专利名称：牛初乳及其制品中免疫球蛋白g半定量快速检测试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条及其制备方法。
背景技术：
科学研究发现，奶牛的初乳最符合人体的需要，所含的各种生长素可调节人体免 疫功能，并帮助骨骼、肌肉、神经、软骨关节的生长发育。随着我国乳业的迅速发展，奶牛存 栏数不断增长，牛初乳产量持续增加，据统计2005年底我国奶牛存栏1100万头，按每头奶 牛分娩后前3d所产初乳量43. 5kg，以犊牛消耗Ilkg计，则每头母牛有32. 5kg初乳剩余，按 每年60%奶牛分娩产犊，则每年将有2. 15万吨的牛初乳有待加工利用，可见牛初乳产量巨 大。近年来，牛初乳作为免疫型功能因子在食品和保健品中得到广泛应用，价格倍增， 有的养牛户将营养成分和功能性组分大为降低的常乳作为初乳原料交售，鱼目混珠，以次 充好，对初乳制品的质量造成不良影响，把好原料关日益收到消费者的关注，同时市售的初 乳粉中IgG含量变化很大，同其产品所注明的含量存在很大差异，为了保证目前牛初乳制 品健康发展，防止假冒初乳粉或其加工制品扰乱市�。斜匾匝蟹⒁恢侄耘３跞榧笆惺� 初乳产品进行快速含量测定的方法。牛初乳中免疫球蛋白G(IgG)含量丰富，为常乳的200倍，为人类初乳的50倍，牛 初乳中IgG含量与其它生物活性物质含量具有一定的正相关性，所以检测IgG含量是衡量 牛初乳及其制品生物活性的最佳途径(张和平等在乳品工业期刊上发表的牛初乳中免疫 球蛋白的测定.2001,29(2) -.23-24 Jaction, 2009)。现有牛初乳IgG检测方法琼脂免疫 单扩散法、琼脂免疫双扩散法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法等多种方法，但这些方法 只适合于实验室内检测，操作程序繁琐，需要时间长，不适合于现场操作(熊勇华，许杨，魏 华等在《食品工业科学》期刊上发表的HPIC法检测牛初乳中IgG含量；徐丽，生庆海.王玉 良等在《中国乳品工业》刊登的牛初乳制品功能性成分的分析；丁连才等在《中国奶牛》上 的牛初乳中活性物质IgG含量分析；蒋新月等在《中国乳品工业》上的检测牛初乳粉及其产 品中IgG质量浓度的三种方法比较)。李忠秋等人在《中国奶牛》上2008年第3期发表的 《免疫单扩散法检测牛初乳IgG含量方法改良及牛初乳样品的检测》中介绍了牛初乳及其制 品中IgG含量检测方面已经开展过相关工作，改进了琼脂免疫单扩散法，使其准灵敏度和 确性有所提高，还有刘春龙和李忠秋在吉林农业大学学报期刊上2006年第4期发表的《免 疫胶体金法和免疫单扩散法检测牛初乳中IgG含量的比较研究》中介绍建立了相应免疫斑 点金检测法，使得检测步骤有所简化，但仍不能满足现场检测的需要，尚未工厂化规模生产 应用，因此，建立一种适合于现场快速、简单的检测方法非常必要。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有牛初乳及其制品中免疫球蛋白G的检测操作程序繁琐，检测所需时间长，不适合于现场操作的问题，本发明提供了一种牛初乳及其制品中免 疫球蛋白G半定量快速检测试纸条及其制备方法。本发明的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条，由聚氯乙烯材 料(PVC)背衬、样品吸收垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水垫组成，在氯乙烯材料(PVC)背 衬上依次连续粘附有样品吸收垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中玻璃纤维与硝酸 纤维素膜有搭接，硝酸纤维素膜和吸水垫有搭接；所述玻璃纤维上包被有兔抗牛IgG-胶体 金标记物；所述硝酸纤维素膜上包被有1 4条兔抗牛IgG构成的检测线和1条豚鼠抗兔 IgG构成的质控线；其中每条检测线的兔抗牛IgG的包被量沿远离玻璃纤维的方向上依次 增加。本发明的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条的制备方法，是 通过以下步骤实现的一、采用柠檬酸三钠还原法制备得20nm胶体金，然后向20nm胶体金 中加入兔抗牛IgG抗体制备得兔抗牛IgG-胶体金标记物，然后包被在玻璃纤维上；二、将兔 抗牛IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上构成检测线，再将豚鼠抗兔IgG抗体包被在硝酸纤维 素膜上构成质控线，其中检测线的条数为1 4，检测线上兔抗牛IgG抗体的包被量依次增 加；三、在氯乙烯材料(PVC)背衬上依次连续粘附上样品吸收垫、步骤一得到的玻璃纤维、 步骤二得到的硝酸纤维素膜和吸水垫，其中玻璃纤维与硝酸纤维素膜有搭接，硝酸纤维素 膜和吸水垫有搭接；其中控制检测线的兔抗牛IgG抗体的包被量沿远离玻璃纤维的方向上 依次增加，得到牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条。本发明所依据的原理是通过待检样品(牛初乳或其制品)中IgG与兔抗牛IgG-胶 体金标记物反应，再与定量成横条状分布于硝酸纤维素膜上的兔抗牛IgG结合，通过显示 于硝酸纤维素膜上的显色的条纹数量，来判断样品中IgG的含量，显色条纹数越多，待检样 品中IgG含量越高。当待检样品中不含IgG时，只有质控线显色；如果质控线不显色的话， 说明半定量快速检测试纸条失效。本发明的试纸条具有不同兔抗牛IgG抗体的包被量的检测线，以达到确定牛初乳 及其制品中免疫球蛋白G的含量范围，快速简便地实现半定量确定牛初乳及其制品中免疫 球蛋白G。本发明的试纸条用标准牛IgG进行标定，将用标准牛IgG进行标定后的检测线的 条数以及显色检测线的不同显色程度(显色为红色系)制作出标准比色卡，在实际操作中 与标准比色卡比对，即可得到检测样品(牛初乳或其制品)中免疫球蛋白G的含量值。本发明的半定量快速检测试纸条上检测线的条数及检测线上兔抗牛IgG的包被 量可根据检测需要的灵敏度和准确度设计。本发明的试纸条用标准牛IgG进行标定，将一 定体积的不同浓度的标准牛IgG抗体试样滴加试纸条的样品吸收垫上，反应2min后，观察 试纸条上检测线6的显色的条数及显色深浅程度，制作成标准比色卡(类似于pH标准比色 卡)，用于现场检测时的比对，从而半定量地判定待检测样品中免疫球蛋白G的浓度范围。 现场检测时，只要将牛初乳或者其制品稀释，然后取一定体积(此体积与标准比色卡制作 时使用的标准牛IgG抗体试样的体积一样)的待检测样品滴加至样品吸收垫上，反应2min 后，观察试纸条上检测线6的显色情况，与标准比色卡进行比对，即得牛初乳或者其制品中 免疫球蛋白G的半定量快速检测结果。本发明将多条检测线上的兔抗牛IgG包被量有一个递增梯度，这样能够扩大牛初 乳或者其制品中免疫球蛋白G的检测量范围，同时控制检测线上的兔抗牛IgG包被量的递增梯度，能够实现不同精度的牛初乳或者其制品中免疫球蛋白G的检测量范围，简单快速 地实现现场操作测试牛初乳或者其制品中免疫球蛋白G的半定量快速检测。本发明建立了一种快速、简便的检测牛初乳及其产品中IgG含量的方法，该方法 灵敏性高、特异性强、操作简便，成本低廉，具有广阔的应用前景。使用本发明的半定量快速检测试纸条检测牛初乳及其制品中的IgG，灵敏度高，最 小检出量能达到10μ g/mL ；特异性强，与羊初乳及其制品中的IgG没有交叉反应；程序简 单，不需要特殊的仪器和技术技能；结果判定简单，肉眼就可观测结果；检测速度快，一个 样本的检测时间一般为15 20分钟。
图1是具体实施方式
一的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条 的结构示意图；图2是具体实施方式
六中硝酸纤维素膜4上检测线和质控线的位置关系简 图；图3是具体实施方式
九中硝酸纤维素膜4上检测线和质控线的位置关系简图；图4是具 体实施方式十三中硝酸纤维素膜4上检测线和质控线的位置关系简图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一结合图1说明本实施方式，本实施方式牛初乳及其制品中免疫 球蛋白G半定量快速检测试纸条，由聚氯乙烯材料(PVC)背衬1、样品吸收垫2、玻璃纤维3、 硝酸纤维素膜4和吸水垫5组成，在氯乙烯材料(PVC)背衬1上依次连续粘附有样品吸收 垫2、玻璃纤维3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，其中样品吸收垫2与玻璃纤维3邻接，玻璃纤 维3与硝酸纤维素膜4搭接，硝酸纤维素膜4和吸水垫5搭接；所述玻璃纤维3上包被有兔 抗牛IgG-胶体金标记物；所述硝酸纤维素膜4上包被有1 4条兔抗牛IgG构成的检测线 6和1条豚鼠抗兔IgG构成的质控线7 ；其中每条检测线的兔抗牛IgG的包被量沿远离玻璃 纤维的方向上依次增加。本实施方式中氯乙烯材料背衬1、样品吸收垫2、玻璃纤维3、硝酸纤维素膜4和吸 水垫5均购自美国Millipoer公司。使用的兔抗牛IgG和豚鼠抗兔IgG为市售产品、定制 或者自行制备均可。本实施方式中在氯乙烯材料(PVC)背衬1上粘附样品吸收垫2、玻璃纤维3、硝酸 纤维素膜4和吸水垫5时，沿氯乙烯材料(PVC)背衬1的长度方向进行。本实施方式牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条，在使用时， 对待测样品进行处理后将之滴入样品吸收垫2上即可，样品吸收垫2上可制作出加样孔。本实施方式的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条用标准牛 IgG进行标定。本实施方式中将一定体积的不同浓度的标准牛IgG抗体试样滴加试纸条的 样品吸收垫2上，反应2min后，观察试纸条上检测线6的显色的条数及显色深浅程度，制作 成标准比色卡(类似于PH标准比色卡)，用于现场检测时的比对，从而判定待检测样品中 免疫球蛋白G的浓度。现场检测时，只要将牛初乳或者其制品稀释后，取一定体积(此体积 与标准比色卡制作时用的标准牛IgG抗体试样的体积一样)的待检测样品滴加至样品吸收垫2上，反应2min后，观察试纸条上检测线6的显色情况，与标准比色卡进行比对，即得牛 初乳或者其制品中免疫球蛋白G的半定量快速检测试。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是所述硝酸纤维素膜上包 被有2 4条兔抗牛IgG构成的检测线6，相邻两条检测线6间的距离为2 4mm。其它参 数与具体实施方式
一相同。本实施方式将多条检测线上的兔抗牛IgG包被量有一个递增梯度，这样能够扩大 牛初乳或者其制品中免疫球蛋白G的检测量范围，同时控制检测线上的兔抗牛IgG包被量 的递增梯度，能够实现不同精度的牛初乳或者其制品中免疫球蛋白G的检测量范围，简单 快速地实现现场操作测试牛初乳或者其制品中免疫球蛋白G的半定量快速检测。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是硝酸纤维素膜4上包被 有1 4条兔抗牛IgG构成的检测线6，其兔抗牛IgG包被量为0. 075 μ g 1 μ g。其它参 数与具体实施方式
一相同。本实施方式中检测线6的兔抗牛IgG的包被量依据检测需要的灵敏度和准确度设 计。当检测线6的条数大于1条时，沿同一方向上的检测线的兔抗牛IgG的包被量梯度变 化。每条检测线6宽度为1mm。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一或三不同的是所述硝酸纤维素膜 4上包被有1条兔抗牛IgG构成的检测线6，其兔抗牛IgG的包被量为0. 075 μ g。其它参数 与具体实施方式
一或三相同。本实施方式的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条只有一条 检测线时，可用于检测牛初乳及其制品中免疫球蛋白G的含量是否达标(达标值依据实际 情况确定)，若检测线和质控线显色则达标，检测线不显色、质控线显色，不达标。本实施方式的半定量快速检测试纸条对牛初乳及其制品中免疫球蛋白G的最低 检出浓度达IOy g/mL，其中牛初乳及其制品的样品液体积控制为150μ L。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一或三不同的是所述硝酸纤维素膜 4上包被有1条兔抗牛IgG构成的检测线6，其兔抗牛IgG的包被量为1 μ g。其它参数与具 体实施方式一或三相同。本实施方式的半定量快速检测试纸条对牛初乳及其制品中免疫球蛋白G的检出 浓度为lOOOug/ml以上，其中牛初乳及其制品的样品液体积控制为150yL。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一、二或三不同的是所述硝酸纤维 素膜4上包被有2条兔抗牛IgG构成的检测线6，检测线6-2的包被量比检测线6-1的包被 量多0. 075 μ g 0. 4 μ g。其它参数与具体实施方式
一、二或三相同。本实施方式的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条的硝酸纤 维素膜4上检测线和质控线的位置关系简图如图2所示，图2中检测线一 6-1和检测线二 6-2分别是2条检测线6。本实施方式中2条检测线6的包被量均在0. 075μ g 1 μ g范围之内。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一、二或三不同的是所述硝酸纤维 素膜4上包被有2条兔抗牛IgG构成的检测线6，检测线二 6-2的包被量比检测线一 6-1的 包被量多0. Iyg 0.3 μ g。其它参数与具体实施方式
一、二或三相同。本实施方式中2条检测线6的包被量均在0. 075 μ g 1 μ g范围之内。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一、二或三不同的是所述硝酸纤维 素膜4上包被有2条兔抗牛IgG构成的检测线6，检测线二 6-2的包被量比检测线一 6-1的 包被量多0.2yg。其它参数与具体实施方式
一、二或三相同。本实施方式中2条检测线6的包被量均在0. 075μ g 1 μ g范围之内。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一、二或三不同的是所述硝酸纤维 素膜4上包被有3条兔抗牛IgG构成的检测线6，检测线三6-3、检测线二 6-2和检测线一 6-1的包被量依次减少。其它参数与具体实施方式
一、二或三相同。本实施方式的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条的硝酸纤 维素膜4上检测线和质控线的位置关系简图如图3所示，图3中检测线一6-1、检测线二6-2 和检测线三6-3分别是3条检测线6。本实施方式中3条检测线6的包被量均在0. 075μ g 1 μ g范围之内。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一、二或三不同的是所述硝酸纤维 素膜4上包被有3条兔抗牛IgG构成的检测线6，检测线三6-3、检测线二 6-2和检测线一 6-1的包被量依次减少，检测线三6-3的包被量比检测线二 6-2的包被量多0. 075μ g 0. 45 μ g，检测线二 6-2的包被量比检测线一 6-1的包被量多0. 075 μ g 0. 45 μ g。其它参 数与具体实施方式
一、二或三相同。本实施方式中3条检测线6的包被量均在0. 075μ g 1 μ g范围之内。
具体实施方式
十一本实施方式与具体实施方式
一、二或三不同的是所述硝酸纤 维素膜4上包被有3条兔抗牛IgG构成的检测线6，检测线三6-3、检测线二 6-2和检测线 一 6-1的包被量依次减少，检测线三6-3的包被量比检测线二 6-2的包被量多0. 2 μ g 0. 45 μ g，检测线二 6-2的包被量比检测线一 6-1的包被量多0. 075yg 0. 15 μ g。其它参 数与具体实施方式
一、二或三相同。本实施方式中3条检测线6的包被量均在0. 075 μ g 1 μ g范围之内。
具体实施方式
十二 本实施方式与具体实施方式
一、二或三不同的是所述硝酸纤 维素膜4上包被有3条兔抗牛IgG构成的检测线6，检测线三6-3、检测线二 6-2和检测线
一6-1的包被量依次减少，检测线三6-3的包被量比检测线二 6-2的包被量多0. 3 μ g，检测 线二 6-2的包被量比检测线一 6-1的包被量多0. 1 μ g。其它参数与具体实施方式
一、二或 三相同。本实施方式中3条检测线6的包被量均在0. 075 μ g 1 μ g范围之内。
具体实施方式
十三本实施方式与具体实施方式
一、二或三不同的是所述硝酸纤 维素膜4上包被有4条兔抗牛IgG构成的检测线6，检测线四6-4、检测线三6-3、检测线
二6-2和检测线一 6-1的包被量依次减少，检测线四6-4的包被量比检测线三6-3的包被 量多0. 075 μ g 0. 3 μ g，检测线三6-3的包被量比检测线二 6-2的包被量多0. 075 μ g 0. 3 μ g，检测线二 6-2的包被量比检测线一 6-1的包被量多0. 075 μ g 0. 3 μ g。其它参数 与具体实施方式
一、二或三相同。本实施方式中4条检测线6的包被量均在0. 075μ g 1 μ g范围之内。本实施方式的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条的硝酸纤 维素膜4上检测线和质控线的位置关系简图如图4所示，图4中检测线一 6-1、检测线二 6-2、检测线三6-3和检测线6-4分别是4条检测线6。
本实施方式十四本实施方式与具体实施方式
一、二或三不同的是所述硝酸纤维 素膜4上包被有4条兔抗牛IgG构成的检测线6，检测线四6-4、检测线三6-3、检测线二 6-2和检测线一 6-1的包被量依次减少，检测线四6-4的包被量比检测线三6-3的包被量多 0. 2 μ g 0. 3 μ g，检测线三6-3的包被量比检测线二 6-2的包被量多0. 1 μ g 0. 2 μ g，检 测线二 6-2的包被量比检测线一 6-1的包被量多0. 075 μ g 0. 1 μ g。其它参数与具体实 施方式一、二或三相同。本实施方式中3条检测线6的包被量均在0. 075 μ g 1 μ g范围之内。本实施方式十五本实施方式与具体实施方式
一、二或三不同的是所述硝酸纤维 素膜4上包被有4条兔抗牛IgG构成的检测线6，检测线四6-4、检测线三6-3、检测线二 6-2和检测线一 6-1的包被量依次减少，检测线四6-4的包被量比检测线三6-3的包被量多 0. 3 μ g，检测线三6-3的包被量比检测线二 6-2的包被量多0. 15 μ g，检测线二 6_2的包被 量比检测线一 6-1的包被量多0.075 μ g。其它参数与具体实施方式
一、二或三相同。本实施方式中3条检测线6的包被量均在0. 075μ g 1 μ g范围之内。
具体实施方式
十六本实施方式与具体实施方式
一至十五之一不同的是所述硝酸 纤维素膜4上包被1条豚鼠抗兔IgG构成的质控线7，豚鼠抗兔IgG的包被量为2 4 μ g。 其它参数与具体实施方式
一至十五之一相同。
具体实施方式
十七本实施方式是具体实施方式
一所述的牛初乳及其制品中免疫 球蛋白G半定量快速检测试纸条的制备方法，本实施方式通过以下步骤实现的一、采用柠 檬酸三钠还原法制备得20nm胶体金，然后向20nm胶体金中加入兔抗牛IgG抗体制备得兔 抗牛IgG-胶体金标记物，然后将兔抗牛IgG-胶体金标记物包被在玻璃纤维3上；二、将兔 抗牛IgG抗体包被在硝酸纤维素膜4上构成检测线6，再将豚鼠抗兔IgG抗体包被在硝酸 纤维素膜4上构成质控线7，其中检测线6的条数为1 4，在同一方向上检测线的兔抗牛 IgG抗体的包被量依次增加或者减少；三、在氯乙烯材料背衬1上依次连续粘附上样品吸收 垫2、步骤一得到的玻璃纤维3、步骤二得到的硝酸纤维素膜4和吸水垫5，其中玻璃纤维3 与硝酸纤维素膜4有搭接，硝酸纤维素膜4和吸水垫5有搭接；其中控制检测线6的兔抗牛 IgG抗体的包被量沿远离玻璃纤维的方向上依次增加，得到牛初乳及其制品中免疫球蛋白 G半定量快速检测试纸条。本实施方式中氯乙烯材料背衬1、样品吸收垫2、玻璃纤维3、步骤二得到的硝酸纤 维素膜4和吸水垫5均购自美国Millipoer公司。使用的兔抗牛IgG和豚鼠抗兔IgG为市 售产品、定制或者自行制备均可。本实施方式中在氯乙烯材料(PVC)背衬1上粘附样品吸收垫2、玻璃纤维3、硝酸 纤维素膜4和吸水垫5时，沿氯乙烯材料(PVC)背衬1的长边方向进行。粘附成型后，沿氯 乙烯材料(PVC)背衬1的长边方向切割成合适宽度的试纸条即可，即保证切割得到的试纸 条上同时有样品吸收垫2、玻璃纤维3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5。本实施方式中将一定体积的不同浓度的标准牛IgG抗体试样滴加试纸条的样品 吸收垫2上，反应2min后，观察试纸条上检测线6的显色的条数及显色深浅程度，制作成标 准比色卡(类似于PH标准比色卡)，用于现场检测时的比对，从而判定待检测样品中免疫 球蛋白G的浓度。现场检测时，只要将牛初乳或者其制品稀释后，取一定体积(此体积与标 准比色卡制作时用的标准牛IgG抗体试样的体积一样)的待检测样品滴加至样品吸收垫2上，反应2min后，观察试纸条上检测线6的显色情况，与标准比色卡进行比对，即得牛初乳 或者其制品中免疫球蛋白G的半定量快速检测试。检测速度快，一个牛初乳或者其制品样 本的检测时间一般为15 20分钟。本实施方式步骤三中在PVC背衬1上依次连续粘附样品吸收垫2、步骤一得到的玻 璃纤维3、步骤二所得硝酸纤维素膜4和吸水垫5的具体过程是将玻璃纤维3连接在靠近 硝酸纤维素膜4检测线的一端，边缘与硝酸纤维素膜4搭接上，样品吸收垫附着在玻璃纤维 3的另一端上；吸水垫5连接在硝酸纤维素膜4的另一端，与硝酸纤维素膜4的质控线相搭 接。
具体实施方式
十八本实施方式与具体实施方式
十七不同的是步骤一中采用柠 檬酸三钠还原法制备得20nm胶体金的具体步骤为a、向锥形瓶中加入IOOmL质量浓度 为0. 01 %的氯金酸溶液，加热至沸腾；b、向沸腾的氯金酸溶液中加入2. 25mL质量浓度为 1 %柠檬酸三钠水溶液，摇勻后继续加热沸腾，氯金酸溶液由蓝色变成红色后，再保持沸腾 4min ；c、关掉热源，冷却后用新制三蒸馏水恢复至原体积，即完成20nm胶体金的柠檬酸三 钠还原法制备。其它步骤及参数与具体实施方式
十七相同。本实施方式中的氯金酸溶液和柠檬酸三钠水溶液均用新制三蒸馏水配制。
具体实施方式
十九本实施方式与具体实施方式
十七或十八不同的是步骤一中兔 抗牛IgG-胶体金标记物的具体制备步骤为a、用0. lmol/L的碳酸钾将20nm胶体金溶液 的PH调节至9. 1 ；b、在电磁搅拌条件下，将质量浓度为lmg/mL的兔抗牛IgG溶液逐滴加 入步骤a的20nm胶体金溶液中，然后再加入质量浓度为10%的牛血清白蛋白(BSA)，继续 电磁搅拌5 lOmin，得粗兔抗牛IgG-胶体金标记物，其中控制20nm胶体金溶液与兔抗 牛IgG溶液的体积比为ImL 25 μ L，控制20nm胶体金溶液与牛血清白蛋白的体积比为 ImL IlOyL ；C、在4°C条件下，将步骤b的粗兔抗牛IgG-胶体金标记物在3000r/min的速 率下离心40min，然后吸取上清液A，弃去沉淀物A，再将上清液A在4°C、10020g的条件下离 心40min，弃去上清液B，保留沉淀物B ;d、用0. 01mol/L的pH为7. 4的PBS溶解步骤c的沉 淀物B至原体积，静置12 24h后，再在4°C、10020g的条件下离心40min，弃上清液，保留 沉淀物，然后用0. 01mol/L的pH7. 4PBS溶解沉淀物至原体积的1/10，即完成兔抗牛IgG-胶 体金标记物的制备；步骤d中PBS由质量浓度为的牛血清白蛋白(BSA)和质量浓度为 0. 02%叠氮钠构成。其它步骤及参数与具体实施方式
十七或十八相同。本实施方式的兔抗牛IgG-胶体金标记物在4°C条件下贮存备用。本实施方式步骤c中10020g中的g代表离心力。步骤c中采用低温超速离心法 纯化金标抗体，以除去溶液中未被标记的蛋白和未充分标记的胶体金以及在标记过程中可 能形成的各种聚合物。
具体实施方式
二十本实施方式与具体实施方式
十七、十八或十九之一不同的是 步骤一和步骤二中所述的兔抗牛IgG是通过以下步骤制备得到a、用弗氏完全佐剂抗原在 兔背部皮下注射6 8点，每点注射0. 1 0. 2mL，其中兔为标准牛IgG免疫家兔；b、21天 后，再用弗氏不完全佐剂抗原在兔背部皮下注射6 8点进行第2次注射，每点注射0. 1 0. 2mL ；c、26天后，以步骤b同样的方法进行第3次注射；d、7天后，在兔的耳静脉采血检测 血清效价，若血清效价达1 16以上，即可心脏采血；e、将心脏血样置37°C的温箱中凝固 Ih,然后置于4°C条件下静置12 24h，使血块收缩，吸出全部血清，然后采用离子交换层析法纯化抗体，即得到兔抗牛IgG。其它步骤及参数与具体实施方式
十七、十八或十九之一相 同。本实施方式中兔为标准牛IgG免疫家兔，其中标准牛IgG购自美国sigma公司；得 到的兔抗牛IgG于_20°C的条件下冻存备用。本实施方式用琼脂免疫双向扩散测定提纯抗体的活性，活性可达到1 64以上； 用聚丙稀酰胺电泳法测定纯化抗体的纯度，从电泳结果可以看出只有一条蛋白质条带，没 有杂带。
具体实施方式
二十一本实施方式与具体实施方式
十七至二十之一不同的是步骤 二中所述的豚鼠抗兔IgG是通过以下步骤制备得到a、用弗氏完全佐剂抗原在豚鼠背部皮 下注射6 8点，每点注射0. 1 0. 2mL，其中豚鼠为兔抗牛IgG免疫豚鼠；b、21天后，再用 弗氏不完全佐剂抗原在豚鼠背部皮下注射6 8点进行第2次注射，每点注射0. 1 0. 2mL ； c、26天后，以步骤b同样的方法进行第3次注射；d、7天后，对豚鼠进行采血检测血清效价， 若血清效价达1 16以上，即可心脏采血；e、将心脏血样置37°C的温箱中凝固lh，然后置 于4°C条件下静置12 24h，使血块收缩，吸出全部血清，然后采用离子交换层析法纯化抗 体，即得到豚鼠抗兔IgG。其它步骤及参数与具体实施方式
十七至二十之一相同。本实施方式中豚鼠为兔抗牛IgG免疫豚鼠，兔抗牛IgG为采用现有公开技术自行 制备，如具体实施方式
九中记载的制备方法。得到的豚鼠抗兔IgG于_20°C的条件下冻存备 用。本实施方式用琼脂免疫双向扩散测定提纯抗体的活性，活性可达到1 64以上； 用聚丙稀酰胺电泳法测定纯化抗体的纯度，从电泳结果可以看出只有一条蛋白质条带，没 有杂带。
具体实施方式
二十二 本实施方式与具体实施方式
十七至二十一之一不同的是步 骤一中将兔抗牛IgG-胶体金标记物包被在玻璃纤维上的具体操作步骤为a、将玻璃纤维2 置于0. 01mol/L pH为7. 4的PBS中浸泡Ih后，在37°C条件下烘干；b、采用Biodot点膜仪 将兔抗牛IgG-胶体金标记物均勻包被在经步骤a处理的玻璃纤维2上，然后真空干燥，即 完成兔抗牛IgG-胶体金标记物包被在玻璃纤维上。其它步骤及参数与具体实施方式
十七 至二十一之一相同。本实施方式中PBS由质量浓度为的牛血清白蛋白(BSA)和质量浓度为0.02% 叠氮钠构成。本实施得到的兔抗牛IgG-胶体金标记物真空封装后，置4°C条件下备用。本实施方式中步骤b中Biodot点膜仪为市售仪器，由BIODOT公司提供。
具体实施方式
二十三本实施方式与具体实施方式
十七至二十二之一不同的是步 骤一中将兔抗牛IgG-胶体金标记物包被在玻璃纤维3上的包被量为每平方厘米玻璃纤维 包被6 μ g兔抗牛IgG-胶体金标记物。其它步骤及参数与具体实施方式
十七至二十二之一 相同。
具体实施方式
二十四本实施方式方式与具体实施方式
十七至二十三之一不同的 是步骤二的具体步骤是a、将硝酸纤维素膜4在三蒸去离子水中浸泡2h后取出，室温阴干； b、用Biodot点膜仪将用包被缓冲液稀释的兔抗牛IgG包被于硝酸纤维素膜4上构成检测 线6，其中检测线6的条数为1 4，在同一方向上检测线的兔抗牛IgG抗体的包被量依次 增加或者减少；c、用Biodot点膜仪将用包被缓冲液稀释的豚鼠抗兔IgG包被于硝酸纤维素膜4上作为质控线7，包被量为2 μ g，室温阴干，其中质控线7位于包被量最大的检测线6的 一端；d、将步骤c处理后的硝酸纤维素膜4置于0. 01mol/L的pH为7. 4的PBS中封闭静置 2h,然后用PBS洗涤2次，室温阴干，即可。其它步骤及参数与具体实施方式
十七至二十三 之一相同。本实施方式得到的硝酸纤维素膜3在4°C条件下保存备用。本实施方式中步骤b中Biodot点膜仪为市售仪器，由BIODOT公司提供。步骤b 和步骤c中的包被缓冲液为pH为9. O的K2CO3溶液；步骤d中PBS由质量浓度为1 %的BSA 和质量浓度为0. 02%叠氮钠构成。
具体实施方式
二十五本实施方式与具体实施方式
十七至二十四之一不同的是步 骤二中检测线6的条数为2 4。其它步骤及参数与具体实施方式
十七至二十四之一相同。本实施方式中相邻两条检测线6间的距离为2 4mm。
具体实施方式
二十六本实施方式与具体实施方式
十七至二十五之一不同的是步 骤二中将兔抗牛IgG抗体包被在硝酸纤维素膜4上构成检测线6，兔抗牛IgG抗体的包被量 为0. 075 μ g 1 μ g。其它步骤及参数与具体实施方式
十七至二十五之一相同。本实施方式中检测线6的兔抗牛IgG的包被量依据检测需要的灵敏度和准确度设 计。当检测线6的条数大于1条时，沿同一方向上的检测线的兔抗牛IgG的包被量梯度变 化。每条检测线6宽度为1mm。
具体实施方式
二十七本实施方式牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检 测试纸条的制备方法，是通过以下步骤实现的一、采用柠檬酸三钠还原法制备得20nm胶 体金，然后向20nm胶体金中加入兔抗牛IgG抗体制备得兔抗牛IgG-胶体金标记物，然后将 兔抗牛IgG-胶体金标记物包被在玻璃纤维3上，其中兔抗牛IgG-胶体金标记物的包被量 为每平方厘米玻璃纤维包被6 μ g ；二、将兔抗牛IgG抗体包被在硝酸纤维素膜4上构成检 测线6，再将豚鼠抗兔IgG抗体包被在硝酸纤维素膜4上构成质控线7，其中检测线6的条数 为4，检测线一 6-1的兔抗牛IgG的包被量为0. 075 μ g，检测线二 6_2的兔抗牛IgG的包被 量为0. 15 μ g，检测线三6-3的兔抗牛IgG的包被量为0. 3 μ g，检测线四6_4的兔抗牛IgG 的包被量为0. 6 μ g，质控线7的豚鼠抗兔IgG的包被量为2 μ g，质控线7在检测线6-4端； 三、在氯乙烯材料背衬1上依次连续粘附上样品吸收垫2、玻璃纤维3、硝酸纤维素膜4和吸 水垫5，其中玻璃纤维3与硝酸纤维素膜4有搭接，硝酸纤维素膜4和吸水垫5有搭接；其 中控制检测线一 6-1靠近玻璃纤维，质控线7靠近吸水垫5，得到牛初乳及其制品中免疫球 蛋白G半定量快速检测试纸条。本实施方式步骤一中柠檬酸三钠还原法制备20nm胶体金的制备方法采用具体实 施方式十八所述的步骤进行。步骤一中兔抗牛IgG-胶体金标记物的制备采用具体实施方 式十九所述的步骤进行。步骤一中使用的兔抗牛IgG采用具体实施方式
二十记载的制备方 法制备得到。本实施方式步骤二的具体步骤是a、将硝酸纤维素膜4在三蒸去离子水中浸泡2h 后取出，室温阴干；b、用pH为9. 0的K2CO3溶液(包被缓冲液)将兔抗牛IgG分别稀释成 15 μ g/mL、30 μ g/mL、60 μ g/mL、120 μ g/mL的兔抗牛IgG点样溶液，然后用Biodot点膜仪 将兔抗牛IgG点样溶液依次包被于硝酸纤维素膜4上构成检测线一 6-1、检测线二 6-2、检 测线三6-3和检测线四6-4，包被体积为5μ L ；c、用Biodot点膜仪将包被缓冲液(K2CO3,
12PH9. 0)稀释的豚鼠抗兔抗体(浓度为2mg/mL)包被于硝酸纤维素膜作为质控线，包被体积 为2 μ L ；室温阴干，其中质控线7位于包被量最大的检测线四6-4的一端；d、将步骤C处理 后的硝酸纤维素膜3置于0. 01mol/L的pH为7. 4的PBS中封闭静置2h，然后用PBS洗涤2 次，室温阴干，即可。步骤二制备得到的硝酸纤维素膜4的结构简图如图4所示。本实施方式步骤三中还可以在样品吸收垫2上制作出加样孔。本实施方式制备得到的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条 采用标准牛IgG进行标定，具体操作如下将标准牛IgG用缓冲液(K2CO3, pH9. 0)稀释成 浓度分另U 为 5 μ g/mLUO μ g/mL、50 μ g/mLUOO μ g/mL、200 μ g/mL、350 μ g/mL、500 μ g/mL、 800 μ g/mL、1000 μ g/mL，将上述不同浓度的标准牛IgG缓冲溶液滴加至试纸条的样品吸收 垫2(或者加样孔)上，滴加量为150 μ L，反应2min，观察试纸条上检测线的显色条数及显 色轻重，制作出比色卡，进行牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测。其中，5 μ g/ mL标准牛IgG缓冲溶液时，试纸条上只有质控线显色，检测线没有显色；10 μ g/mL标准牛 IgG缓冲溶液时，试纸条上质控线显色，检测线一 6-1显淡粉色；50 μ g/mL标准牛IgG缓冲 溶液时，试纸条上质控线显色，检测线一 6-1显红色；100 μ g/mL标准牛IgG缓冲溶液时，试 纸条上质控线显色，检测线二 6-2显淡粉色；200 μ g/mL标准牛IgG缓冲溶液时，试纸条上 质控线显色，检测线二 6-2显红色；350 μ g/mL标准牛IgG缓冲溶液时，试纸条上质控线显 色，检测线三6-3显淡粉色；500 μ g/mL标准牛IgG缓冲溶液时，试纸条上质控线显色，检测 线三6-3显红色；800 μ g/mL标准牛IgG缓冲溶液时，试纸条上质控线显色，检测线四6_3显 淡粉色；1000 μ g/mL标准牛IgG缓冲溶液时，试纸条上质控线显色，检测线四6_4显红色。 通过上述显色情况作出标准比色卡(类似PH试纸条的比色卡)，以用于实际检测中的比对， 对牛初乳及其制品中免疫球蛋白G进行半定量快速检测。在实际现场对牛初乳及其制品中免疫球蛋白G(IgG)的测量中，将牛初乳或其制 品稀释制备得检测样品液，取150 μ L定量的检测样品液滴加至样品吸收垫2 (或者加样孔) 上，反应2 5min后显色，然后与标准比色卡进行比，从而半定量地得到牛初乳或其制品 中免疫球蛋白G的含量。当仅质控线7显色时，说明检测样品液中IgG的含量低于10 μ g/ mL ；当检测线一 6-1的显色比标准比色卡上的淡粉色还浅时，说明检测样品液中IgG的含 量为5 10 μ g/mL;当检测线一 6-1的显色比标准比色卡上的淡粉色深，红色浅时，说明检 测样品液中IgG的含量为10 50 μ g/mL ；当检测线一 6_1的显色比标准比色卡上的红色 深，检测线二 6-2不显色或者显色比标准比色卡上检测线二 6-2的淡粉色浅，则说明检测样 品液中IgG的含量为50 100 μ g/mL ；当检测线二 6_2显色比标准比色卡上的淡粉色深， 红色浅时，则说明检测样品液中IgG的含量为100 200 μ g/mL;当检测线二 6-2显色比标 准比色卡上的红色深，检测线三6-3不显色或者显色比标准比色卡上检测线三6-3的淡粉 色浅，则说明检测样品液中IgG的含量为200 350 μ g/mL ；当检测线三6_3显色比标准比 色卡上的淡粉色深，红色浅，则说明检测样品液中IgG的含量为350 500 μ g/mL ；当检测 线三6-3显色比标准比色卡上的红色深，检测线四6-4不显色或者显色比标准比色卡上检 测线四6-4的淡粉色浅，则说明检测样品液中IgG的含量为500 800μ g/mL ；当检测线 四6-4显色比标准比色卡上的淡粉色深，红色浅，则说明检测样品液中IgG的含量为800 1000 μ g/mL ；当检测线四6-4显色比标准比色卡上的红色深，则说明检测样品液中IgG的含 量大于 1000 μ g/mL。
13
本实施方式中标准牛IgG缓冲溶液的浓度可以设置的梯度更小或者更大，得到不 同的检测线显色条数及相应显色检测线的不同显色程度，从而得到或者比较精密，或者比 较粗略的标准比色卡，进而使半定量检测结果更精密或者更粗略。本领域技术人员可以根 据具体实地检测的需要，制备得到符合要求的半定量快速检测试纸条及相应的标准比色 卡。本实施方式的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条的最低检 出限为10 μ g/mL(其中牛初乳及其制品的样品液体积控制为150 μ L)，满足半定量快速检 测牛初乳及其制品中免疫球蛋白G的要求。
具体实施方式
二十八本实施方式与具体实施方式
二十七不同的是步骤二中检测 线6的条数为2，检测线一 6-1的兔抗牛IgG的包被量为0. 075 μ g，检测线二 6_2的兔抗牛 IgG的包被量为0. 3 μ g，质控线7的豚鼠抗兔IgG的包被量为2 μ g，质控线7在检测线6_2 端。其他步骤及参数与具体实施方式
二十七相同。本实施方式步骤一中柠檬酸三钠还原法制备20nm胶体金的制备方法采用具体实 施方式十八所述的步骤进行。步骤一中兔抗牛IgG-胶体金标记物的制备采用具体实施方 式十九所述的步骤进行。步骤一中使用的兔抗牛IgG采用具体实施方式
二十记载的制备方 法制备得到。本实施方式步骤二的具体步骤如具体实施方式
二十七中所述。本实施方式步骤三中还可以在样品吸收垫2上制作出加样孔。本实施方式制备得到的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条 采用标准牛IgG进行标定，具体操作如下将标准牛IgG用缓冲液(K2CO3, pH9. 0)稀释成浓 度分别为5 μ g/mLUO μ g/mL、50 μ g/mL、350 μ g/mL、500 μ g/mL,将上述不同浓度的标准牛 IgG缓冲溶液滴加至试纸条的样品吸收垫2 (或者加样孔)上，滴加量为150 μ L，反应2min， 观察试纸条上检测线的显色条数及显色轻重，制作出标准比色卡，进行牛初乳及其制品中 免疫球蛋白G半定量快速检测。其中，5 μ g/mL标准牛IgG缓冲溶液时，试纸条上只有质控 线显色，检测线没有显色；10 μ g/mL标准牛IgG缓冲溶液时，试纸条上质控线显色，检测线 一 6-1显淡粉色；50 μ g/mL标准牛IgG缓冲溶液时，试纸条上质控线显色，检测线一 6-1显 红色；350 μ g/mL标准牛IgG缓冲溶液时，试纸条上质控线显色，检测线二 6_2显淡粉色； 500 μ g/mL标准牛IgG缓冲溶液时，试纸条上质控线显色，检测线二 6-2显红色。通过上述 显色情况作出标准比色卡(类似PH试纸条的比色卡)，以用于实际现场检测中的比对，对牛 初乳及其制品中免疫球蛋白G进行半定量快速检测。在实际现场对牛初乳及其制品中免疫球蛋白G(IgG)的测量中，将牛初乳或其制 品稀释制备得检测样品液，取150 μ L定量的检测样品液滴加至样品吸收垫2 (或者加样孔) 上，反应2 5min后显色，然后与标准比色卡进行比，从而半定量地得到牛初乳或其制品中 免疫球蛋白G的含量。判断牛初乳或其制品中免疫球蛋白G的含量与具体实施方式
二十七 中所述的判定原则一致。本实施方式中标准牛IgG缓冲溶液的浓度可以设置的梯度更小或者更大，得到不 同的检测线显色条数及相应显色检测线的不同显色程度，从而得到或者比较精密，或者比 较粗略的标准比色卡，进而使半定量检测结果更精密或者更粗略。本领域技术人员可以根 据具体实地检测的需要，制备得到符合要求的半定量快速检测试纸条及相应的标准比色 卡。
本实施方式的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条的最低检 出限为10 μ g/mL(其中牛初乳及其制品的样品液体积控制为150 μ L)，满足半定量快速检 测牛初乳及其制品中免疫球蛋白G的要求。
权利要求
牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条，其特征在于牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条由聚氯乙烯材料背衬(1)、样品吸收垫(2)、玻璃纤维(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)组成，在氯乙烯材料(PVC)背衬(1)上依次连续粘附有样品吸收垫(2)、玻璃纤维(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)，其中样品吸收垫(2)与玻璃纤维(3)邻接，玻璃纤维(3)与硝酸纤维素膜(4)搭接，硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)搭接；所述玻璃纤维(3)上包被有兔抗牛IgG 胶体金标记物；所述硝酸纤维素膜(4)上包被有1～4条兔抗牛IgG构成的检测线(6)和1条豚鼠抗兔IgG构成的质控线(7)；其中每条检测线的兔抗牛IgG的包被量沿远离玻璃纤维的方向上依次增加。
2.根据权利要求1所述的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条，其 特征在于硝酸纤维素膜(4)上包被有1 4条兔抗牛IgG构成的检测线(6)，其兔抗牛IgG 包被量为0. 075yg lyg。
3.根据权利要求1或2所述的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸 条，其特征在于所述硝酸纤维素膜4上包被有2条兔抗牛IgG构成的检测线6，检测线6-2 的包被量比检测线6-1的包被量多0. 075 μ g 0. 4 μ g。
4.根据权利要求1或2所述的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸 条，其特征在于所述硝酸纤维素膜4上包被有3条兔抗牛IgG构成的检测线6，检测线三 6-3、检测线二 6-2和检测线一 6-1的包被量依次减少，检测线三6-3的包被量比检测线二 6-2的包被量多0. 075 μ g 0. 45 μ g，检测线二 6_2的包被量比检测线一 6_1的包被量多 0. 075μ g ~ 0. 45 μ g。
5.根据权利要求1或2所述的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸 条，其特征在于所述硝酸纤维素膜4上包被有4条兔抗牛IgG构成的检测线6，检测线四 6-4、检测线三6-3、检测线二 6-2和检测线一 6-1的包被量依次增加，检测线四6_4的包 被量比检测线三6-3的包被量多0. 075μ g 0. 3 μ g，检测线三6-3的包被量比检测线二 6-2的包被量多0. 075μ g 0. 3 μ g，检测线二 6-2的包被量比检测线一 6_1的包被量多 0. 075μ g 0. 3μ g。
6.如权利要求1所述的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条的制备 方法，其特征在于牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条的制备方法是通 过以下步骤实现的一、采用柠檬酸三钠还原法制备得20nm胶体金，然后向20nm胶体金中 加入兔抗牛IgG抗体制备得兔抗牛IgG-胶体金标记物，然后将兔抗牛IgG-胶体金标记物 包被在玻璃纤维(3)上；二、将兔抗牛IgG抗体包被在硝酸纤维素膜(4)上构成检测线(6)， 再将豚鼠抗兔IgG抗体包被在硝酸纤维素膜(4)上构成质控线(7)，其中检测线(6)的条数 为1 4，在同一方向上检测线的兔抗牛IgG抗体的包被量依次增加或者减少；三、在氯乙 烯材料背衬(1)上依次连续粘附上样品吸收垫(2)、步骤一得到的玻璃纤维(3)、步骤二得 到的硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)，其中样品吸收垫(2)与玻璃纤维(3)邻接，玻璃纤维 ⑶与硝酸纤维素膜⑷搭接，硝酸纤维素膜⑷和吸水垫(5)搭接；其中控制检测线(6) 的兔抗牛IgG抗体的包被量沿远离玻璃纤维的方向上依次增加，得到牛初乳及其制品中免 疫球蛋白G半定量快速检测试纸条。
7.根据权利要求6所述的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条的制 备方法，其特征在于步骤一中兔抗牛IgG-胶体金标记物的具体制备步骤为a、用0. Imol/L的碳酸钾将20nm胶体金溶液的pH调节至9. 1 ；b、在电磁搅拌条件下，将质量浓度为Img/ mL的兔抗牛IgG溶液逐滴加入步骤a的20nm胶体金溶液中，然后再加入质量浓度为10% 的牛血清白蛋白，继续电磁搅拌5 lOmin，得粗兔抗牛IgG-胶体金标记物，其中控制20nm 胶体金溶液与兔抗牛IgG溶液的体积比为ImL 25 μ L，控制20nm胶体金溶液与牛血清白 蛋白的体积比为ImL 110 μ L ；c、在4°C条件下，将步骤b的粗兔抗牛IgG-胶体金标记物 在3000r/min的速率下离心40min，然后吸取上清液A，弃去沉淀物A，再将上清液A在4°C、 10020g的条件下离心40min，弃去上清液B，保留沉淀物B ;d、用0. Olmol/L的pH为7. 4的 PBS溶解步骤c的沉淀物B至原体积，静置12 24h后，再在4°C、10020g的条件下离心 40min，弃上清液，保留沉淀物，然后用0. Olmol/L的pH7. 4PBS溶解沉淀物至原体积的1/10， 即完成兔抗牛IgG-胶体金标记物的制备；步骤d中PBS由质量浓度为的牛血清白蛋白 和质量浓度为0. 02%叠氮钠构成。
8.根据权利要求6或7所述的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条 的制备方法，其特征在于步骤一中将兔抗牛IgG-胶体金标记物包被在玻璃纤维上的具体 操作步骤为a、将玻璃纤维(2)置于0. 01mol/L pH为7. 4的PBS中浸泡Ih后，在37°C条 件下烘干；b、采用Biodot点膜仪将兔抗牛IgG-胶体金标记物均勻包被在经步骤a处理的 玻璃纤维(2)上，然后真空干燥，即完成兔抗牛IgG-胶体金标记物包被在玻璃纤维上。
9.根据权利要求8所述的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条的制 备方法，其特征在于步骤一中将兔抗牛IgG-胶体金标记物包被在玻璃纤维(3)上的包被量 为每平方厘米玻璃纤维包被6 μ g兔抗牛IgG-胶体金标记物。
10.根据权利要求6、7或9所述的牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试 纸条的制备方法，其特征在于步骤二的具体步骤是a、将硝酸纤维素膜(4)在三蒸去离子 水中浸泡2h后取出，室温阴干；b、用Biodot点膜仪将用包被缓冲液稀释的兔抗牛IgG包被 于硝酸纤维素膜(4)上构成检测线(6)，其中检测线(6)的条数为1 4，在同一方向上检 测线的兔抗牛IgG抗体的包被量依次增加或者减少；C、用Biodot点膜仪将用包被缓冲液稀 释的豚鼠抗兔IgG包被于硝酸纤维素膜⑷上作为质控线(7)，包被量为2 μ g，室温阴干， 其中质控线(7)位于包被量最大的检测线(6)的一端；d、将步骤c处理后的硝酸纤维素膜 (4)置于0. Olmol/L的pH为7. 4的PBS中封闭静置2h，然后用PBS洗涤2次，室温阴干，即 可。
全文摘要
牛初乳及其制品中免疫球蛋白G半定量快速检测试纸条及其制备方法，涉及IgG半定量检测试纸条及其制备方法，解决了现有牛初乳及其制品中IgG的检测操作程序繁琐，检测所需时间长，不适合于现场操作的问题。试纸条由背衬、样品吸收垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水垫组成，硝酸纤维素膜上有1～4条检测线和1条质控线。方法一、制备兔抗牛IgG-胶体金标记物，包被在玻璃纤维上；二、在硝酸纤维素膜上包被得检测线和质控线；三、组装试纸条，即得。试纸条检测灵敏度高，最小检出量达到10μg/mL；特异性强，与羊初乳及其制品中的IgG没有交叉反应；程序简单，检测速度快，一个样本的检测时间一般为15～20分钟；适于现场检测。
文档编号G01N33/532GK101915833SQ201010278160
公开日2010年12月15日 申请日期2010年9月10日 优先权日2010年9月10日
发明者任延铭, 冯兴军, 刘春龙, 李忠秋 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所
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