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专利名称：用于有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测的显色方法
技术领域：
本发明属于生物技术和农药学领域；更具体地，本发明涉及农药残留的快速检测方法。
背景技术：
食品安全，尤其是农产品安全已成为人们关注的焦点。农产品中农药残留超标问题，已影响人们餐桌的安全，从而影响人们的身体健康。因此，农产品残留问题已引起各级监管部门的重视，纷纷建立检测站对其进行检测和控制。目前，对农药残留的检测方法主要有气相色谱法和农药残留速测法。气相色谱法虽然能对农药残留进行定性和定量的检测，但由于方法学上的局限性，不适用于急需结果的大量现场检测工作。而农药残留速测法则正好具备了检测成本低、方便快速的优点，因而在工商、贸易等日常检测中得到广泛应用，农业部也将其作为一个推荐的方法。目前，农药残留速测法主要有速测仪和速测卡2种形式，两者检测的原理基本上是相同的，都是利用农药对乙酰胆碱酯酶的抑制作用和乙酰胆碱酯酶对乙酰胆碱的水解作用而呈现显色反应。而两者的主要差别在于速测仪是用光度法得到抑制率，而速测卡是用肉眼进行颜色的辨认，从而对样品中农药残留是否超标进行判断。综合以上两种方法，各有其优势与弊端。速测仪法虽然判定结果较为客观准确，但必须借助分光光度计，肉眼无法辨别显色区别，因此该方法的推广具有一定局限性。而速测卡法虽然操作简便，但由于阴阳性结果差别不明显，极易造成主观上的错误判断。因此，本领域非常有必要开发新的，易于检测易于判断结果的农药残留快速测定方法。

发明内容
本发明的目的在于提供一种农药残留的快速检测方法。在本发明的第一方面，提供一种神经毒类(优选有机磷或氨基甲酸酯类)农药快速检测方法，所述方法包括(1)将乙酰胆碱酯酶与待测试样混合，得到混合试样；(2)将混合试样与乙酰胆碱酯酶的底物反应，并且加入显色剂；所述的显色剂为 2,6- 二氯吲哚酚钠与二硫代二硝基甲酸的混合液；(3)观察反应后的溶液的颜色，若显蓝色，则该待测试样为神经毒类农药强阳性； 若显绿色，则该待测试样为神经毒类农药弱阳性；若显黄色，则该待测试样为神经毒类农药阴性。在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶的底物是乙酰胆碱或硫代乙酰胆碱。在另一优选例中，步骤(1)中，所述的乙酰胆碱酯酶的浓度依照不同来源的乙酰胆碱酯酶的酶活性确定；较佳地，3min的吸光度变化值应控制在0. 3以上。在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶溶于磷酸盐缓冲液(PBS)。
在另一优选例中，步骤O)中，所述的乙酰胆碱酯酶的底物与显色剂同时加入；或者先加入乙酰胆碱酯酶的底物，之后加入显色剂。在另一优选例中，在加入到混合试样后，所述的乙酰胆碱酯酶的底物的终浓度为8. 75 18. 75mM ；或所述的二硫代二硝基甲酸终浓度为4. 375 9. 375mM ；或所述的2，6- 二氯吲哚酚钠终浓度为7 15mM。在另一优选例中，在加入到混合试样后，所述的乙酰胆碱酯酶的底物的终浓度为11 14mM ；或所述的二硫代二硝基甲酸终浓度为5 SmM ；或所述的2，6- 二氯吲哚酚钠终浓度为8 12mM。在另一优选例中，在加入到混合试样后，所述的乙酰胆碱酯酶的底物的终浓度为12. 5mM ；或所述的二硫代二硝基甲酸终浓度为6. 25mM ；或所述的2，6- 二氯吲哚酚钠终浓度为10mM。在另一优选例中，浓度为32mM的2，6_ 二氯吲哚酚钠溶液、浓度为20mM的二硫代二硝基甲酸溶液以及浓度为40mM的硫代乙酰胆碱溶液以体积比1.2 1 1混合。在另一优选例中，所述的2，6_ 二氯吲哚酚钠、二硫代二硝基甲酸或乙酰胆碱酯酶的底物溶于磷酸盐缓冲液(PBS)，再进行混合。在另一优选例中，所述的神经毒类农药选自(但不限于)敌敌畏，对硫磷，辛硫磷，甲胺磷，马拉硫磷，丁硫克百威，氧化乐果，西维因，叶蝉散，残杀威，敌百虫或呋南丹。在本发明的另一方面，提供一种显色剂，其含有2，6_ 二氯吲哚酚钠和二硫代二硝
基甲酸。在另一优选例中，所述的显色剂中2，6_ 二氯吲哚酚钠，二硫代二硝基甲酸的摩尔比例为(1 2) 1。在另一优选例中，所述的显色剂中2，6_ 二氯吲哚酚钠，二硫代二硝基甲酸的摩尔比例为(1.4 1.8) 1。在另一优选例中，所述的显色剂中2，6_ 二氯吲哚酚钠，二硫代二硝基甲酸的摩尔比例为8 5。在本发明的另一方面，提供所述的显色剂的用途，用于检测神经毒类农药。在本发明的另一方面，提供一种试剂组合，其包括乙酰胆碱酯酶，乙酰胆碱酯酶的底物，2，6-二氯吲哚酚钠，二硫代二硝基甲酸。在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶、2，6_ 二氯吲哚酚钠、二硫代二硝基甲酸或乙酰胆碱酯酶的底物分别存在于磷酸盐缓冲液(PBQ中。在本发明的另一方面，提供一种试剂盒，含有所述的试剂组合。在另一优选例中，所述的试剂盒用于检测神经毒类农药。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图1显示了在样品中农药含量不同或没有农药时，检测组加入显色剂后形成的颜色。其中左边管显蓝色、中间管显绿色、右边管显黄色，三种颜色有明显不同。
具体实施例方式本发明人经过深入的研究，首次揭示了一种新型的基于乙酰胆碱酯酶的显色方法，该方法采用了特殊的显色剂，使得阴阳性显色结果非常明显，且无需分光光度计，肉眼可直接判断，在农残快速检测领域具有一定的应用前景。术语如本文所用，所述的“待测试样”是指任何需要检测其中是否存在农药(农药残留)的试样(样品)，例如农产品、瓜果、蔬菜、加工食品等。如本文所用，所述的“农药”是指神经毒类农药，只要能够抑制乙酰胆碱酯酶的活性的农药均可包含在本发明中，由本发明的方法测定。优选的神经毒类农药例如有机磷农药、氨基甲酸酯类农药。更具体地，所述的神经毒类农药选自但不限于)敌敌畏，对硫磷， 辛硫磷，甲胺磷，马拉硫磷，丁硫克百威，氧化乐果，西维因，叶蝉散，残杀威，敌百虫或呋南丹。所述的“乙酰胆碱酯酶的底物”是乙酰胆碱或其衍生物，例如硫代乙酰胆碱，其能够被乙酰胆碱酯酶水解。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构
成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”，“基本上
由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。检测原理本发明的检测方法基于的原理是多种神经毒物如有机磷农药、氨基甲酸酯类农药等，对乙酰胆碱酯酶(AChE)具有强烈的抑制作用。因此，可通过检测待测试样对于乙酰胆碱酯酶抑制作用的有无以及强弱来判断试样中农药的有无以及含量。判断乙酰胆碱酯酶的活性的强弱是通过加入乙酰胆碱酯酶的底物进行显色反应而实现的。在乙酰胆碱酯酶与待测试样的反应完成后，再加入底物进行显色反应。根据体系中颜色变化的情况来决定乙酰胆碱酯酶的活性。显色剂在现有技术中，二硫代二硝基甲酸是常用的显色剂，而2，6- 二氯吲哚酚钠很少被应用。以往没有将2，6_ 二氯吲哚酚钠与二硫代二硝基甲酸混合使用的先例。本发明人在深入的研究中意外地发现，2，6_ 二氯吲哚酚钠与二硫代二硝基甲酸的混合液对于检测乙酰胆碱酯酶的活性是特别灵敏的。因此，本发明提供了一种显色剂，其含有2，6- 二氯吲哚酚钠，二硫代二硝基甲酸。作为显色剂，2，6_ 二氯吲哚酚钠显示深蓝色，二硫代二硝基甲酸显示浅黄色(接近无色)，一般情况下两者混合后形成深蓝色的溶液。当待测试样中乙酰胆碱酯酶的活性受到强烈抑制(即试样中存在较多农药残留)时，其与底物的反应受到较大影响，从而显色剂仍然显示蓝色。当待测试样中乙酰胆碱酯酶的活性受到轻微抑制(即试样中存在较少农药残留)时，其与底物的反应受到一定的抑制，使得2，6-二氯吲哚酚钠颜色由深蓝变为浅蓝，而二硫代二硝基甲酸由浅黄变深，整体溶液显示绿色。当待测试样中乙酰胆碱酯酶的活性不受抑制(即试样中基本上不存在农药残留)时，其与底物正常反应，使得2，6-二氯吲哚酚钠颜色由深蓝变为无色，而二硫代二硝基甲酸由浅黄变深，整体溶液显示黄色。作为本发明的优选方式，混合显色剂中，2，6_ 二氯吲哚酚钠，二硫代二硝基甲酸的摩尔比例是(1 2) 1 ；较佳的摩尔比例是(1.4 1.8) 1;更佳的摩尔比例是8 5。本发明还提供了所述的显色剂的用途，用于检测神经毒类(特别是有机磷或氨基甲酸酯类)农药。方法本发明提供了一种神经毒类农药快速检测方法，所述方法包括(1)将乙酰胆碱酯酶与待测试样混合，得到混合试样；( 将混合试样与乙酰胆碱酯酶的底物反应，并且加入显色剂；所述的显色剂为2，6_ 二氯吲哚酚钠与二硫代二硝基甲酸的混合液；和( 观察反应后的溶液的颜色，若显蓝色，则该待测试样为神经毒类农药强阳性；若显绿色，则该待测试样为神经毒类农药弱阳性；若显黄色，则该待测试样为神经毒类农药阴性。在本发明的方法中，所述的乙酰胆碱酯酶的底物可以与显色剂同时加入；或者先加入乙酰胆碱酯酶的底物，之后加入显色剂。作为显色剂的2，6-二氯吲哚酚钠与二硫代二硝基甲酸可以同时加入或分别加入。作为本发明的优选方式，步骤(1)中，所述的乙酰胆碱酯酶的浓度可依照不同来源的乙酰胆碱酯酶的酶活性确定，较佳地:3min的吸光度变化值控制在0. 3以上。更佳地， 所述的乙酰胆碱酯酶溶于磷酸盐缓冲液(PBS)。作为本发明的优选方式，事先将乙酰胆碱酯酶的底物与显色剂配制成混合溶液， 同时加入到待测试样与乙酰胆碱酯酶的反应液中。作为一种实施方式，在配制时，浓度为 32mM的2，6- 二氯吲哚酚钠溶液、浓度为20mM的二硫代二硝基甲酸溶液以及浓度为40mM硫代乙酰胆碱溶液以体积比1.2 1 1混合。所述的2，6_ 二氯吲哚酚钠、二硫代二硝基甲酸或乙酰胆碱酯酶的底物可溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中。试剂组合及试剂盒基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种试剂组合，其包括乙酰胆碱酯酶， 乙酰胆碱酯酶的底物，2，6- 二氯吲哚酚钠以及二硫代二硝基甲酸。所述的试剂组合用于检测待测试样中的农药残留情况。本发明还提供了一种试剂盒，其中含有所述的试剂组合。所述的试剂盒用于检测神经毒类农药。所述的试剂盒中，还可含有使用说明书，用于指导本领域技术人员来检测神经毒类农药。本发明的主要优点在于首次找到了特别适合于检测乙酰胆碱酯酶活性的混合显色剂，使得阴阳性显色结果非常明显，且无需分光光度计，肉眼可直接判断。本发明的方法操作简单，速度快，无需借助仪器，在农残快速检测领域具有良好的应用前景。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条
6件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和
份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1实验材料显色剂A :4°C下饱和的2，6- 二氯吲哚酚钠(DCIP)溶液(约32mM)，DCIP固体粉末由PBS(磷酸盐缓冲液)溶解。显色剂B 终浓度为20mM的二硫代二硝基甲酸(DTNB)溶液，DTNB固体粉末由PBS溶解。底物终浓度为40mM硫代乙酰胆碱(AchI)溶液，AchI固体粉末由PBS溶解。混合显色剂显色剂A，显色剂B以及底物以体积比1.2 1 1混合。乙酰胆碱酯酶浓度根据酶的活性情况确定，3min的吸光度变化值控制在0. 3以上，用PBS溶解。实验方法步骤1.取酶液50μ 1至EP管中，加入50 μ 1农药溶液或果蔬萃取液，充分混勻。同时设空白对照组(50 μ 1 PBS)。2.加入30 μ 1混合显色剂，充分混勻，室温或37°C放置反应。3.等空白对照组变为亮黄色，表明反应完成。检测组若显蓝色，为阳性反应，即存在农药残留；检测组显绿色，为弱阳性反应，即存在微量农药残留；检测组显黄色，为阴性反应，即不存在农药残留(见图1)。
权利要求
1.一种神经毒类农药快速检测方法，其特征在于，所述方法包括(1)将乙酰胆碱酯酶与待测试样混合，得到混合试样；(2)将混合试样与乙酰胆碱酯酶的底物反应，并且加入显色剂；所述的显色剂为2， 6- 二氯吲哚酚钠与二硫代二硝基甲酸的混合液；(3)观察反应后的溶液的颜色，若显蓝色，则该待测试样为神经毒类农药强阳性；若显绿色，则该待测试样为神经毒类农药弱阳性；若显黄色，则该待测试样为神经毒类农药阴性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的乙酰胆碱酯酶的底物是乙酰胆碱或硫代乙酰胆碱。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的乙酰胆碱酯酶的底物与显色剂同时加入；或者先加入乙酰胆碱酯酶的底物，之后加入显色剂。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在加入到混合试样后，所述的乙酰胆碱酯酶的底物的终浓度为8. 75 18. 75mM ；或所述的二硫代二硝基甲酸终浓度为4. 375 9. 375mM ；或所述的2，6- 二氯吲哚酚钠终浓度为7 15mM。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的神经毒类农药选自敌敌畏，对硫磷，辛硫磷，甲胺磷，马拉硫磷，丁硫克百威，氧化乐果，西维因，叶蝉散，残杀威，敌百虫或呋南丹。
6.一种显色剂，其含有2，6_ 二氯吲哚酚钠和二硫代二硝基甲酸。
7.如权利要求6所述的显色剂，其中2，6_二氯吲哚酚钠，二硫代二硝基甲酸的摩尔比例为(1 2) 1。
8.权利要求6或7所述的显色剂的用途，用于检测神经毒类农药。
9.一种试剂组合，其包括乙酰胆碱酯酶，乙酰胆碱酯酶的底物，2，6-二氯吲哚酚钠， 二硫代二硝基甲酸。
10.一种试剂盒，含有权利要求9所述的试剂组合。
全文摘要
本发明涉及农药残留的快速检测方法。本发明首次揭示了一种新型的基于乙酰胆碱酯酶的显色方法，该方法采用了特殊的显色剂，使得阴阳性显色结果非常明显，且无需分光光度计，肉眼可直接判断，在农残快速检测领域具有良好的应用前景。
文档编号G01N21/78GK102455295SQ20101052346
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者吴松洁, 李井泉, 王子良, 王慧, 相丽, 郝淼 申请人:中国科学院上海生命科学研究院