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专利名称：一种样本中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种样本中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测方法。
背景技术：
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(简称NGAL)是1993年在中性粒细胞内首 先被发现的，与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展 等过程相关。近年来国内外的研究表明，NGAL蛋白在多种疾发过程中具有特异性表达变化 的特点，使得NGAL成为检测疾病的生物标志物。在发生缺血性和毒性肾损伤过程中，肾小管上皮细胞中的NGAL将显著增加，在开 始的两个小时内，尿液和血液中NGAL水平将显著增加，因此NGAL是早期急性肾损伤的敏感 标志物。急性肾功能损伤预后将发展成为急性肾功能衰竭。通用的诊断方法如测定血清肌 酐或者半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C)，只能在损伤后一天甚者几天内检测。有研 究表明，健康志愿者尿液中NGAL含量检测结果分布0. 7-9. 6ng/ml，平均值为5. 3ng/mL·而 血浆中的含量检测结果为37-106ng/ml，平均值为63ng/ml。当肾损伤后，随机检测重病患 者，尿液NGAL的浓度为llOng/ml到40000ng/ml不等。而他们EDTA抗凝血浆检测结果为 25ng/ml到3491ng/ml。根据急性肾衰竭患者检测的90%阳性预测值判断，尿液中NGAL的 阳性判断值为350ng/ml，而血浆检测的阳性判断值为400ng/ml。同源性分析表明，NGAL与小鼠的Mp3和大鼠的neu相关lipocalin(neu-related lipocalin, NRL)具有很高的同源性。小鼠的Mp3在肝脏中合成，炎症反应时上调，另外 24p3也见于巨噬细胞和子宫内膜，尤其是生殖期的子宫内膜。用类固醇激素可使相应组织 中的Mp3水平升高，而一些生长因子和肿瘤促进因子也可以使其升高。猴毒SV40、多瘤毒 或其他毒感染可以刺激培养的小鼠肾细胞Mp3mRNA的表达增加7_10倍。且随着大T抗原 的合成的增加而升高。因此Mp3被认为是癌基因产物。这同时表明NGAL可能是人类的一 种新的癌基因。实验证明，在卵巢癌细胞系、结肠肿瘤和乳腺癌等中的NGAL的表达明显增强。免 疫组化证明在肺癌组织中的NGAL强阳性，而支气管肺泡细胞癌和粘液细胞癌染色最强， NGAL在胰腺癌中会从阴性增加到强阳性。综上所述，建立针对样本中NGAL的快速检测方法为该蛋白的研究将会提供一个 强有力的工具。

发明内容
本发明提供了检测样本中NGAL的方法所述方法包含以下步骤i)使用相关器械收集样本包括人的血清、血浆和尿液， )样本与抗体接触反应，
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iii)检测样本中NGAL的浓度。优选通过免疫化学方法来测定NGAL水平，这种方法的例子包括但绝不限于免疫 比浊法、夹心法ELISA、竞争法ELISA。对生物样本，可以用任何提供满意的分析特异性、灵敏度和精确度的方法来进行。 检测实验中，使用NGAL的单克隆、多克隆抗体或任何可与NGAL特异性结合的分子。结合 分子首先固相化捕捉样品中的NGAL形成复合物，而另外一个标记可检测的结合分子再结 合上述复合物，最后通过特定方法显示出复合物量的值从而间接反应出样品中NGAL的含 量。另外可以直接利用游离的NGAL抗体或偶联乳胶颗粒以胶体形式存在的抗体与样品中 的NGAL直接结合所形成的复合物引起浊度变化；用光投射强度或光散射强度表征这种变 化；从人NGAL标准品的浓度与相应光散射强度或光透射强度的标准曲线查出待检标本的 人NGAL的含量；


图1是夹心法ELISA检测重组人NGAL标准曲线图； 图2是竞争法ELISA检测重组人NGAL标准曲线图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1乳胶增强免疫比浊法检测人尿液中的NGAL含量实现本实例的技术方案一种检测人NGAL的免疫比浊法，用抗NGAL的多克隆抗 体首先与乳胶交联，然后用交联后的乳胶溶液与待检标本的NGAL反应，所形成的复合物引 起浊度变化；用光投射强度或光散射强度表征这种变化；从NGAL标准品的浓度与相应光散 射强度或光投射强度的标准曲线查出待检样本的NGAL含量；其中所用的NGAL的多克隆抗 体效价至少为1 500，不含杂抗体，具有识别NGAL多种抗原决定簇；待检标本用稀释剂做 1 200-1 1000 稀释；上述方法中，所述NGAL标准品是纯NGAL，其浓度为0. 2mg/ml，先用稀释剂做 1 200倍稀释，再做倍比稀释，做成系列标准品，供作标准曲线用；实施例2用夹心法ELISA确定人尿液NGAL浓度具体步骤是包被NGAL抗体A ；配制系列NGAL标准品；准备人尿液；使系列标准品 或待定值的人尿液加入96微孔板孔内，再使已标记的、结合位点不同于包被在96微孔板上 抗体A的抗体B结合，用基质液显色20-30分钟后终止显色，10分钟后测定上述系列标准品 和待检测的人尿液中NGAL反应后的吸光度；建立系列标准品的浓度和吸光度的标准曲线 并从曲线中查出待定值的人尿液的NGAL的浓度。实施例3用竞争法ELISA确定人尿液NGAL浓度具体步骤是包被NGAL多克隆抗体；配制系列NGAL标准品；准备人尿液；使系列 标准品或待定值的人尿液和已标记的NGAL标准品混合；用基质液显色20-30分钟后终止显 色，10分钟后测定上述系列标准品和待检测的人尿液中NGAL反应后的吸光度；建立系列标 准品的浓度和吸光度的标准曲线并从曲线中查出待定值的人尿液的NGAL的浓度。
权利要求
1.一种样本中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，建立在抗原抗体特异性反应原理基础上，通 过包括但不限于免疫比浊法以及酶联免疫(ELISA)法的免疫学方法检测样品中人中性粒 细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的浓度。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，包括如下步骤i)使用相关器械收集样本包括血清、血浆和尿液， )样品中的NGAL与抗体接触反应，iii)检测样本中人NGAL的浓度。
4.根据权利要求2所述的样品，其特征是包括但不限于人的尿液、血浆和血清。
5.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于该抗体是通过天然或重组的人NGAL免疫动 物获得的多克隆抗体或者单克隆抗体。
6.根据权利要求2所述的免疫比浊法，其特征在于用抗人NGAL的抗体，与待检标本 的人NGAL反应，所形成的复合物引起浊度变化；用光投射强度或光散射强度表征这种变 化；从人NGAL标准品的浓度与相应光散射强度或光透射强度的标准曲线查出待检标本的 人NGAL的含量。
7.根据权利要求2所述的酶联免疫(ELISA)法，其特征在于包括双抗夹心法ELISA、 竞争法ELISA。
8.根据权利要求2所述的酶联免疫(ELISA)法，其特征在于人NGAL预先固相化，或 人NGAL抗体预先固相化。
9.根据权利要求2所述的酶联免疫(ELISA)法，其特征在于检测NGAL含量的范围为 7. 8ng/ml-500ng/mlo
10.根据权利要求7所述的竞争法，如果是直接竞争法，其特征在于预先固相化人 NGAL抗体。
11.根据权利要求7所述的竞争法，如果是间接竞争法，其特征在于预先固相化人 NGAL。
12.根据权利要求8所述的固相化，其特征在于将人NGAL或人NGAL抗体包被到固相 支持物上，该支持物可以是，例如用于酶联免疫吸附试验的聚苯乙烯或聚氯乙烯表面，或胶 乳(聚苯乙烯)颗粒，或由压缩的聚乙烯颗粒组成的过滤玻璃棒，或多孔消化纤维素基质， 或事实上是在免疫化学分析使用中任何合适的支持物。
全文摘要
本发明涉及一种样本中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测方法。该检测方法是使用抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的抗体，与待检标本的人NGAL反应，所形成的复合物引起浊度变化；用光投射强度或光散射强度表征这种变化；从人NGAL标准品的浓度与相应光散射强度或光透射强度的标准曲线查出待检标本的人NGAL的含量；该方法具有灵敏度高、回收率高、重复性好的优点，为测定尿液或血浆等样本中NGAL确定了一个简便、重现性好、适应性强、快速的检测手段。
文档编号G01N21/31GK102072960SQ20101013622
公开日2011年5月25日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者华权高, 沈鹤霄 申请人:武汉生之源生物科技有限公司