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专利名称：一种评估药物对hERG作用而引起心律失常的试验方法
技术领域：
本发明涉及一种重要的药物安全性评价技术，是一种新的评估药物对hERG作用而引起心律失常的试验方法。
背景技术：
对于新药临床前心脏的安全性评估是涉及到患者安全具有十分重要的意义，2005 年起，G7各发达国家开始执行由欧盟、日本和美国的药品法规机构和大型制药企业联合制定的关于心脏安全评估的S7B法规，收益巨大。药物的临床前心脏安全评估大大降低了新药对心脏的副作用，使欧美制药公司每年节约150多亿美元的研发费用。随着时间的推移， S7B法规将会逐渐被各国的药物管理局和制药公司所接受。我国是一个正在崛起的发展中国家，在这十多年来生物制药工业已取得了突飞猛进的成绩并将逐步与西方国家缩短差距，从现在即开始执行S7B法规将为我国的药品走向世界打开方便之门，特别是对我国传统中药的利用开发及临床应用将起到非常关键的作用。服用和注射中药是我国用药的最大特点，但中药注射剂常有严重不良反应的报道，其中很多是由于心律失常导致的并发症。然而，进一步研究发现hERG离子通道阻断与临床患者诱发TdP的相关性很差。这样就导致了非常高的TdP假阳性率，使得各制药公司蒙受了巨大损失。最新的研究表明不是每个阻断hERG通道的化合物都能引起心律失常。阻断hERG通道诱发torsadogenesis 的药物必须符合以下三个条件1、动作电位三角化；2、逆向刺激频率依赖性(动作电位产生延长)与心律频率成反比；3、在心脏各个部位由于药物引起的动作电位延长非一致性例如本公司创办人早在20年前就发现常用中药黄连素会延长心脏动作电位并且改变心肌上的Ca+通道，其相关的结果早已发表在中外的电生理杂志上。另外随着糖尿病发病率的不断提高，糖尿病心肌病变的发病率也随之增加，这类病人对于药物引起的心律失常发生率是正常人的2 4倍，因此对于药物进行严格、正确的心脏安全评价，既防止由于药可能存在的hERG离子通道阻断，在临床使用中导致患者诱发心脏类高危病变，同时也有效消除由于某些检测结果中的药物检阳性而导致的带给药物研发、制造生产者造成的巨大损失。因此，随着中医中药在国际上的影响力的上升，国外对我国中药的需求也会得到提升，因此针对于中药使用安全性的要求也会日益提到重要议事日程上来。

发明内容
本发明的目的旨在提出一种适应我国国情的专业化全面的新药临床前心脏安全评估平系统，既提高国内用药安全型水平，同时也为将来与国际接轨和将国内药品制造企业推向国际创造条件。
这种评估药物对hERG作用而引起的心率失常的试验方法，包括体外细胞模型通道分析、离体心脏组织检测和器官水平/整体动物三个流程。本技术其特征在于以下重要步骤a)按常规把细胞去极化至40mV/5ms来激活hERG离子通道，然后把细胞钳回到-50mv/s以记录通道的失活过程，在-50mv记录到的最大电流即为所要记录的hERG通道电流幅度；b)进行下列电压钳流程试验，获取药物脱离通道的速度；该试验包含2段2秒的两次去极化脉冲激化过程；脉冲将细胞去极化至20mv，两个脉冲去极化之间，细胞被钳回至-SOmv共1秒钟，应用在第一次2秒钟的去极化中，比较不同时间的药物阻断程度就能估算出药物阻断hERG离子通道的时间依赖性，，在第二次去极化中测出150ms后的“再阻断” 强度，然后将其与第一次去极化末端获得的阻断强度进行比较，就能得到药物脱离通道的速度；C)用 IC5015Qms/IC505_s 和 IC5015Qms/IC5(^s 来计算 500ms 和 2s 时化合物 hERG 离子通道的时间依赖性；比值越大说明它的时间依赖性越大；d)在确认药物在阻塞hERG离子通道试验中具有明显时间依赖性的前提下，运用 REec = (IC150ms_2-IC502s)/(IC150150ms-IC502s)计算出该药物hERG阻断剂的回复时间指数， 依回复时间指数小于25的药物确认为具有较大诱发TdP的可能性药物。根据以上技术案提出的这种评估药物对hERG作用而引起的心率失常的试验方法，由于系统流程十分简单，因此便于在实际应用中的推广和使用，显然这既可以便于对临床使用前的药物进行TdP风险的确认，同时也可避免由于假阳性检测结果的出现而致使药品研发厂商的巨大损失，同时也可以减轻国家和医疗机构的不必要医疗开支。


图1为测试药物临床前安全评估的系统流程框图；图2为本发明药物阻断hERG的时间依赖性的膜片钳；图3为35个药物阻断hERG与时间依赖性关系图。
具体实施例方式以下结合实施例进一步阐述本发明。本发明提出的这种评估药物对hERG作用而引起的心率失常作用的试验方法，它是对目前国际上普遍使用方法的一种更全面和更精确的创新方案，该试验方法包括体外细胞模型通道分析、离体心脏组织检测和器官水平/整体动物三个流程，其特征在于所外细胞模型通道分析采取以下步骤进行1)、按常规把细胞去极化至40mV/5ms来激活hERG离子通道，然后把细胞钳回到-50mv/s以记录通道的失活过程，在-50mv记录到的最大电流即为所要记录的hERG通道电流幅度；2)、进行电压钳流程试验，获取药物脱离通道的速度；该试验包含2段2秒的两次去极化脉冲激化过程；脉冲将细胞去极化至20mv，两个脉冲去极化之间，细胞被钳回至-SOmv共1秒钟，应用在第一次2秒钟的去极化中，比较不同时间的药物阻断程度就能估算出药物阻断hERG离子通道的时间依赖性，，在第二次去极化中测出150ms后的“再阻断” 强度，然后将其与第一次去极化末端获得的阻断强度进行比较，就能得到药物脱离通道的速度；3)、用 IC5015Qms/IC505_s 和 IC5015Qms/IC5(^s 来计算 500ms 和 2s 时化合物 hERG 离子通道的时间依赖性；比值越大说明它的时间依赖性越大；4)、在确认药物在阻塞hERG离子通道试验中具有明显时间依赖性的前提下，运用 REec = (IC150ms_2-IC502s)/(IC150150ms-IC502s)计算出该药物hERG阻断剂的回复时间指数， 依回复时间指数小于25的药物确认为具有较大诱发TdP的可能性药物。本发明申请人运用上述方法进行了 35个化合物的实验，测试剂量为10uM。常规的测试筛选程序如下首先，把细胞去极化至40毫伏/5秒来激活hERG离子通道，然后把细胞钳回到_50 毫伏/5秒，并记录通道的失活过程。在-50毫伏/5秒所记录到的最大电流就是所要记录的hERG离子通道电流幅度，如药物减低hERG离子通道电流幅度，就表明此药物会对通道起到阻断作用。其次，进一步观察药物阻断hERG离子通道的时间依赖性，用电压钳流技术进行去极化脉冲检测试验，该电压钳流程包含2端2秒的计划脉冲过程，脉冲将细胞去激化至20 毫伏。两个脉冲之间，细胞被钳回至-80毫伏共1秒钟时间。随后，根据第一段脉冲去极化记录药物阻断离子通道的强度与时间的关系，经过 20毫伏脉冲去极化后，细胞被再钳回到-80毫伏而使药物从通道受体中脱离出来。1秒钟以后细胞再次被去极化至20毫伏2秒钟，这样在第一次2秒钟的去极化中，比较不同时间的药物阻断程度就能估算出药物阻断hERG离子通道的时间依赖性。最后，依照关系式I Ke。= (IC150ms_2-IC502s)/(IC15015(lms-IC502s)计算出该药物 hERG阻断剂的回复时间指数。在对上述35个已知结构的hERG离子通道阻断剂的验证中多菲利特 (Dofetilide)显示在整个2秒时间去极化过程中其hERG阻断强度是一致的，均为IC150s 在150毫秒，500毫秒和2秒时分别为0. 81、1. 44和1. · 84uM。500毫秒和2秒时的阻断通道时间依赖性用公式IC5015(lms/IC505_s 和 IC5015(lms/IC5(^d|lJ算。多菲利特(Dofetilide)是一个众所周知的非时间依赖性的hERG离子通道阻断剂，500ms和2s时的阻断比例分别为0. 561和0. 44。相比之下，酮色林(Ketanserin)的实验数据显示它阻断hERG离子通道是有着很强的时间依赖性，50毫秒和2秒的阻断比例分别为10和21. 7，也就是说2秒钟的阻断强度是500毫秒时的1倍多。药物在去极化过程中和hERG离子通道的受体结合从而阻断了通道，反过来说明大多数药物在静息电位(-80毫伏)时也会从受体中脱离出来使通道重新开放。药物从通道受体脱离的速率可以用公式 (IC150ms_2-IC502s)/(IC15015Qms-IC502s)来表示。试验结果表明多菲利特在-80毫伏时从阻断中脱离受体，其脱离的速度非常慢， REec仅为-58. 3%。相反的例子是海拉明(Diphenhydramine)，它和多菲利特一样都呈微弱的时间依赖性阻断，但其在-80毫伏中的恢复率较高，达到94. 9%，在一般情况下。药物具有缓慢的时间依赖将有比较高的TdP风险。本项目申请人用了 35个已用于临床的药物，把已知的临床QT间期延长程度及诱发TdP发病率来对比由本公司所发明的实验方法所判断出的药物TdP诱发几率，这样就能得出由本实验方法来判断化合物心脏安全评估的可靠性。药物阻断hERG的时间依赖性可用图2中公式来计算，图3详细描述了 35个药物阻断hERG离子通道的时间依赖性，比例值越大说明它的时间依赖性越强。结果显示在20毫伏去极化过程，19个药物在阻塞hERG离子通道说有着明显的时间依赖性。根据产生心律失常的机理以及药物作用于通道的特性， 一般来说与时间相关的并复苏缓慢的hERG阻断剂应具有很高的TdP风险。利用图2中的公式，可计算出这19个具有时间依赖性的hERG阻断剂的恢复时间。表1列出具体19个药物的恢复时间指数以及相对应的各个药物的临床诱发TdP的几率。不难看出恢复指数小于 25的药物具有较大的诱发TdP的可能性，其结果和用临床数据而得到的Hammond标准分级基本相同。所以利用以上发明可以比常规办法更精确地预测化合物可能在临床上诱发心律
失常的风险。
表1
药物名称恢复速度Hammond 等级TdP
Disopyramide1001有
Enclomiphene100无
Sparfloxacin1004少量
Dronedarone63. 371无
Quinidine32. 551有
Olanzapine31. 545未知
Chlorpheniramine24. 865很少
Tedisamil16. 761有
Azilimide15. 231有
Thioridazine3. 71有
Ondansetron2. 87有
Sertindole0. 892有
Ketanserin0. 58有
Verapamil05很少
Droperidol0有
Haloperidol03有
Risperidone05无
Astemizole02有
domperidone04少量
权利要求
1. 一种评估药物对hERG作用而引起的心率失常的试验方法，包括体外细胞模型通道分析、离体心脏组织检测和器官水平/整体动物三个流程，其特征在于a)按常规把细胞去极化至40mV/5ms来激活hERG离子通道，然后把细胞钳回到_50mv/ s以记录通道的失活过程，在-50mv记录到的最大电流即为所要记录的hERG离子通道电流幅度；b)进行下列电压钳流程试验，获取药物脱离通道的速度；该试验包含2段2秒的两次去极化脉冲激化过程；脉冲将细胞去极化至20mv，两个脉冲去极化之间，细胞被钳回至-SOmv共1秒钟，应用在第一次2秒钟的去极化中，比较不同时间的药物阻断程度就能估算出药物阻断hERG离子通道的时间依赖性，，在第二次去极化中测出150ms后的“再阻断” 强度，然后将其与第一次去极化末端获得的阻断强度进行比较，就能得到药物脱离通道的速度；c)用IC5015(lms/IC505(l(lms 和 IC5015(lms/IC502s 来计算 500ms 和 2s 时化合物 hERG 离子通道的时间依赖性；比值越大说明它的时间依赖性越大；d)在确认药物在阻塞hERG离子通道试验中具有明显时间依赖性的前提下，运用I Kec;= (IC150ms-2-IC502s) / (IC150150ms-IC502s)计算出该药物hERG阻断剂的回复时间指数，依回复时间指数小于25的药物确认为具有较大诱发TdP的可能性药物。
全文摘要
一种评估药物对hERG作用而引起心率失常的试验方法，其特征在于按常规把细胞去极化激活hERG离子通道，然后把细钳回到以记录通道的失活过程，记录到所要记录的hERG离子通道电流幅度；进行电压钳流程试验，获取药物脱离通道的速度；用IC50150ms/IC50500ms和IC50150ms/IC502S来计算500ms和2s时化合物hERG离子通道的时间依赖性；比值越大说明它的时间依赖性越大；在确认药物在阻塞hERG离子通道试验中具有明显时间依赖性的前提下，运用RRec＝(IC150ms-2-IC502S)/(IC150150ms-IC502S)计算出该药物hERG阻断剂的回复时间指数，依回复时间指数小于25的药物确认为具有较大诱发TdP的可能性药物。
文档编号G01N27/00GK102253084SQ20101017702
公开日2011年11月23日 申请日期2010年5月17日 优先权日2010年5月17日
发明者张之颢 申请人:上海灏远生物医药科技有限公司