专利名称：利用拉曼信号对生物标记的半导体纳米晶的制备方法
技术领域：
本发明属于纳米材料和生物技术领域，涉及纳米材料的制备，纳米材料在生物标记方面的应用。
背景技术：
无机纳米粒子与生物分子组装，并利用无机纳米粒子自身的物理特性实施对生物分子的标记已经成为国际上研究的前沿课题。目前，利用的无机纳米材料的物理性质主要包括金属的等离子吸收显色，半导体纳米晶的光致荧光特性，磁纳米粒子的磁学性质等。这些方法对于标记和检测生物大分子的特性和活动方面起到了重要的作用。当前国际上许多研究小组致力于用无机荧光半导体纳米晶标记方法来代替有机分子荧光标记，生物分子的标记经历了从第一代的放射性物质的标记，第二代的酶连免疫标记，第三代的有机染料分子标记到现在的第四代的无机半导体荧光纳米晶的荧光标记方法的发展过程。利用无机纳米晶进行标记其出发点在于三方面首先，有机染料分子具有不稳定的特点，在光的照射下容易出现光漂白现象，而无机半导体纳米晶克服了有机分子的这一缺点，无机半导体纳米晶具有强的抗光漂白；其次，相对于无机纳米晶荧光发射的半峰宽来讲，有机染料分子具有宽的半峰宽，不同染料分子之间的荧光光谱发生重叠，这使应用多光路标记受到了限制。第三，有机染料分子的激发光谱都是很窄的，不同的染料分子只能用不同的激发光源来激发，而对于无机半导体纳米晶，具有很宽的激发光谱，应用一种光源可以同时激发不同尺寸的纳米晶，这为多光路标记节省了发射光源。正是基于以上三点，各国的研究人员对无机纳米晶的荧光标记生物分子作了大量的研究工作。但是对于无机半导体纳米晶对于生物分子的荧光标记，也存在着问题，第一，具有荧光特性的纳米晶，一般都是含有Cd，Pd，HgII-VI半导体纳米晶等，这些材料一般都是环境不友好的，对生物体本身是有害的。第二，应用这些材料与生物分子偶联的时候，涉及到纳米晶的相转移，纳米晶与生物分子的对接等问题，这些过程是繁琐和复杂的，能够得到能够应用于生物标记的荧光纳米晶是不容易的，这限制了无机纳米晶的应用。为此能够获得环境友好的，制备简单的，标记信号灵敏度高的新的标记手段是各国研究人员所关注的问题。2003年，美国西北大学的Mirkin教授首次提出用Ag增强金表面的染料的拉曼信号对未知生物分子标记的想法，利用染料分子的不同拉曼信号实施对生物分子的检测，是一种新型的标记手段，它克服了荧光信号受介质环境干扰的特点，同时拉曼的线宽相对于荧光的线宽要更窄，这对于检测信号的灵敏度更具有优势。但是用染料的拉曼信号对材料进行标记同样具有染料分子不稳定的特点，本发明设计采用了无机半导体纳米晶的共振拉曼信号实施对生物分子的标记。
目前，利用染料和量子点的生物荧光标记方法由于具有半峰宽，背景干扰大以及环境不友好等缺点，本发明主要是针对以上标记的缺点提出了用无机纳米晶的特征指纹拉曼信号对未知的蛋白或核酸进行标记的新方法。
ZnO等宽带隙纳米晶作为一种无毒，无害生物友好的氧化物被广泛地应用于紫外发射光电子器件。同时我们还注意到ZnO等在He-Cd激光激发下具有多级的拉曼特征信号峰，并且能够被金属(Au，Ag，等)所增强。为此，我们首次提出将利用ZnO等半导体材料的拉曼信号对生物分子进行标记。同时为了获得更强的拉曼信号，我们采用了金属纳米晶(Au，Ag，等)对半导体纳米晶进行表面的包覆，这种包覆起到了两方面的作用，首先，金属与ZnO等半导体纳米晶产生等离子体的共振作用，它能够使半导体纳米晶的共振拉曼信号增强。另外，由于金属纳米晶的表面能够与有机分子基团(巯基等)发生很强的配位作用，这为无机纳米材料与与生物分子偶联起到了一个桥梁的作用，并进一步利用具有指纹特征半导体纳米晶的共振多级Raman指纹信号实施对未知分子的检测。
发明的内容本发明的目的之一是提供一种利用拉曼信号对生物标记的无机半导体纳米晶的制备方法本发明的目的之二是利用无机半导体纳米晶进行生物标记。
1.制备增强Raman信号的ZnO/Au核壳纳米晶首先在无水乙醇中合成出不同尺寸的ZnO纳米晶，ZnO的制备采用的是将含有锌离子的盐(醋酸锌)与碱(氢氧化锂，四甲基氢氧化胺等)的反应。不同尺寸的ZnO可以通过控制温度来获得。获得的ZnO纳米晶在乙醇溶液中是稳定存在的。
其次，利用将高氯酸金盐和金属还原物质(对苯二酚，柠檬酸钠等)分别溶解在无水乙醇中，然后以上述制备的ZnO溶液作为母液，将配置的溶液再快速搅拌得条件下分别滴入到母液中。将结果的溶液通过离心分离出来，离心出的物质清洗，重新溶入到乙醇溶液中。
最后采用向制备的ZnO/Au的溶液中加入有机配体(巯基乙酸，巯基乙胺等)，再次采用离心的方法将溶液重新分离出来，并将样品分散到PH＝7-10之间的缓冲溶液中。这种具有拉曼信号的探针能够通过静电与生物分子对接，从而实施对生物分子的标记。
2.制备增强拉曼信号的ZnO/Ag核壳纳米晶。
在超声的条件下，将新制备的ZnO乙醇溶液加入到硝酸银的水溶液中，同时向这种混合溶液中，逐渐的滴加对苯二酚水溶液。对苯二酚可以还原硝酸银形成金属银簇，银簇会以ZnO为晶种在其表面沉积形成Ag纳米晶壳层，Ag对ZnO的拉曼信号有增强作用，由于Ag能够与有机基团具有强的配位能力，制备的ZnO/Ag核壳结构纳米晶能够与生物分子偶联。
本发明产生等离子体的共振作用，使半导体纳米晶的共振拉曼信号增强。由于金属纳米晶的表面能够与有机分子基团(巯基等)发生很强的配位作用，为无机纳米材料与生物分子偶联起到了桥梁的作用，可对生物体进行稳定、无害的标记，并进一步实施利用具有指纹特征半导体纳米晶的共振多级拉曼信号对未知分子的检测。
具体实施例方式
1.制备ZnO/Au的核壳纳米晶并将其相转移金的前驱材料选用HAuCl4，还原金的还原剂可选用对苯二酚或者是柠檬酸钠。ZnO作为晶种，在其表面生长Au纳米晶。具体试验的过程如下取5～10ml 0.1M ZnO乙醇溶液，将其放入到容积中并用绝对无水乙醇稀释10倍，另称取HAuCl4，其物质的量与ZnO的物质的量之比在1∶5～1∶10之间，既将称取的0.05～0.2mM的HAuCl4溶解在10ml乙醇溶液中，同时称取还原剂对苯二酚，其物质的量应与HAuCl4的物质的量相同，将还原剂也溶解在乙醇溶液中。然后HAuCl4乙醇溶液和对苯二酚乙醇溶液逐滴加入到快速搅拌的ZnO乙醇溶液中，滴完之后让溶液静置陈化10～12小时，其目的是使晶体生长完全。陈化完全后的溶液通过离心的方法将纳米晶分离并重新分散到无水乙醇溶液中。进一步为了能够应用于生物标记，采用巯基化合物(如巯基苯胺，巯基乙酸等)作为配体与ZnO表面的Au配位，ZnO与巯基化合物的物质量的比应在1∶10～1∶20之间。将特定量的巯基化合物加入到ZnO/Au乙醇溶液中，搅拌反应24-30h，反应结束后，将粒子离心出来并分散到PH在7～10之间的缓冲溶液中，所制备的ZnO/Au溶液可以用于与生物分子对接偶连。
2.制备ZnO/Ag的核壳纳米晶并将其相转移银的前驱材料选用AgNO3，还原金的还原剂可选用对苯二酚或者是柠檬酸钠。其制备方法与制备ZnO/Au核壳纳米晶的方法相似。同样称取5～10ml 0.1M ZnO乙醇溶液，将其放入到容积中并用绝对无水乙醇稀释10倍，而AgNO3的物质的量与量与ZnO的物质的量之比在1∶5～1∶10之间，既将相应量的AgNO3溶解在乙醇溶液中，同时将相对应的还原剂对苯二酚也溶解在乙醇溶液中，然后AgNO3乙醇溶液和对苯二酚乙醇溶液逐滴加入到快速搅拌的ZnO乙醇溶液中，滴完之后让溶液静置陈化10～12小时，其目的是使晶体生长完全。陈化完全后的溶液通过离心的方法将纳米晶分离并重新分散到无水乙醇溶液中。进一步为了能够应用于生物标记，我们采用巯基化合物(如巯基苯胺，巯基乙酸等)作为配体与ZnO表面的Ag配位，ZnO与巯基化合物的物质量的比应在1∶10～1∶20之间。将特定量的巯基化合物加入到ZnO/Au乙醇溶液中，搅拌反应24-30h，反应结束后，将粒子离心出来并分散到PH在7～10之间的缓冲溶液中，所制备的ZnO/Ag溶液可以用于与生物分子对接偶连。
3.无机半导体纳米晶进行生物标记拉米夫定是核苷类的抗乙型肝炎病毒(HBV)的新药，是HBV复制强有力的抑制剂，其作用靶为HBV DNA多聚酶，通过抑制前基因组RNA逆转录为负链DNA及DNA链延伸过程中起到链终止作用来抑制HBV复制.体内外研究均已表明，拉米夫定耐药主要是由HBVP基因C区YMDD变异所引起.一旦出现YMDD变异株，对拉米夫定不再敏感.耐药可能会伴有HBV DNA定量反跳和肝功能变化，甚至导致病情恶化。本发明主要是使用通用模板和ZnO拉曼探针实施检测.通用引物由5’端的通用模板(UT)序列和3’的特异引物序列构成，通用模板序列不与任何天然核酸序列相匹配只能与通用Raman探针匹配.该标记手段具有高灵敏、高特异、高精确度和高通量特点，在临床病原体检测、药效监测、突变分析以及相关科学研究领域中具有广阔的应用前景.
权利要求
1.利用拉曼信号对生物标记的半导体ZnO/Ag核壳纳米晶的制备方法，其特征是在超声的条件下，将新制备的ZnO乙醇溶液加入到硝酸银的水溶液中，同时向这种混合溶液中，逐渐的滴加对苯二酚水溶液，对苯二酚以还原硝酸银形成金属银簇，银簇会以ZnO为晶种在其表面沉积形成Ag纳米晶壳层，Ag对ZnO的拉曼信号有增强作用，由于Ag能够与有机基团具有强的配位能力，制备的ZnO/Ag核壳结构纳米晶能够与生物分子偶联；银的前驱材料选用AgNO3还原金的还原剂用对苯二酚或者是柠檬酸钠，具体方法是称取5～10ml 0.1M ZnO乙醇溶液，将其放入到容积中并用绝对无水乙醇稀释10倍，而AgNO3的物质的量与量与ZnO的物质的量之比在1∶5～1∶10之间，既将相应量的AgNO3溶解在乙醇溶液中，同时将相对应的还原剂对苯二酚也溶解在乙醇溶液中，然后AgNO3乙醇溶液和对苯二酚乙醇溶液逐滴加入到快速搅拌的ZnO乙醇溶液中，滴完之后让溶液静置陈化10～12小时，陈化完全后的溶液通过离心的方法将纳米晶分离并重新分散到无水乙醇溶液中，采用巯基化合物巯基苯胺或巯基乙酸作为配体与ZnO表面的Ag配位，ZnO与巯基化合物的物质量的比应在1∶10～1∶20之间，将定量的巯基化合物加入到ZnO/Au乙醇溶液中，搅拌反应24-30h，反应结束后，将粒子离心出来并分散到PH在7～10之间的缓冲溶液中。
2.按权利要求1制备的利用拉曼信号对生物标记的半导体纳米晶在生物标记中的应用。
全文摘要
本发明属于纳米材料和生物技术领域，涉及纳米材料的制备，纳米材料在生物标记方面的应用。首先在无水乙醇中合成出不同尺寸的纳米晶，其次，利用将高氯酸盐和金属还原物质分别溶解在无水乙醇中，将制备的溶液作为母液通过离心分离，采用加入有机配体等制备具有拉曼信号的半导体纳米晶，并通过静电与生物分子对接，实施对生物分子的标记。本发明产生等离子体的共振作用，使半导体纳米晶的共振拉曼信号增强。由于金属纳米晶的表面能够与有机分子基团发生很强的配位作用，可对生物体进行稳定、无害的标记，并进一步实施利用具有指纹特征半导体纳米晶的共振多级拉曼信号对未知分子的检测。
文档编号G01N21/63GK101071135SQ200710103140
公开日2007年11月14日 申请日期2005年9月26日 优先权日2005年9月26日
发明者刘益春, 单桂晔, 邵长路 申请人:东北师范大学
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