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专利名称：测定鲎试剂灵敏度的方法
技术领域：
本发明涉及细菌内毒素的检测，具体地说是测定鲎试剂灵敏度的方法。
背景技术：
细菌内毒素(Bacterial Endotoxin)是革兰氏阴性细菌所产生的具有各种生物活性的大分子物质，其主要化学成分为脂多糖(LPS)；内毒素是注射剂药品(原料等)中的主要污染物质。
细菌内毒素的检测方法有家兔试验法、鲎试验法。鲎试验法(LimulusAmebocyte Lysate，LAL，或Tachypleus Amebocyte Lysate，TAL)是利用鲎试剂与内毒素发生凝集反应的机理，以定性或定量检测药品或机体血液中的感染细菌内毒素的一种体外检测方法。采用产色或产萤光的肽型化合物，用于分析内毒素，化合物结构R1-A1-A2-A3-A4-B-R2，R2代表产色或产萤光基团；内毒素激活LAL的酶，酶水解肽型化合物生成颜色[文献1.美国专利名称为Peptide-type substrates useful in the quantitative determination ofendotoxin.专利号为US4510241]；利用内毒素的脂多糖与多粘菌素或八肽或类似的环肽的相互作用来测定内毒素，环肽或脂多糖上标记酶以供进一步检测[文献2.欧洲专利名称为Endotoxin assay.专利号为EP0265127]；用于鲎试剂测定用的肽型化合物，结构X-A1-A2-A3-B-R，A1-A2-A3是氨基酸，B是酰胺混合物，R与鲎试剂反应释放后产生氨基，进一步形成可见颜色[文献3.欧洲专利名称为Peptide substrates and method for thequantitative assay of endotoxin.专利号为EP0228666]；一种用鲎血液变形细胞溶解物的试剂，及其测定含丝氨酸蛋白酶样品中内毒素的方法[文献4.中国专利名称为用于内毒素测定的试剂以及使用该试剂进行测定的方法，专利号为ZL94103286.8]；用于内毒素特异性鉴别的含有鲎变形细胞溶解物试剂和烷基葡糖苷的试剂，及使用该试剂特异性鉴别样品中内毒素的方法[文献5.中国专利名称为用于内毒素特异性鉴别的试剂，专利号为ZL94117898.6]；一种鲎试剂细菌内毒素快检盒及使用方法，是按细菌内毒素检查法所需的鲎试剂、内毒素、溶解液、移液滴管等有关用具经特殊处理后，分套包装成试剂盒，简化实验操作[文献6.中国专利名称为鲎试剂细菌内毒素快检盒及使用方法，专利号为ZL95115774.4]；一种鲎试剂的活性定向生产工艺，制得鲎试剂不易受污染，灵敏度高，自身空白阴性观察时间长，产品稳定性高[文献7.中国专利专利号为ZL95105652.2]；一种通过鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应实现对水中细菌毒素含量进行限量测定的仪器[文献8.中国专利名称为一种细菌内毒素测定仪，专利号为ZL95216488.4]，它具有结构简单、成本低廉、操作方便、检测判定结果可靠以及符合药典规定等诸多优点。
利用动态比浊法和动态比色法原理，可以采用仪器来定量测定内毒素的浓度C，即在鲎试剂反应过程中，观察其浊度变化曲线或产色物质的颜色变化曲线，预设一个吸光度OD值如OD0.02或拐点，以反应曲线从开始上升到该预设值时经历的时间作为反应时间(T(OD0.02)或T50，秒)，该反应时间的对数与内毒素浓度的对数呈线性关系，即标准曲线为LogT(OD0.02)＝a+b LogC或者Log T50＝a+b LogC，通过与标准曲线的比较来计算样品中的内毒素浓度。国内外常用的相应的检测仪器有美国LAL-5000型、日本和光Toxinometer ET-201系列、国内金山川EDS-98，MB-80系列检测系统及天大BET-32系列检测系统。
采用鲎试验法，不管是定性还是定量测定内毒素的含量，鲎试剂灵敏度的准确性是至关重要的；常规的鲎试剂灵敏度的测定方法是限量法分别进行预测定和正式测定，需要将细菌内毒素工作标准品等比稀释为至少4个浓度，每个浓度做4个管，所用标准品多，试验准备耗时长；反应保温时间为60±2分钟，反应时间长；观察结果用目测法，容易出现人为误差；内毒素的回收率在50-200％之间，范围宽。

发明内容
本发明的目的是，提供一种测定鲎试剂灵敏度的方法，以准确、快速地测定鲎试剂的灵敏度，解决了测定鲎试剂灵敏度的方法稳定性问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为采用一系列(3～6个)不同浓度的标准内毒素溶液，在内毒素测定仪上，对不同灵敏度的标准鲎试剂分别进行试验，将其反应时间的对数与内毒素浓度的对数做线性回归，得到相应的不同灵敏度的标准曲线，作为判断的依据；待测灵敏度的鲎试剂，与一个或多个(1～6个)浓度的标准内毒素反应，得到相应的反应时间，利用不同灵敏度鲎试剂的内毒素标准曲线，分别计算内毒素浓度及内毒素的回收率，再根据回收率在75-120％之内的标准曲线所对应的灵敏度，来确定待测鲎试剂的灵敏度。
所述内毒素测定仪是采用动态比浊法或动态比色法定量测定内毒素，得到相应的不同灵敏度鲎试剂的测定内毒素的标准曲线；所述动态比浊法为OD限值法、透光率限值法或T50归一化法；标准鲎试剂灵敏度范围最好为0.01～0.5EU/ml；未知鲎试剂的灵敏度范围最好在0.01～0.5EU/ml。
本发明具有如下优点1.快速。本发明采用定量法来测定鲎试剂的灵敏度，由于利用其定量测定的原理，采用同一个浓度的标准内毒素，在内毒素测定仪上，分别对不同灵敏度的标准鲎试剂进行重复试验，得到相应的反应时间的均值和标准差，然后采用同一浓度的内毒素标准即可完成鲎试剂灵敏度的测定，试验准备耗时短。另外，在内毒素测定仪器上，采用鲎试剂直接测定内毒素，最少试验10分钟即可得到相应的数据，用于鲎试剂灵敏度的计算，反应时间短。
2.准确。本发明可以利用已有的内毒素测定仪器，实现鲎试剂灵敏度的准确、定量化测定，内毒素的回收率范围在75-120％之间，远小于常规方法要求的50-200％的回收率范围，计算的鲎试剂的灵敏度精确。观察结果用仪器测定吸光度法，结果客观、准确。
3.应用范围广。本发明可应用于动态比浊法和动态比色法，可望应用于科研、药品生产检验、鲎试剂的生产过程监控和质量控制等，为药品中内毒素的测定提供更科学、客观的方法。


图1为不同灵敏度鲎试剂的标准曲线示意图。
图2为0.06EU/ml鲎试剂样品的灵敏度判断示意图。
图3为0.25EU/ml鲎试剂样品的灵敏度判断示意图。
具体实施例方式
实施例1.
1)用于内毒素测定的不同鲎试剂的标准曲线基于标准曲线LogT(OD0.02)＝a+b LogC，采用标准内毒素浓度0.22-22EU/ml，分别对灵敏度为0.5、0.25、0.06EU/ml的标准鲎试剂进行试验，得到相应的标准曲线为(1)y＝-0.6197x+3.1531；(2)y＝-0.3725x+3.322；(3)y＝-0.4129x+3.2038；基于标准曲线Log(T50)＝a+b LogC，采用标准内毒素浓度0.22-22EU/ml，对灵敏度为0.01EU/ml的标准鲎试剂进行试验，得到相应的标准曲线为(4)y＝-0.171x+2.89；基于标准曲线Log(T50)＝a+b LogC，采用标准内毒素浓度3.125，6.25，25EU/ml，对灵敏度为0.06EU/ml的标准鲎试剂进行试验，得到相应的标准曲线为(5)y＝-0.377x+3.48；2)鲎试剂1的灵敏度测定采用4.4、2.2、0.88、0.44、0.22EU/ml的标准内毒素，对待测鲎试剂1进行试验，得到T(OD0.02)值依次为810、1200、1890、2110、2920秒。分别采用标准曲线(1)、(2)、(3)计算内毒素浓度和内毒素的回收率，回收率依次为(56％、60％、72％、120％、142％)；(293％、204％、151％、224％、187％)；(118％、91％、76％、116％、106％)，回收率在75-120％之间的是根据标准曲线(3)计算的结果，所以鲎试剂1的灵敏度是0.06EU/ml；鲎试剂2的灵敏度测定采用4.4、2.2、0.88、0.44、0.22EU/ml的标准内毒素，对待测鲎试剂2进行试验，得到T(OD0.02)值依次为1150、1650、2240、2860、3600秒。分别采用标准曲线(1)、(2)、(3)计算内毒素浓度和内毒素的回收率，回收率依次为(32％、36％、55％、74％、102％)；(114％、87％、95％、99％、107％)；(50％、42％、50％、56％、64％)，回收率在75-120％之间的是根据标准曲线(2)计算的结果，所以鲎试剂2的灵敏度是0.25EU/ml。
实施例2.
1)用于内毒素测定的不同鲎试剂的标准曲线采用标准内毒素浓度0.22-22EU/ml，对灵敏度为0.125EU/ml的标准鲎试剂进行试验，基于标准曲线LogT(OD0.02)＝a+b LogC，得到相应的标准曲线为(6)y＝-0.4204x+3.1932；2)鲎试剂3的灵敏度测定采用4.4EU/ml的标准内毒素，对待测鲎试剂3进行试验，得到T(OD0.02)值为820秒，分别采用标准曲线(1)、(2)、(4)计算内毒素浓度和内毒素的回收率，回收率依次为58％、303％、111％，回收率在75-120％之间的是根据标准曲线(6)计算的结果，所以鲎试剂3的灵敏度是0.125EU/ml；鲎试剂3的灵敏度测定采用22EU/ml的标准内毒素，对待测鲎试剂3进行试验，得到T(OD0.02)值为470秒，分别采用标准曲线(1)、(2)、(4)计算内毒素浓度和内毒素的回收率，回收率依次为27％、253％、79％，回收率在75-120％之间的是根据标准曲线(6)计算的结果，所以鲎试剂3的灵敏度是0.125EU/ml。仪器测定试验耗时470秒，约8分钟。
比较例1.
常规的鲎试剂灵敏度的测定方法是限量法，需要进行预测定和正式测定，需要将细菌内毒素工作标准品以2倍等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个边界稀释液，每一稀释液作4管，且其最高浓度的4管应均为阳性、最低浓度的4管应均为阴性，轻轻振动上述试管混匀内容物，封闭管口，置37±1℃水浴中，保温60±2分钟观察结果并按要求计算本批鲎试剂灵敏度(λ)，内毒素的回收率在50～200％之间；即将不同浓度的标准内毒素与鲎试剂在37℃保温反应1小时，根据目测是否出现凝胶来判断、计算鲎试剂灵敏度。
权利要求
1.测定鲎试剂灵敏度的方法，其特征在于1)采用3-6个浓度的标准内毒素，在内毒素测定仪上，对不同灵敏度的标准鲎试剂进行试验，将其反应时间的对数与内毒素浓度的对数做线性回归，得到相应的不同灵敏度的标准曲线，作为判断的依据；2)待测灵敏度的鲎试剂，与1～6个浓度的标准内毒素反应，得到相应的反应时间，利用标准曲线分别计算内毒素浓度及内毒素的回收率，根据回收率在75-120％之内的标准曲线所对应的灵敏度，确定为待测鲎试剂的灵敏度。
2.按照权利要求1所述的测定鲎试剂的灵敏度的方法，其特征在于所述内毒素测定仪是采用动态比浊法或动态比色法定量测定内毒素，得到相应的不同灵敏度鲎试剂的测定内毒素的标准曲线。
3.按照权利要求2所述的测定鲎试剂的灵敏度的方法，其特征在于所述动态比浊法为OD限值法、透光率限值法或T50归一化法。
4.按照权利要求1所述的测定鲎试剂的灵敏度的方法，其特征在于标准鲎试剂灵敏度范围为0.01～0.5EU/ml。
5.按照权利要求1所述的测定鲎试剂的灵敏度的方法，其特征在于未知鲎试剂的灵敏度范围在0.01～0.5EU/ml。
全文摘要
本发明涉及细菌内毒素的检测，具体地说是测定鲎试剂灵敏度的方法，其特征在于1)采用3－6个浓度的标准内毒素，在内毒素测定仪上，对不同灵敏度的标准鲎试剂进行试验，将其反应时间的对数与内毒素浓度的对数做线性回归，得到相应的不同灵敏度的标准曲线，作为判断的依据；2)待测灵敏度的鲎试剂，与1～6个浓度的标准内毒素反应，在相应的反应时间或溶液的吸光度条件下，利用标准曲线分别计算内毒素浓度及内毒素的回收率，根据回收率在75－120％之内的标准曲线所对应的灵敏度，确定为待测鲎试剂的灵敏度。本发明的优点是快速、准确、应用范围广。
文档编号G01N33/52GK1536363SQ03111398
公开日2004年10月13日 申请日期2003年4月9日 优先权日2003年4月9日
发明者李京华, 邵英光, 王俊德 申请人:中国科学院大连化学物理研究所