基于核酸适体的靶物质的检测方法及其固相生物感应器的制作方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：：基于核酸适体的靶物质的检测方法及其固相生物感应器的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物感应器领域，特别涉及一种基于核酸适体的用于检测和定量耙物质的方法以及检测用的固相生物感应器。
背景技术：
：蛋白质是构成生物体的重要组成部分之一，检测和定量某些特定蛋白质在疾病诊断、治疗和新药研制等方面具有重要意义。目前，研究和医疗诊断中常用的是基于抗体的蛋白检测方法(如ELISA，WesternBlotting),这些传统方法具有特异性好、灵敏度高的优点，但是往往需要放射性标记、凝胶电泳和放射自显影等烦杂操作，也不适用于快速、高通量的多元检测。而最近发展起来的核酸适体(Aptamer)，不仅具有类似抗体的高度特异性，而且可以筛选，可以直接固相化学法合成，成本较低并且化学稳定性好，为检测蛋白质传感器的设计提供了新的途径。核酸适体(Aptamer)是一类通过SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)技术体外筛选出来的可以与特定的配体分子(ligand)相结合的一段DNA或RNA分子。由于对于某一种特定的目标分子，总能找到一种或多种与之特异结合的核酸适体，并且它们与目标靶分子具有高度的亲和力和特异性。核酸适体被认为是生物传感器领域最理想的识别元件之一。目前，核酸适体已被用于很多传感检测领域。体外筛选核酸适体不仅增强了人们对核酸、蛋白质相互作用的认识，也为蛋白质生物传感器的设计提供了一条新的途径。迄今为止，己筛选到HIV、HCV、肿瘤相关因子、凝血酶、弹性蛋白酶等多种蛋白质分子的核酸适体。抗生素的核酸适体已在治疗中展示了良好的应用前景。可以预测，核酸适体在蛋白质生物传感器领域将大有可为。作为蛋白质之一的凝血酶，与其核酸适体之间的特异性反应己有大量研究。1992年Bock等(L.C.Bock，L.C.Griffin,J.A.Latham,E.H.Vermaas，J.J.Toole，A^fww1992，355，564)首次在体外分离并筛选到了具有抗凝血酶凝集活性的15mer的单链DNA核酸适体5，-GGTTGGTGTGGTTGG-3，。该核酸适体的解离常数Kd可达25200nM。1997年Tasset等(D.M.Tasset，M.F.Kublik,W.Steiner，《/Mo/.所o/.1997，272,688)筛选到另一个29mer的凝血酶单链DNA核酸适体，体外也能抑制凝血酶催化的血纤维蛋白凝集反应，其解离常数Kd可达到0.5nM，较15mer的核酸识体结合更为紧密。在这两种核酸适体中，对15mer的核酸适体的研究尤为具体，该核酸适体与凝血酶结合后呈G—四聚体结构，而这也是大多数实验设计的基础。目前已发展了很多凝血酶检测的新方法，如光学检测，电化学检测、石英晶体微天平和表面等离子共振。在这些方法中，Xiao等(Y.Xiao，A.A.Lubin，A.J.Heeger,K.W.Plaxco，Label-freeelectronicdetectionofthrombininbloodserumbyusinganaptamer-basedsensor.爿"gevuC72，.紋2(905，44,5456)报道的免标记的电化学方法对凝血酶的检测，无需其它试剂，选择性高。但是在血液中检测的灵敏度有限的，并且它是一种"singal-off，的工作模式。以这种模式进行检测时，由于核酸适体或还原标记物的降解产生的杂质常常会产生假阳性信号，从而使靶的特异结合所产生的信号很难分辨出来。其他的如以石英晶体微天平(S.Fukusho,H.Furusawa,Y.Okahata，CTzew.Comm"".2002,88)或表面等离子体共振(S.H.L.Verhelst，P.J.A,Michiels，G.A.v.d.Marel,C.A.A.v.Boeckel，J.H.v.Boom,C7zew6/oc/zem2004，5，937;S.Tombelli，M.Minunni，M.Mascini,爿wa/.Le".20W，35，599)为检测方式的核酸适体生物传感器虽具有较高的灵敏度和较短的检测时间，但是都容易引起非特异吸附从而产生假阳性结果；而另外报道(T.Hianik,V.Ostatoa，Z.Zajacova,E.Stoikova，G.Evtugyn,B/oorg.Afed.C/zem.2005，15，291)的一种基于核酸适体检测凝血酶的电化学方法，需要多步操作过程，并且需要外加还原指示剂，也具有难以克服的缺点。可见，发展高特异性、高灵敏度的生物检测方法是实现蛋白质检测与定量所面临的重要挑战之一。
发明内容因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有技术中靶物质检测存在的不足，提供一种用于检测和定量靶物质的方法及检测用的固相生物传感器，其具有更高特异性和灵敏度。本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案是一种基于核酸适体的用于检测和定量靶物质的方法，包括以下步骤1)以磁性颗粒为固相载体，将捕获探针连接在磁性颗粒表面，得磁性颗粒-捕获探针复合物；该捕获探针为一单链核酸，其序列包括耙物质的核酸适体序列；2)在磁性颗粒-捕获探针复合物中加入待测样品进行反应，然后磁性分离，去除游离成分；3)将信号探针与桥梁分子杂交所得双链核酸加入到步骤2)所得的反应体系中进行反应，然后磁性分离，去除游离成分，包括游离的信号探针；该信号探针是荧光标记的一任意序列的单链核酸，桥梁分子也是一单链核酸，其序列包括一端为与信号探针互补的序列，另一端为耙物质的核酸适体序列；4)通过核酸变性的方法将信号探针从磁性颗粒表面分离下来，对该信号探针上的荧光信号进行检测。本发明所述的靶物质，可以是任何物质，只要其至少有一个核酸适体，且当只有一个核酸适体时，该靶物质与该核酸适体至少有两个结合位点。根据本发明，步骤l)为以磁性颗粒为固相载体，将捕获探针连接在磁性颗粒表面，得磁性颗粒-捕获探针复合物；该捕获探针为一单链核酸，其序列包括靶物质的核酸适体序列。其中，本发明所述的磁性颗粒(magneticmicro-particles,MMP)是常规的由有机或无机基质与磁性超细粉末(包括磁性金属、金属氧化物等)反应形成的纳米或微米级胶态颗粒。该材料具有超顺磁性使其通过运动保持在胶体溶液中的稳定性，并有磁响应性可保证在外加磁场中颗粒与悬浮介质的分离，当撤去其外磁场后，微粒本身会重新悬浮分散不聚集，不具有磁记忆性。通过高分子或有机试剂与磁性粉末的复合，可在颗粒表面引入氨基、羧基、巯基或羟基等功能基团，通过共价作用将酶、抗体、细胞和核酸等生物分子固定在表面，进而应用于酶的固定化、免疫监测、细胞分选、药物载体和核酸的纯化与分离等生物、医学领域。磁性颗粒的制备方法有许多，目前已有众多商品化的磁性颗粒上市。本发明所述的磁性颗粒的种类包括常规的有超顺磁性的金属氧化物磁性颗粒、复合材料磁性颗粒，优选金属氧化物磁性颗粒。本发明所述的磁性颗粒的直径为800nm1200nm，优选的为800nm1000nm，更优选的为1000nm。所述的捕获探针与磁性颗粒的连接较佳的通过磁性颗粒表面带有的配体(或受体)与捕获探针带有的受体(或配体)之间的特异性亲和作用连接。更佳的通过常规的生物素-亲和素作用连接。本发明所述的捕获探针为一单链核酸，其序列中包括一靶物质的核酸适体序列。较佳的，捕获探针的序列在核酸适体与磁性颗粒连接处之间还包括一间隔序列(spacer)。所述的间隔序列为本领域常规重复腺嘌呤碱基或胸腺嘧啶碱基序列，较佳的为重复腺嘌呤碱基或胸腺嘧啶碱基。间隔序列的长度较佳的为5bp20bp，更佳的为12bp15bp。所述的磁性颗粒与捕获探针的反应比例较佳的为lmg:1.25nmollmg:lnmo1，更佳的为lmg:1.25nmo1。根据本发明，在步骤2)所述的磁性颗粒-捕获探针复合物与待测样品进行反应前，较佳的还包括以下步骤在磁性颗粒-捕获探针复合物中加入封闭液进行反应，以封闭磁性颗粒表面的空余的结合位点。所述的封闭液可以是本领域中常用的封闭试剂，较佳的选自牛血清白蛋白(BSA)、PEG(聚乙二醇)、酪蛋白、脱脂奶粉和小牛血清等，更佳的为BSA。封闭方法为本领域的常规技术。封闭液的反应浓度较佳的为0.510wt%，更佳的为l2wt%，最佳的为2wt%。封闭反应的温度较佳的为20°C30°C，更佳的为23°C~27°C。封闭反应的时间较佳的为2060分钟，更佳的为2030分钟。根据本发明，步骤2)为在磁性颗粒-捕获探针复合物中加入待测样品进行反应，然后磁性分离，去除游离成分。其中，所述的磁性颗粒-捕获探针复合物与待测样品的反应中，待测样品的反应浓度较佳的为lnM500nM，更佳的为10nM250nM。磁性颗粒-捕获探针复合物的反应浓度较佳的为0.5UM1.25UM，更佳的为luM1.25uM。反应温度较佳的35°C~42°C，更佳的为35°C37°C。反应时间较佳的60min90min，更佳的为50min70min。磁性分离的方法是本领域常规的磁性颗粒磁性分离的方法。根据本发明，步骤3)为将信号探针与桥梁分子杂交所得双链核酸加入到步骤2)所得的反应体系中进行反应，然后磁性分离，去除游离成分，包括游离的信号探针；该信号探针是带荧光标记的一任意序列的单链核酸，桥梁分子也是一单链核酸，其序列包括一端为与信号探针互补的序列，另一端为靶物质的核酸适体序列。其中，所述的信号探针的序列是任意序列，长度较佳的为10bp20bp，更佳的为12bp15bp。所述的荧光标记为本领域常规的荧光标记，较佳的选自FAM(荧光素)、FITC(异硫氰酸荧光素)、Alexa488、罗丹明110和Cy2，更佳的选自FAM和FITC。所述的桥梁分子的序列包括与信号探针互补的序列和耙物质的核酸适体序列。在与信号探针互补的序列和靶物质的核酸适体序列之间较佳的还包括一间隔序列。所述的间隔序列为本领域常规重复腺嘌呤碱基或胸腺嘧啶碱基序列，较佳的为重复腺嘌呤碱基或胸腺嘧啶碱基。间隔序列的长度较佳的为4bp12bp，更佳的为5bp10bp。所述的信号探针与桥梁分子杂交的方法同常规，较佳的，杂交反应温度为25。C37'C，反应时间为10min30min。将信号探针与桥梁分子杂交所得的双链核酸加入到步骤2)所得的反应体系中进行反应，双链核酸的反应浓度为0.5uM~2.5uM，较佳的为0.5wM1.25tiM。步骤2)所得的磁性颗粒复合物的反应浓度为0.5uM1.25lxM，较佳的为0.5pM1"M。双链核酸的浓度较佳的为在相同体系中磁性颗粒复合物中捕获探针浓度的12倍。反应温度较佳的为35°C~42°C，更佳的为35°C~37°C，反应时间较佳的为60min90min，更佳的为50min70min。本发明中，捕获探针和桥梁分子中都必须有一段序列是待检测靶物质的核酸适体序列。这两个捕获探针和桥梁分子中的序列是否相同，取决于靶物质有几个核酸适体，还取决于靶物质与核酸适体有几个结合位点。这两个序列，满足以下条件当靶物质只有一个核酸适体，且靶物质与该核酸适体有两个结合位点时，这两个序列相同，即同为该核酸适体序列；当靶物质存在两个及以上不同序列的核酸适体，且靶物质与每个核酸适体只有一个结合位点时，这两个序列不相同，即分别为选自该不同的核酸适体序列中不同的两个；当靶物质有两个及以上核酸适体，且靶物质与每个核酸适体的结合位点不止一个时，这两个序列可以相同也可以不相同，即分别为选自该不同序列的核酸适体序列中的任何一个。根据本发明，步骤4)为核酸变性的方法将信号探针从磁性颗粒表面分离下来，对该信号探针上的荧光信号进行检测。其中，所述的核酸变性的方法为本领域常规的变性方法，优选碱变性方法。变性剂可以为本领域常用的各种碱溶液，较佳的为20~100mM的NaOH，最佳的为50mMNaOH。所述的荧光信号的检测方法可以是本领域常用的荧光信号检测法，本发明优选分光光度法。其中，在检测荧光信号时，较佳的先在荧光标记的信号探针中加入具有荧光信号倍增功能的水溶性的共轭聚合物，再进行荧光信号检测。利用共轭聚合物与荧光素之间的荧光共振能量转移(FRET)实现信号倍增，从而提高检测灵敏度。所述的共轭聚合物(ConjugatedPolymers):是指碳链骨架上含有单、双键交替共轭体系的聚合物。共轭聚合物存在着7C电子共轭体系，具有很强的光捕获能力，具有荧光信号倍增功能。所述的共轭聚合物较佳的为选自聚芴衍生物、聚噻吩衍生物、聚苯撑乙烯、聚苯撑乙炔和聚吡咯中的一种或多种。具体选用哪种聚合物，与所使用的标记信号探针的荧光基团有关，只要聚合物与荧光基团之间能发生高效的荧光共振能量转移即可。本发明的荧光标记优选FAM和FITC，故共轭聚合物优选水溶性聚荷，其结构式如下上述结构中，R=(CH2)3N+(CH3)2CH2CH3Br，n》10。加入荧光信号倍增的共轭聚合物进行荧光信号检测时，所述荧光标记的信号探针的浓度较佳的为lnM500nM，更佳的为10nM250nM;共轭聚合物的浓度较佳的为200nM1000nM，更佳的为10nM250nM;共轭聚合物的浓度为信号探针浓度的12倍，更佳的为11.5倍，优选1倍。本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案是一种采用所述的方法进行检测和定量靶物质的固相生物传感器，包含固相载体、捕获探针、信号探针和桥梁分子，其中所述的固相载体为磁性颗粒，表面结合着能发生特异性亲和作用的配体或受体；所述的捕获探针为一结合着能与所述磁性颗粒表面的配体或受体发生特异性亲和作用的受体或配体的单链核酸，其序列包括靶物质的核酸适体序列；所述的信号探针是荧光标记的一任意序列的单链核酸；所述的桥梁分子也是一单链核酸，其序列包括一端为与信号探针互补的序列，另一端为耙物质的核酸适体序列。其中，所述的磁性颗粒如上所述，本发明优选本领域常规的磁性颗粒中直径为800nm1200nm的种类为Fe304、Y-Fe203的磁性颗粒。所述的能发生特异性亲和作用的配体或受体，优选亲和素或生物素。所述的捕获探针的序列包括靶物质的核酸适体序列，其中在核酸适体序列和结合着受体或配体的结合处之间较佳的还包括一间隔序列；间隔序列优选为12bp15bp的重复腺嘌呤碱基或胸腺嘧啶碱基。所述的信号探针是荧光标记的一任意序列的单链核酸，优选的序列长度为12bp15bp，所述荧光标记优选的为FAM或FITC。所述的桥梁分子的序列，较佳的在与信号探针互补的序列和耙物质的核酸适体序列之间还包括一间隔序列，间隔序列优选为5bp10bp的重复腺嘌呤碱基或胸腺嘧啶碱基。较佳的，本发明的固相生物传感器还包括封闭液、变性剂和/或共轭聚合物。所述封闭液较佳的选自质量百分比0.510%的BSA和0.5~10%的PEG，最优选质量百分比2%BSA，变性剂较佳的选自20~1OOmM的NaOH和KOH，最优选50mMNaOH，共轭聚合物优选如上所述的水溶性聚銜。本发明的固相生物感应器采用上述本发明的检测方法。理论上，任意物质都能找到一种或多种与之特异结合的核酸适体。事实上，已经有众多物质找到了其核酸适体，如蛋白质(凝血酶、生长因子、HIV相关多肽等)、有机小分子(cAMP、ATP、可卡因等)和金属离子(K+、Hg2+、Pp+等)。这些物质都可以作为待检的靶物质，只要该待测样品至少有一个核酸适体，且当其只有一个核酸适体时，该待测样品与核酸适体至少有两个结合位点，均可采用本发明的固相生物感应器及检测方法，用相应的核酸适体进行定量或检测。优选的，所述的靶物质为蛋白质，更佳的如凝血酶。本发明以凝血酶(thrombin)为例来说明本发明的具体实施方式，其中，捕获探针为5'-生物素一TTTTTTTTTTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGG-3'，或5'-生物素-TTTTTTTTTTTTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3，，信号探针为5'-荧光素-GTATGCTGATCTGAT-3'，桥梁分子为5'-GGTTGGTGTGGTTGGTTTTTATCAGATCAGCATAC-3，。本发明凝血酶方案的检测原理可简述为图1所示。本发明除特别说明之外，所用的百分比都是质量百分比。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明的可适用于检测各种不同种类的靶物质，如蛋白质、有机小分子和金属离子等。只要该耙物质至少有一个核酸适体，且当其只有一个核酸适体时，该待测样品与核酸适体至少有两个结合位点，均可采用本发明的固相生物感应器及检测方法，用相应的核酸适体进行定量或检测。本发明对靶物质的检测灵敏度很高，如对凝血酶的检测灵敏度为500pM。本发明不仅具有较高的灵敏度，而且还解决了非特异性问题，在生物检测、疾病的早期诊断和治疗中有着重要的意义。以下结合本发明的特征和有益效果。图1为本发明优选的基于磁性颗�：退苄怨查罹酆衔锏陌形镏始觳夥椒ǖ墓ぷ髟硗肌Ｍ�2为未用水溶性共轭聚合物进行信号放大时的检测结果对比。a为空白；b为浓度为lOOnM的凝血酶。图3为是否采用封闭措施时的两种体系检测凝血酶的结果对比。A图为FRET图谱，B图为对应的FRET效率。a，b分别为未封闭的空白和靶；c，d分别为封闭后的空白和靶。靶浓度为25nM。图4为使用封闭的磁性颗粒检测凝血酶的灵敏度分析。A图为FRET图谱，B图为对应的FRET效率。a为空白对照，b为500pM的凝血酶。具体实施例方式下面结合附图，用凝血酶的检测实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。所述的"室温"是指2(TC25'C。所用仪器为荧光分光光度计(HitachiF-4500,日本)。荧光光谱测量条件氙灯激发，激发和发射狭峰宽度均为2.5nm，电压PMT950V，响应时间2S。激发波长为380nm，发射波长扫描范围390—700nm。用3mL石英比色皿进行测量，样品体积lmL，室温。本发明实施例中所用链亲和素修饰的超顺磁性颗粒购于Promega公司，颗粒直径为1.0pm，固含量为lmg/mL，结合能力为1.25nmo1探针/mgMMPs。本发明实施例中所用的水溶性共轭聚合物为阳离子的聚荷衍生物(PF)，根据文献(F.Huang,H.Wu,D.Wang,W.Yang，YCao,Chem.Mater.2004,16，708)合成，其结构式如下RR上述结构中，R=(CH2)3N+(CH3)2CH2CH3Br，n>10。本发明实施例中所用的各种DNA序列(购自上海生物工程技术有限公司)如表1所示，所用各种溶液成分如表2所示。表l.寡聚核苷酸序列名称碱基组成长度捕获探针15'-生物素-丁丁丁t丁丁丁丁tt丁丁tt丁GGTTGGTGTGGTTGG-3'30bp捕获探针25，-生物素-TTTTTTTTTTTTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3，44bp桥梁分子5'-GGTTGGTGTGGTTGGTTTTTATCAGATCAGCATAC-3'35bp信号探针5'画荧光素-GTATGCTGATCTGAT-3'15bp表2.各种溶液组成成分表溶液名称溶液组成0.5XSSC75mMNaCl，7.5mM柠檬酸钠，pH7.4TTL100mMTris-HCl，0.1%Tween20，1MLiCl，pH8.014<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例1制备磁性颗粒-捕获探针复合物按产品说明书要求，MMPs在使用前首先用0.5xSSC缓冲液洗涤3次，然后将5n1浓度为25uM的生物素标记的捕获探针2加入到100"1含有10ugMMPs的TTL缓冲液的中，在室温下轻轻混合10分钟。捕获探针的表面密度约为46x1011链/cm2。然后将MMPs和捕获探针的复合物(MMPs-captureprobe，记为MMPs-cp1)用TTA缓冲液洗两次，悬浮于结合液中，悬浮浓度为1.25uM，4"C冷藏备用。实施例2桥梁分子与信号探针杂交2.17lU浓度为46uM的桥梁分子与1.62ii1浓度为62uM的信号探针加入到50tU的杂交缓冲液(杂交缓冲液的成份为750mMNaCl，75mM柠檬酸钠，pH7.4)中，室温杂交20分钟，得双链信号探针。实施例3磁性颗粒-捕获探针复合物空余位点的封闭取上述制备所得的于fC冷藏备用的磁性颗粒-捕获探针复合物(MMPs-cp1)的悬浮液0.1ml，然后用TTA缓冲液洗涤三次，磁性分离并吸去上清液后，加入0.1ml浓度为2wt^的牛血清蛋白(BSA)溶液，室温封闭30分钟。然后用TTA缓冲液洗两次，悬浮于结合液中，悬浮液中磁性颗粒—捕获探针复合物的悬浮浓度和封闭前相同，4'C冷藏备用(记为MMPs-cp2)。实施例4检测检测1:将2.5u1浓度为500nM的凝血酶加入到50u1实施例1制备所得的MMPs-cp1的悬浮液中，37。C反应l小时，磁性分离，去除游离组分。然后加入50iU实施例2制备所得的杂交的双链信号探针，37"C反应1小时。然后用结合液洗涤35次，直至洗涤得到的分离上清液中无荧光信号为止。然后向经磁性分离，吸走上清液后的磁性颗粒复合物中加入100pL浓度为50mM的NaOH，室温变性5分钟，磁性分离，收集变性上清液，向其中加入等摩尔量HC1进行中和，再加入0.8ml的10mMTris-HCl(pH8.0)缓冲溶液(10mMTris-HCl，0.5MNaCl，2mMMgCl2)进行荧光检测(Ex:480nm，Em:490~700nm)，然后再加入5pl浓度为27.08pM的PF溶液进行共轭聚合物信号放大的检测(Ex:380nm，Em:390~700nm)。同时，做如下试验作为对比。检测2:用等体积的相同浓度的癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)(生产厂商Sigma公司)抗体代替凝血酶进行试验，作为阴性对照，其它条件与检测1中相同。检测3:用等体积水代替凝血酶进行试验，作为空白对照，其它条件与检测1中相同。检测4:用一生物素修饰的任意DNA序列(5'-生物素-TTTTTTTTTTTTTTTAGTCTGGTTAGTCGTGGTTCGAATGCTTA-3')代替捕获探针2进行试验，作为特异性对照，其它条件与上相同。检测5:用捕获探针1代替捕获探针2进行试验，其它条件与上相同。将2.5^1浓度为500nM的凝血酶加入到实施例3制备所得的封闭过的MMPs-cp2的悬浮液中进行试验，其他步骤与条件同"检测1"中的条件。同时，做如下试验作为对比。检测7:用等体积水代替凝血酶进行试验，为空白对照，其它步骤和条件与检测6中相同。检测8:用浓度为500pM的凝血酶代替浓度为25nM的凝血酶进行试验，其它步骤和条件与检测6中相同。结果阴性对照CEA抗体(即检测2)与空白对照(即检测3)的两种荧光检测的荧光信号相当。可见本发明的该传感器对凝血酶的检测具有高度的特异性。用一生物素修饰的任意DNA序列为捕获探针(即检测4)进行检测的信号与空白对照的信号相当。可见本发明的该传感器具有较好的序列特异性。以较长的捕获探针2为探针时，对凝血酶的检测结果比捕获探针1时的检测结果更好。捕获探针1中的核酸适体序列是凝血酶的核酸适体序列(apl)，与凝血酶有两个特异性亲和位点(参考文献为L.C.Bock，L.C.Griffin,J.A.Latham,E.H.Vermaas，J.J.Toole,Selectionofsingle-strandedDNAmoleculesthatbindandinhibithumanthrombin.Nature1992,355，564-566.)。捕获探针2中的核酸适体序列是凝血酶的另一个核酸适体序列(ap2)，与凝血酶有一个特异性亲和位点(参考文献为D.M.Tasset,M.F.Kublik,W.Steiner，Oligonucleotideinhibitorofhumanthrombinthatbinddistinctepitopes.J.Mol.Biol.1997,272,688-698.)。桥梁分子中的核酸适体序列都是apl。捕获探针1的核酸适体与凝血酶有两个不同的结合位点，而捕获探针2的核酸适体与凝血酶只有一个结合位点。当以捕获探针1为探针时，连接了凝血酶之后，桥梁分子只能和凝血酶的另外一个位点进行结合，结合的几率较�。坏币圆痘裉秸�2为探针时，连接了凝血酶之后，桥梁分子可以和凝血酶的两个不同的结合位点中的任一位点结合，结合几率较高。因此，本发明优选捕获探针与桥梁分子中所含的序列是不相同核酸适体序列。可见，本发明的基于磁性颗�：秃怂崾侍�-靶物质结合机制的传感策略，具有较高的特异性。以任意一种核酸适体为捕获探针时，都可实现对凝血酶的定性检测。图2为荧光检测(Ex:480nm，Em:490700nm)结果。可见，未加入具有荧光信号倍增功能的水溶性的共轭聚合物，进行信号放大时，无法区分空白对照和靶的信号。其中图中约580nm处的微弱的峰不是所要的特征峰，可能是缓冲液引起的，信号强时这个峰自然就被掩盖了，故可不予考虑。加入PF溶液进行共轭聚合物信号放大的检测(Ex:380nm，Em:390一700nm)结果见图3。图2和3中，曲线a为封闭前的空白对照试验结果(即检测3);曲线b为封闭前的25nM凝血酶试验结果(即检测l);曲线c为封闭后的空白对照试验结果(即检测7);曲线d为封闭后的25nM凝血酶试验结果(即检测6)。由图可见，采用封闭措施以后，空白对照(曲线a)的信号显著降低，表明体系中的非特异性吸附明显减少；而相同浓度靶(曲线d)的信号则略有升高。这是由于非特异性吸附的减少使凝血酶的结合效率增加的缘故。可见，使用BSA对磁性颗粒表面进行了封闭以后，降低了该传感器检测凝血酶时的本底信号，检测的信噪比大大提高，进一步提高了凝血酶检测的灵敏度。图4为加入PF溶液进行共轭聚合物信号放大的检测(Ex:380nm，Em:390—700nm)的结果，其中曲线a为封闭后空白对照试验结果(即检测7);曲线b为封闭后500pM凝血酶的试验结果(即检测8)。如图所示，使用BSA对磁性颗粒表面进行了封闭以后，可检测500pM凝血酶，比未封闭时提高了至少两个数量级。这与Heyduk(E.Heyduk,T.Heyduk,爿wa/.2005，77,1147)等报道的基于分子信标的荧光检测方法的灵敏度相当。与Xiao等(Y.Xiao,A.A.Lubin,A.J.Heeger，K.W.Plaxco，C7em.M2005,44,5456)报道的电化学传感器相比，灵敏度也提高12个数量级。18权利要求1、一种基于核酸适体的用于检测和定量靶物质的方法，包括以下步骤1)以磁性颗粒为固相载体，将捕获探针连接在磁性颗粒表面，得磁性颗粒-捕获探针复合物，该捕获探针为一单链核酸，其序列包括靶物质的核酸适体序列；2)在磁性颗粒-捕获探针复合物中加入待测样品进行反应，然后磁性分离，去除游离成分；3)将信号探针与桥梁分子杂交得双链核酸，以该双链的形式将信号探针加入步骤2)所得的反应体系中进行反应，然后磁性分离，去除游离成分；该信号探针是荧光标记的一任意序列的单链核酸，桥梁分子也是一单链核酸，其序列包括一端为与信号探针互补的序列，另一端为靶物质的核酸适体序列；4)通过核酸变性的方法将信号探针从磁性颗粒表面分离下来，对该信号探针上的荧光信号进行检测。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的核酸适体与磁性颗粒的连接通过表面的配体或受体与受体或配体之间的特异性亲和作用连接。3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)所述的磁性颗粒-捕获探针复合物与待测样品进行反应前，还包括步骤在磁性颗粒-捕获探针复合物中加入封闭液进行反应，以封闭磁性颗粒表面的空余的结合位点.4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的核酸变性的方法为常用的碱变性方法。5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)检测荧光信号时，先在荧光标记的信号探针中加入具有荧光信号倍增功能的水溶性的共轭聚合物，再进行荧光信号检测。6、根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述的荧光信号的检测方法是常用的分光光度法。7、一种采用权利要求1所述的方法进行检测和定量耙物质的固相生物传感器，包含固相载体、捕获探针、信号探针和桥梁分子，其特征在于，其中所述的固相载体为磁性颗粒，表面结合着能发生特异性亲和作用的配体或受体；所述的捕获探针为一结合着能与所述磁性颗粒表面的配体或受体发生特异性亲和作用的受体或配体的单链核酸，其序列包括靶物质的核酸适体序列；所述的信号探针是荧光标记的一任意序列的单链核酸；所述的桥梁分子也是一单链核酸，其序列包括一端为与信号探针互补的序列，另一端为靶物质的核酸适体序列；所述的靶物质至少有一个核酸适体，且当靶物质只有一个核酸适体时，靶物质与该核酸适体至少有两个结合位点。8、根据权利要求7所述的固相生物传感器，其特征在于，所述的能发生特异性亲和作用的配体或受体为亲和素或生物素。9、根据权利要求7所述的固相生物传感器，其特征在于，所述的捕获探针的序列在核酸适体与磁性颗粒连接处之间还包括一间隔序列，所述的桥梁分子中在与信号探针互补的序列和靶物质的核酸适体序列之间还包括一间隔序列。10、根据权利要求9所述的固相生物传感器，其特征在于，所述的间隔序列重复腺嘌呤碱基或胸腺嘧啶碱基。11、根据权利要求7所述的固相生物传感器，其特征在于，所述的荧光标记选自FAM和FITC。12、根据权利要求7所述的固相生物传感器，其特征在于，所述的捕获探针中的靶物质的核酸适体序列与桥梁分子中的靶物质的核酸适体序列，满足以下条件当靶物质只有一个核酸适体，且靶物质与该核酸适体有两个结合位点时，这两个序列相同，即同为该核酸适体序列；当靶物质存在两个及以上不同序列的核酸适体，且靶物质与每个核酸适体只有一个结合位点时，这两个序列不相同，即分别为选自该不同的核酸适体序列中不同的两个；当靶物质有两个及以上核酸适体，且靶物质与每个核酸适体的结合位点不止一个时，这两个序列相同或不相同，即分别为选自该不同序列的核酸适体序列中的任何一个。13、根据权利要求7所述的固相生物传感器，其特征在于，还包括选自封闭液、变性剂和共轭聚合物中的一种或多种。14、根据权利要求13所述的固相生物传感器，其特征在于，所述的封闭液为牛血清白蛋白，所述的变性剂选自NaOH溶液和KOH溶液，所述的共轭聚合物是水溶性聚芴，其结构式如下上述结构中，R=(CH2)3N+(CH3)2CH2CH3Br，n>10。15、根据权利要求7所述的固相生物传感器，其特征在于，所述的靶物质为蛋白质。16、根据权利要求15所述的固相生物传感器，其特征在于，所述的靶物质为凝血酶。全文摘要本发明公开了一种基于核酸适体的用于检测和定量靶物质的方法以及检测用的固相生物感应器，该方法包括以下步骤1)将捕获探针连接在磁性颗粒表面，该捕获探针的序列包括靶物质的核酸适体序列；2)加入待测样品进行反应；3)将信号探针与桥梁分子杂交得双链核酸，以该双链的形式将信号探针加入步骤2)所得的反应体系中反应，然后磁性分离，去除游离的信号探针；4)通过核酸变性的方法将信号探针从磁性颗粒表面分离下来，对该信号探针上的荧光信号进行检测。本发明适合检测靶物质种类广，包括蛋白质、有机小分子和金属离子等。本发明不仅具有较高的灵敏度，而且还解决了非特异性问题，在生物检测、疾病的早期诊断和治疗中有着重要的意义。文档编号G01N33/53GK101430334SQ20081020227公开日2009年5月13日申请日期2008年11月5日优先权日2008年11月5日发明者刘兴奋,樊春海,王丽华申请人:中国科学院上海应用物理研究所

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基于核酸适体的靶物质的检测方法及其固相生物感应器的制作方法