-(-)阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、L(+)鼠李糖、D-半乳糖、D-果糖、葡萄糖、L-山梨糖、蔗糖、乳糖、D ( + )蜜三糖或水苏四糖等；所述糖肽为糖蛋白水解后的糖肽片段；所述糖醇可为木糖醇或甘露醇等；所述糖脂为甘油糖脂、鞘糖脂或脂多糖等；所述脂类化合物可为甘油三脂、卵磷脂、脑磷脂或肌醇磷脂等；所述金属离子可为铅离子、汞离子、钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、铁离子、钴离子、锰离子、镍离子或金离子等；所述有机酸可为尿黑酸、五氟苯甲酸、尿酸或抗坏血酸等；所述留体类化合物可为胆固醇或肾上腺素等；所述胺类化合物可为尿素或多巴胺等。上述的应用中，所述基质辅助激光解析电离质谱用于检测下述体系细胞组织样本、微生物样本、体液、化学反应混合物和环境监测样本,因此,萘肼无机酸盐或萘肼有机酸盐可在有机与生物质谱 、质谱成像、蛋白质谱学、代谢组学、生物标记物发现和环境分析等领域得到有效的应用。上述的应用中，所述环境检测样本具体可为水、大气、或土壤样本。上述的应用中，所述基质辅助激光解析电离质谱用于对待测物质进行质谱成像，如待测样品为组织切片时，可将萘肼无机酸盐或萘肼有机酸盐的溶液(lmg/mL至饱和浓度)喷洒在样品表面，然后进行标准的质谱成像分析。上述的应用中，所述萘肼无机酸盐或萘肼有机酸盐与所述基质辅助激光解析电离质谱的待测物质的摩尔比可为(广1000):(广10)，如5 :1、1. 5 :1或3 :5，具体应用时，用水、甲醇、乙醇或乙腈溶解所述萘肼无机酸盐或萘肼有机酸盐得到基质溶液，然后与待测物质混合均匀后，吸取0. 5^1 u L混合液点样。待混合液中的溶剂在空气中挥发完全后，即可采用负离子扫描模式的MALD1-TOF MS对待测物质进行分析。上述的应用中，待测物质为复杂混合体系时，通常无需特殊处理，吸取混合体系的上清液(也可以是浑浊液)以一定比例和基质溶液混合，点于MALDI靶板后即可用于质谱分析。本发明从技术上克服了常用有机小分子基质在低分子量区容易产生严重的基质背景干扰现象从而导致不能有效分析小分子样品的缺陷；本发明采用的基质，无需加入离子化试剂，减少了对样本处理的要求；由于在m/z〈500几乎没有背景干扰，因而对多种复杂混合体系也可进行分析。而且样本兼容性好，无需特殊复杂处理即可分析。同时由于其极低的灵敏度(Iamol)与对糖类物质的敏感性，可以在生物复杂样品中特异性检测低浓度糖。
图1为1-萘肼的结构式。图2为1-盐酸萘肼的质谱背景图。图3为基质检测葡萄糖溶液的检测限质谱分析图(S/N=3)。图4为实施例1中寡糖类的质谱分析图，其中图4 (A)、图4 (B)、图4 (C)和图4(D)分别为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽七糖的负离子扫描MALDI谱图。图5为实施例2中检测血清中葡萄糖分子的质谱分析图，其中图5 (A)和图5 (B)分别为DHB检测血清的正离子模式及NHHC检测血清的负离子模式扫描MALDI谱图；图5(C)为标准加入法定量分析血清中葡萄糖含量的曲线。图6 (A)为实施例3中检测尿液中尿黑酸分子的质谱分析图；图6 (B)为实施例3中定量分析尿黑酸含量的标准曲线。图7为萘肼与葡萄糖衍生化反应的化学方程式。图8为萘肼与糖类衍生化产物的质谱分析图，其中图8(A)和图8 (B)分别为葡萄糖和麦芽糖衍生化产物沉淀溶液的负离子模式扫描MALDI谱图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明下述实施例所用的1-盐酸萘肼购自美国sigma公司。本发明下述实施例所用的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的型号为BIFLEXTM III (Bruker)。基质的质谱背景非常简单、干净，质谱信号除了氯离子和盐酸与氯离子的加合物峰以外，没有其它信号，对测试样本，包括复杂体系均无干扰(如图2所示)。同时对寡糖类物质具有极低的检测限，测试葡萄糖溶液时可达到Iamol (如图3所示)。实施例1、寡糖类物质的分析取各种配制好的样品溶液和基质溶液以1:1体积比混合均匀(1-盐酸萘肼与葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽七糖的摩尔比分别为5 :1、5 :1、1.5 :1和1.5 :1)，然后于MALDI靶板上加入I U L混合样品，在空气中干燥后进入质谱分析。其中葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽七糖均溶解在纯水中，浓度依次为3mmol/L、3mmOl/L、10mmOl/L和lOmmol/L，基质1_盐酸萘肼溶解在体积比为1:1的乙腈/水溶液中配制为3mg/mL的溶液。质谱条件为电压加速电压19. OOOkV ;延迟引出电压14. 920kV;反射器电压20. OOOkV ;透镜电压7. OOOkV ;频率1. OOOHz ;激光器能量:75 80% ;累加次数80次；负
离子模式。在MALDI电离方式下，基质可以将质子转移到待测化合物(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽七糖)，使待测化合物带负电，从而被质谱检测，结构如图4所示。实验证明，该基质对于寡糖物质均具有较好的分析性能。实施例2、血清中葡萄糖含量分析取10 ii L人血清与30 ii L乙腈混合，充分混合，离心，取10 ii L上清液与10 ii L基质1-盐酸萘肼溶液混合，最后取出I U L混合液加入到MALDI靶板上，在空气中干燥后进入质谱分析。在使用标准加入法定量检测葡萄糖浓度时，配制摩尔浓度为10mmol/L的同位素标记的D-葡萄糖-1，2-13C2水溶液，以及摩尔浓度分别为0、1、2、3、5和9mmol/L的葡萄糖水溶液。取制备好的去蛋白的血清上清液以体积比1:1 :1 :1与3mg/mL基质水溶液、同位素标记的葡萄糖水溶液与不同浓度的葡萄糖溶液混合，取混合溶液I U L进行MALD1-TOF质谱分析。质谱条件为电压加速电压19. OOOkV ;延迟引出电压14. 920kV;反射器电压20. OOOkV ;透镜电压7. OOOkV ;频率1. OOOHz ;激光器能量:75 80% ;累加次数80次；负
离子模式。测试结构如图5所示，图5 (A)和图5 (B)分别为DHB检测血清的正离子模式及NHHC检测血清的负离子模式扫描MALDI谱图，从图5中可以看出，去蛋白后的血清中大量葡萄糖被离子化，产生了较高的质谱信号。图5 (C)给出了通过标准加入法绘制的曲线，其中R2=O. 9965，当y=0时，x=_0. 28，从而算出血清中葡萄糖绝对含量为4. 48mmol/L。此例说明，该基质可以应用于血清中的小分子代谢物定量分析。实施例3、尿液中尿黑酸含量分析取新鲜尿液配制5mg/mL的尿黑酸溶液，取出I U L混合液加入到MALDI靶板上，在空气中干燥后进入质谱分析。在绘制标准曲线定量检测已知浓度的尿液中的尿黑酸时，配制摩尔浓度为3mg/mL的同位素标记的尿黑酸-13C6尿样溶液与摩尔浓度分别为0、1、2、3、4和5mg/mL的尿黑酸尿样溶液以及3mg/mL基质水溶液以1:1 1等体积混合(其中1_盐酸萘肼与尿黑酸的摩尔比约为3 :5)，取混合溶液I y L进`行MALD1-TOF质谱分析。质谱条件为电压加速电压19. OOOkV ;延迟引出电压14. 920kV;反射器电压20. OOOkV ;透镜电压7. OOOkV ;频率1. OOOHz ;激光器能量:75 80% ;累加次数80次；负
离子模式。从图6(A)中可以看出，在分析未经处理加入的尿样中的尿黑酸时，谱图较为干净，产生了较高的质谱信号。图6 (B)给出了用于定量分析尿黑酸含量的标准曲线，在检测加入已知含量的尿黑酸(5mg/mL)尿样时测得结果为4. 99mg/mL,回收率为99. 8%。此例说明，该基质可以应用于尿样中的小分子代谢物定量分析。实施例4、萘肼与糖类衍生化产物分析(图7)取2mg NHHC,加入15 y L浓硫酸，倒入150 y L纯度为95%的乙醇和300 y L的纯水，混合均匀后加入200 u L 5mmol/L的葡萄糖(果糖、麦芽糖、麦芽七糖)溶液，加热至80°C，保温30分钟。反应结束后，静止24h，待沉淀量可提取时，离心，沉淀用纯水洗涤三次后，滴加四氢呋喃溶液至沉淀刚好溶解，分别取上清液、洗涤液和沉淀溶液与基质溶液等体积混合后进行MALD1-TOF质谱分析。质谱条件为电压加速电压19. OOOkV ;延迟引出电压14. 920kV ;反射器电压:20. OOOkV ;透镜电压7. OOOkV ;频率1. OOOHz ;激光器能量75^80% ;累加次数80次；负离子模式。从图7中可以看到，萘肼与糖类物质发生类似如图7所示的反应，因为衍生物中有萘环官能团，可以吸收一定的紫外能量，从而不需要基质的辅助即可进行解吸/电离进入质谱检测。图8 (A)和图8 (B)分别为葡萄糖和麦芽糖衍生化产物沉淀溶液的负离子模式扫描MALDI谱图，由图可知，成功得检测到了葡萄糖与麦芽糖的衍生物。
权利要求
1.萘肼无机酸盐或萘肼有机酸盐在作为基质辅助激光解吸电离质谱中基质的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述萘肼无机酸盐为萘肼盐酸盐、萘肼硝酸盐、萘肼磷酸盐或萘肼硫酸盐； 所述萘肼有机酸盐为萘肼三氟乙酸盐、萘肼乙酸盐、萘肼甲酸盐、萘肼柠檬酸盐或萘肼草酸盐； 所述萘肼无机酸盐和萘肼有机酸盐上的肼基团均为I位取代或2位取代。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述基质辅助激光解吸电离质谱中的待测物质的分子量小于500。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于所述基质辅助激光解吸电离质谱中的待测物质为单糖、寡糖、糖肽、糖醇、糖脂、脂类化合物、金属离子、核酸、有机酸、甾体类化合物和胺类化合物中任一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述单糖和寡糖为D(+)木糖、D-(-)阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、L(+)鼠李糖、D-半乳糖、D-果糖、葡萄糖、L-山梨糖、蔗糖、乳糖、D ( + )蜜三糖或水苏四糖；所述糖肽为糖蛋白水解后的糖肽片段；所述糖醇为木糖醇或甘露醇；所述糖脂为甘油糖脂、鞘糖脂或脂多糖；所述脂类化合物为甘油三脂、卵磷脂、脑磷脂或肌醇磷脂；所述金属离子为铅离子、汞离子、钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、铁离子、钴离子、锰离子、镍离子或金离子；所述有机酸为尿黑酸、五氟苯甲酸、尿酸或抗坏血酸；所述甾体类化合物为胆固醇或肾上腺素；所述胺类化合物为尿素或多巴胺。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于所述基质辅助激光解析电离质谱用于检测下述体系细胞组织样本、微生物样本、体液、化学反应混合物和环境监测样本。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述环境检测样本为水、大气、或土壤样本。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的应用，其特征在于所述基质辅助激光解析电离质谱用于对待测物质进行质谱成像。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的应用，其特征在于所述萘肼无机酸盐或萘肼有机酸盐与所述基质辅助激光解析电离质谱的待测物质的摩尔比为(广1000) :(f 10)。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的应用，其特征在于用水、甲醇、乙醇或乙腈溶解所述萘肼无机酸盐或萘肼有机酸盐。
全文摘要
本发明公开了萘肼无机酸盐或萘肼有机酸盐在作为基质辅助激光解吸电离质谱中基质的应用。所述萘肼无机酸盐为萘肼盐酸盐、萘肼硝酸盐、萘肼磷酸盐或萘肼硫酸盐；所述萘肼有机酸盐为萘肼三氟乙酸盐、萘肼乙酸盐、萘肼甲酸盐、萘肼柠檬酸盐或萘肼草酸盐；所述萘肼无机酸盐和萘肼有机酸盐上的肼基团均为1位取代或2位取代。本发明从技术上克服了常用有机小分子基质在低分子量区容易产生严重的基质背景干扰现象从而导致不能有效分析小分子样品的缺陷；本发明采用的基质，无需加入离子化试剂，减少了对样本处理的要求；由于在m/z<500几乎没有背景干扰，因而对多种复杂混合体系也可进行分析。
文档编号G01N27/62GK103063730SQ20121054136
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者聂宗秀, 何清, 陈素明, 王佳宁, 侯剑 申请人:中国科学院化学研究所
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