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专利名称：嗜酸氧化亚铁硫杆菌快速检测试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及细菌检测的领域，具体说是涉及到一种嗜酸氧化亚铁硫杆菌快速检测试纸。
背景技术：
嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans, A. /)是一种化能自养、专性好氧、嗜酸革兰氏阴性菌，主要生长在PH 1.0-4.5的环境中，通过氧化Fe2 +和低价态硫来获得生长过程所需的能量。在各种输水、输油设备、冷却循环水管、采油井、暖气回水管和城市排水管线中均发现有A /存在，由于A /能将水中亚铁氧化成高铁氧化物沉积于菌体外鞘或周围粘液层中，在金属表面形成黄褐色的结瘤，结瘤内氧进入困难而导致氧浓差电池腐蚀，进而加速管道腐蚀。此外，A. /还能将水体中的元素硫和还原性硫化物氧化，最终产生硫酸，从而腐蚀金属、混凝土构件等。A /的腐蚀行为给工业设备以及民用设施都造成了不同程度损失，尤其在石油化工和动力设备方面的经济损失相当惨重。因此人们对其有效检测方法也越来越关注。目前，A/存在与否的检测方法主要有培养富集后检测亚铁离子的氧化性能法、多管发酵法、测试瓶法、基于分子生物学技术的检测16S rRNA基因和亚铁氧化酶基因法。这些方法都需要对样品中的A/进行富集培养，培养基的配置复杂、操作程序繁琐、检测时间长、对测试环境和操作人员的素质要求极高。近年来，不依赖于培养的分子生物学技术也开始应用与A/的检测，根据16S rRNA基因设计荧光探针，然后通过分子杂交来判断样品中A. f的含有情况。此外，根据铜蓝蛋白(Rusticyanin，Rus)编码基因rus建立的含有两对引物的PCR法也被应用于A/的检测。这两种方法虽然具有一定的灵敏性和特异性，但其试剂配制复杂、对仪器要求高、测试成本高、并且需要专门的技术人员来完成。
发明内容本实用新型的目的在于提供一种具有高特异性、高灵敏性、检测速度快、无需专业人员操作、费用低廉及便于携带等特点的嗜酸氧化亚铁硫杆菌快速检测试纸。本实用新型的嗜酸氧化亚铁硫杆菌快速检测试纸，是在塑料基板上依次包被了加样区、标定区、反应显色区、及吸水区，上述各区带边缘依次重叠搭接。作为本实用新型的进一步改进，所述的加样区由微孔滤膜构成。作为本实用新型的进一步改进，所述的标定区由玻璃纤维素膜构成，该膜上包被有胶体硒颗粒标记的A/多克隆抗体。作为本实用新型的进一步改进，所述的反应显色区由硝酸纤维膜构成，反应显色区上设有检测带和质控带。作为本实用新型的进一步改进，在检测带包埋有A/多克隆抗体、质控带结合有羊抗鼠IgG。作为本实用新型的进一步改进，所述的吸水区由滤纸构成。[0011]本实用新型的嗜酸氧化亚铁硫杆菌快速检测试纸，该试纸利用A/多克隆抗体检测待检样品中的A /，从而提高了检测的快速性、灵敏性。利用胶体纳米硒颗粒标记A /多克隆抗体，提高了检测结果的可视性，提高了检测结果的可视性，进一步提高了灵敏性，加之胶体纳米硒颗粒的制备要求较胶体纳米金的低，从而降低了制备该试纸条所需要求条件，拓宽了试纸条有效性检测所需条件范围，摆脱了特定仪器的束缚，降低了成本，使得该试纸条的使用对象更加准确、方便、便宜、大众化。

图1为嗜酸氧化亚铁硫杆菌快速检测试纸结构示意图；图2为图1的分解图；图3为该试纸条检测结果说明图。
具体实施方式
本实用新型的嗜酸氧化亚铁硫杆菌快速检测试纸，是在塑料基板1上依次包被了加样区2、标定区3、反应显色区4、及吸水区7，上述各区带边缘依次重叠搭接。所述的加样区2由微孔滤膜构成；标定区3由玻璃纤维素膜构成，该膜上包被有胶体硒颗粒标记的A /多克隆抗体；反应显色区4由硝酸纤维膜构成，反应显色区4上设有检测带5和质控带6，在检测带5包埋有A /多克隆抗体、质控带6结合有羊抗鼠IgG ；吸水区7由滤纸构成。通过检测带的显色情况，就可以便捷、快速、灵敏地检测出样品中有无A/存在。该种方法具有便捷化、灵敏化、特异化、适时化、快速化、大众化等特点，适合对样品进行快速检测。本实用新型的嗜酸氧化亚铁硫杆菌快速检测试纸的制备过程如下1、抗原的制备A/在9 K培养基(由溶液A和溶液B组成，溶液A包括3.0 g (NH4)2S04、0. 1g KC1、0.5 g K2HP04、0.5g MgSO4. 7Η20、0· 01 g Ca (NO3)2>700 mL 蒸馏水；溶液 B 为浓度为14. 78%的!^SO4溶液300 mL。使用时A液和B液混合并用稀H2SO4调pH至2. 0左右)中30°C培养，取对数期的培养液2000 rpm离心15 min去掉铁钒，上清8000 rpm离心20 min,沉淀用PH 2. 0的稀H2SO4洗涤至无铁钒，然后用0. 02 M pH 7. 4的PBS清洗菌体以除去菌体表面的酸液，取沉淀用0. 25 M NaCl洗涤两次，4 0C以12000 rpm离心20 min，最后将菌体悬浮于1 mL的NaCl溶液中，-20 0C保存备用。2、胶体纳米硒颗粒的制备(1)在洁净的烧杯中加入一定量(10 mL)的去离子水，并用磁力搅拌器中速持续搅拌；(2)加入一定浓度(5. 0%)的壳聚糖0. 2 mL以稳定其反应体系；(3)2 min后，依次加入0. 2 mL抗坏血酸和0. 1 mL亚硒酸；(4)待其反应5 min后，依次间隔1 min缓慢滴加1 mL亚硒酸和2 mL抗坏血酸。加完后，持续搅拌反应5 min，最终制成符合要求的胶体纳米硒颗粒。3、胶体硒标记A /多克隆抗体[0027]( 1)通过预实验确定胶体硒标记A f多克隆抗体的最佳pH值和浓度；(2)将制得的胶体硒溶液通过用0. 1 M碳酸钾调整至最佳pH值(pH 8. 2)；(3)将A /多克隆抗体经过进一步透析、过滤等处理，尽可能去除一些影响硒标过程的离子和粒子等杂质；(4)电磁搅拌条件下，将经过处理的A /多克隆抗体按照优化出的条件浓度逐滴加入到胶体硒溶液中；(5) 10 min后，加入10% BSA至其浓度为1%，以稳定其反应体系，继续搅拌均勻；(6) 10 min后，将制得的硒标A /多克隆抗体溶液经过梯度离心浓缩或者经过蔗糖透析浓缩，获得高浓度度的硒标A /多克隆抗体溶液，再将其经过凝胶层析柱纯化、TBS(1% BSA, 0. 05%叠氮钠)洗涤后即可。4、嗜酸氧化亚铁硫杆菌快速检测试纸的装配(1)将玻璃纤维经过含1% BSA和1%吐温-20的PBS (pH 7.4,0.01 M)活化处理后，浸在硒标A/多克隆抗体溶液中40 min,自然风干，即可将硒标A /多克隆抗体包被在玻璃纤维膜上；(2)在硝酸纤维素滤膜上间隔0. 4 cm依次喷涂上A /多克隆抗体溶液带作为检测带，羊抗鼠IgG为质控带。然后将硝酸纤维素膜用含W BSA的PBS (pH 7. 4,0. 01 M)封闭2 h，自然风干；(3)最后，塑料底板、将加样膜、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水纸按照说明书附图1、图2的顺序组装好，保持干燥备用。试纸条的使用(1)将待测样本滴入加样区，或将试纸条伸入样品中即可开始检测。5-10 min后即可观察结果。(2)结果判定(结合说明书附图3)如果检测带和质控带均显色，则说明样品呈阳性，样品中含有A /，如图3中1所示；如果检测带不显色，而质控带显色，则说明样品呈阴性，样品中无A /存在，如图3中2所示；如果检测带和检测带均不显色，则说明该试纸条已经失效，不能使用，须更换新的试纸条后重新检测，如图3中3所示。
权利要求1.嗜酸氧化亚铁硫杆菌快速检测试纸，其特征是在塑料基板(1)上依次包被了加样区(2)、标定区(3)、反应显色区(4)、及吸水区(7)，上述各区带边缘依次重叠搭接。
2.如权利要求1所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌快速检测试纸，其特征在于加样区(2)由微孔滤膜构成。
3.如权利要求1所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌快速检测试纸，其特征在于标定区(3)由玻璃纤维素膜构成，该膜上包被有胶体硒颗粒标记的A. /多克隆抗体。
4.如权利要求1所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌快速检测试纸，其特征在于反应显色区(4 )由硝酸纤维膜构成，反应显色区(4 )上设有检测带(5 )和质控带(6 )。
5.如权利要求4所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌快速检测试纸，其特征在于检测带(5)包埋有A /多克隆抗体、质控带(6)结合有羊抗鼠IgG。
6.如权利要求1所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌快速检测试纸，其特征在于吸水区(7)由滤纸构成。
专利摘要本实用新型的嗜酸氧化亚铁硫杆菌快速检测试纸涉及到细菌检测领域，它由塑料底板、加样区、标定区、显色区及吸水区组成。其中，加样区为一定孔径的微孔滤膜；标定区为结合有胶体硒纳米颗粒标记的A.f多克隆抗体的玻璃纤维素膜；反应区由硝酸纤维素膜构成，其上分别具有检测带(T带)和质控带(C带)，检测带包埋有A.f多克隆抗体，质控带结合有羊抗鼠IgG。本试纸条由具有操作简单、敏感特异、携带方便等特点可应用于各种循环冷却水、采油废水、管道水及自然水体中A.f的检测。
文档编号G01N33/569GK202330433SQ20112045077
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者张爽, 晏磊 申请人:黑龙江八一农垦大学