专利名称：：一种人体肠道菌群检测分型及定量试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明属微生物核酸诊断领域，特别是涉及一种人体肠道菌群检测分型及定量试剂品-。
背景技术：
：肠道内的细菌对人体的生长发育、免疫功能、营养、药物代谢、发病机制及健康等起着重要的作用。肠道内细菌的分离、鉴定和定量对于研究肠道内菌群的功能以及与机体的相互关系非常重要。目前国内外已建立了若干针对肠道菌rRNA基因的分型方法，但这些方法普遍存在着结果不稳定、操作难度大、通量小、无法定量等弱点，妨碍了研究机构和临床单位对肠道菌群开展有效的科研和检测。现有的肠道菌检测方法主要分为两种，一是传统的细菌培养加菌落计数，一是分子生物学定量分析法。细菌培养加菌落计数是肠道菌定性定量的一种传统计数方法，主要是依据细菌表型特征通过特殊培养基接种培养、菌株计数而实现。然而大多情况下，待测样品中往往混合了多种细菌，此时必须利用选择性鉴别培养基来进行鉴别计数，各种细菌不同的氧耐受性、营养要求、抗生素敏感性以及菌落的形态和颜色特征构成了鉴别的基础.同时培养基中添加的抗生素对菌本身也会有不同程度的抑制作用，而且特异性培养基只是相对特异，到目前为止也没有一种完全理想的选择性培养基.这些原因使得传统的细菌培养法虽然能计数活菌，但费时、费力、培养难度大，其计数也不精确.传统细菌培养法的鉴别依据是基于细菌的形态学、生理学和生物化学特征，而这些特征仅仅是细菌在特殊培养条件下的特异表现，相反分子生物学定量分析法是以细菌基因组的核酸序列为鉴别基�。灰资芡饨缁肪骋蛩氐母扇�,不依赖培养基性能，不受培养时间限制，使定量分析结果更稳定、更敏感、更省B寸，同时重复性更好.细菌细胞内核糖体数量达104105,核糖体RNA(rRNA)又具有特异区和保守区之分，因此5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA的指纹图谱和序列常被用作为比较微生物学分类的方法.其中16SrRNA的序列达150012000个核苷酸，其序列长度适中，兼有保守区和可变区之分，因此其序列资料常用于设计基因探针和PCR(多聚酶链反应)扩增引物。由于探针和引物具有高度敏感性和特异性，使其能在属、种、亚种甚至株等各个水平上对细菌进行鉴别计数。目前用于肠道菌定量分析的分子生物学技术主要有点杂交(dotblothybridization)、荧光原4立杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)、荧光原j立杂交结合流式细胞计数(FISHcombinedw池flowcytometry)和聚合酶链反应(PCR)技术。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种人体肠道菌群检测分型及定量试剂盒，本发明的检测方法具有定型、定量速度快、通量高、低成本的有点。本发明的一种人体肠道菌群检测分型及定量试剂盒，其针对肠道菌的16SrDNA，应用通用引物PCR和特异探针，检测人体粪便样本中双歧杆菌、干酪乳杆菌种、嗜酸乳杆菌、肠球菌、肠杆菌和真杆菌及其含量。所述的双歧杆菌、干酪乳杆菌种、嗜酸乳杆菌、肠球菌、肠杆菌和真杆菌6种人类肠道菌的16SrDNA通用引物PCR序列为上游5'-CAGGATTAGATACCCTGGTAGT-3'下游5'-TTGCGCTCGTTGCGGGACTT-3。'所述的肠球菌的16SrDNA的特异探针序列为LDR探针F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACCACTCTAGAGATAGR:P-AGCTTCCCCTTCGGGGGCAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMLCR下游探针F:TTTTTTTTTTTTGCCCCCGAAGGGGAAGCTR:CTATCTCTAGAGTGGTCAAATTTTTTTTTT肠球菌的产物长度80bp。所述的肠杆菌的16SrDNA的特异探针序列为LDR探针F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGR:P-GCGTGGCTTCCGGAGCTAACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMLCR下游探针F:CTCAAGGGCACAACCTCCAATTTTTTTTTTR:TTTTTTTTTTGTTAGCTCCGGAAGCCACGC肠杆菌的产物长度85bp。所述的真杆菌的16SrDNA的特异探针序列为LDR探针F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACATATGGGTGAAGCGGR:P-GGGAGACCCCGTGGCCGAGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM6LCR下游探针F:CCGCTTCACCCATATGTCAATTTTTTTTTTR:TTTTTTTTTTTCTCGGCCACGGGGTCTCCC真杆菌的产物长度90bp。所述的双歧杆的16SrDNA的特异探针序列为-LDR探针F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGATGTGGGGCCCGTTCCAR:P-CGGGTTCCGTGTCGGAGCTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMLCR下游探针F:TTTTTTTTTTTAGCTCCGACACGGAACCCGR:TGGAACGGGCCCCACATCCATTTTTTTTTT双歧杆菌的产物长度95bp。所述的干酪乳杆菌的16SrDNA的特异探针序列为LDR探针F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGGTCTTGACATCTTTTGALCR下游探针F:TTTTTTTTTTAAACCTGATCTCTCAGGTGAR:TCAAAAGATGTCAAGACCTGTTTTTTTTTT干酪乳杆菌的产物长度100bp。所述的嗜酸乳杆菌的16SrDNA的特异探针序列为LDR探针LCR下游探针F:TTTTTTTTTTGAACTCCGTATCTCTACGGAR:TTGCACTAGATGTCAAGACCTTTTTTTTTT嗜酸乳杆菌的产物长度105bp。所述的双歧杆菌、干酪乳杆菌种、嗜酸乳杆菌、肠球菌、肠杆菌和真杆菌6种人类肠道菌的探针混合方案为肠杆菌、真杆菌、双歧杆菌的LDR探针pM100:100:100肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌的LCR探针pM100:100:100。本发明的一种人体肠道菌群检测分型及定量试剂盒，其检测步骤包括标准菌双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌的培养和标准菌DNA的抽提，样本中肠球菌、肠杆菌、真杆菌预处理及DNA的抽提；用特异PCR引物扩增双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、肠球菌、肠杆菌、真杆菌的16SrDNA的序列片段；将16SrDNA片段插入T载体，转入DH5a大肠杆菌制得的感受态细胞中，通过蓝白斑筛选挑出含有插入片段的菌体，再通过测序确认插入片段为各菌属特异16srDNA片段；单菌落用于大量培养，再抽提质粒DNA即得到各菌属的标准品DNA。最后通过紫外分光光度仪测定抽得的标准品DNA浓度，再稀释到109cOpieS/UL;将制得的6种菌属标准品按照均匀分布表格设计的方案混合，见表l。表1标准品模板混合方案<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>主1为一个标定的浓度单位(unit),105copies根据表l中所示的5个模板浓度组合，分别利用16SrDNA通用引物进行扩增。将PCR产物作为模板，利用肠杆菌、真杆菌、双歧杆菌的等浓度LDR探针100pmol/L，以及肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌的等浓度LCR探针100pmol/L，针对这5个模板浓度组合同时进行LDR和LCR的分型检测最后由测序仪获取荧光信号，以模板浓度比为横坐标，信号比为纵坐标，做线性回归分析，得到标准曲线。样本预处理后抽提DNA，作为16srDNA的扩增模板，然后利用16srDNA通用引物进行PCR扩增。扩增后的PCR产物继续作为模板同时进行LDR和LCR反应，所用探针为肠杆菌、真杆菌、双歧杆菌的等浓度LDR探针100pmol/L和肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌的等浓度LCR探针100pmol/L。最后通过测序仪获取荧光信号，对比各菌属的标准曲线换算成初始模板含量，完成样本的定量检测及分型。本发明的检测方法通过设计一对通用引物，对两条相似的模板进行同时扩增，这两条模板具有近似的序列、长度相同或相近，所以无论循环数的多少以及已知的或不可预期的可变因子的影响，它们均以相同的速率扩增，扩增产物的比例精确的反应了两模板的初始浓度比。待检样本经通用引物PCR放大后再用连接酶检测反应(ligasedetectionreaction,LDR)来对样本中的菌种进行分型和定量。DNA连接酶催化两条DNA链发生縮合反应生成磷酸二酯键。由于要在核苷酸片断与模板链完全配对的情况下，连接酶才能把缺口连接上，特别是上游片断的3'端，3'端一个碱基的错配，也将导致连接反应的失败，所以连接反应被用于单碱基突变的研究。在LDR中，只要上下游探针的选取与设计恰当，就可以保证连接产物的特异性，所以LDR在分型中的应用也是很有优势的，并且多对探针同时进行连接反应，相互之间的干扰也是很小的，这样就可以在一个样本中区分多个序列。本发明在样本检测时，由于样本中各菌属量上有数量级的差异，先用LDR探针对经通用引物扩增得的PCR产物进行信号检测，若有某些菌属LDR探针检测不出信号，则换用LCR探针对此样本PCR产物重检。LDR的信号检测范围只有2个数量级以内。LCR探针能检出比LDR所检模板低1000倍浓度的模板。检测的动态范围扩大到10000倍以内。有益效果(1)本发明的检测方法针对肠道菌的通用引物有效扩增出所有目标肠道菌16SrDNA序列，保证了各目标序列以及其中低拷贝的模板可被检测到；(2)本方法使各菌属的特异探针进一步保证了特异性，使各目标序列完全区分出来，实现多重分型定量。图1是16SrDNA序列通用引物PCR结合LDR分型定量人体肠道菌试剂盒的样本检测的示意图，其中(A)为人的粪便中抽提出的样本DNA模板，(B)为针对肠道菌16SrDNA序列设计的通用引物，(C)内是利用16SrDNA序列通用引物和样本DNA模板进行的PCR反应，(D)为针对肠道菌16SrDNA序列的特异LDR探针，(E)为针对肠道菌16SrDNA序列的特异LCR探针，(F)内进行的是按特异探针混合方案进行的多重LDR，LCR反应，(G)为ABIPrism377型测序仪上获得的荧光定量分型分析图。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1样本预处理及DNA抽提试验步骤(1)预处理釆集健康成年人新鲜粪便标本，每份样本湿重约4g，收集在无菌塑料袋中，4'C冰箱保存，时间不超过12h。每份粪便标本加入装有6ml的无菌PBS缓冲液(0.05mol/L,pH7.4)试管中充分振荡摇匀5—10min后500rpm离心5min，收集上清液。此步骤重复3次。然后上清液5,000rpm离心10min，收集沉淀置于Eppendorf管中。沉淀物在1mL双蒸水(ddH20)中悬置，混和后14,000rpm离心5min收集沉淀。将沉淀溶于200无水乙醇(-20。C预冷)，振荡混匀后14,000rpm离心2min，弃上清，此步骤重复3次。(2)DNA抽提在经预处理的样本中加200pL含溶菌酶的TE(溶菌酶浓度20mg/mL)，用移液尖混匀。室温下孵育40min加入DNA抽提试剂盒中提供的消化缓冲液400pL，混匀；再加入3nL蛋白酶K，混匀后55。C保温2—3h。加入260pL无水乙醇，混匀后用移液尖将样品全部转移至DNA抽提柱中。8,000rpm室温离心1min。取下DNA抽提柱，弃去收集管中的废液。将柱放回收集管中，加入500nL洗液，10,000rpm，室温离心30s。此步骤重复两次。取下DNA抽提柱，弃去收集管中的全部废液。将柱放回收集管中，10,000rpm，室温离心lmin，以除去残留洗液。将柱放入新的Eppendorf管中，在柱中央加入50pl洗脱缓冲液，室温或37。C放置2min。10,000rpm，室温离心1min。离心管中收集的液体即为细菌基因组DNA。实施例216srDNA通用引物、LDR和LCR探针设计试验步骤在Genebank中搜査各菌属16SrDNA序列信息，均查到50个以上然后一起进行比对，找到两端保守、中间包含变异区域的区段用于设计。为保证PCR扩增效率的一致性以及探针的特异性，再筛选出含有两端完全一致序列的区域以及中间变异区对各菌属均有特异序列的区段。在两端保守区设计通用引物，保证了引物与各菌属的引物结合序列完全配对，10在中部变异区比对出各菌属特异的序列设计出特异探针。为了进一步保证扩增效率的一致与有效，最后确认了320bp左右的一个区段设计引物、探针，跨两个变异区，3个保守区。除了设计探针区域其它均保守，整体GC含量相近，符合cPCR序列相似的要求。实施例3标准品DNA和样本DNA的通用引物扩增试验步骤(1)标准DNA与样本检测所用扩增体系相同。(2)通用引物上游，5'-CAGGATTAGATACCCTGGTAGT-3'下游，5'-TTGCGCTCGTTGCGGGACTT-3'(3)扩增体系(10nL):上游引物0.5jxmol/L下游引物0,5^tmol/LBufferdNTP0.2mmol/LMg2+2.0mmol/LTaqpolymerase1U加水至10pL(4)扩增程序95。C15min94°C30s—55。C30s—72。C60s(40cycles)72°C7min实施例4标准品DNA、样本DNA的连接酶检测反应(LDR)和链接酶链式反应(LCR)试验步骤(1)将通用引物扩增所得PCR产物用于LDR和LCR信号检测(2)LDR和LCR共用一个反应体系体系(l(HiL):混合探针0.1pmol/LBuffer1x模板1hLTaq0.1pL(4unit)H20补充至10pL(3)LDR反应程序95°C2min94°C30s—60。C2min(25cycles)(4)在样本检测中，经通用引物扩增后所得PCR产物，按下述探针混合方案进行检测。肠杆菌、真杆菌、双歧杆菌的LDR探针(pM)100:100:100肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌的LCR探针(pM)100:100:100。1权利要求1.一种人体肠道菌群检测分型及定量试剂盒，其特征在于针对肠道菌的16SrDNA，应用通用引物PCR和特异探针，检测人体粪便样本中双歧杆菌、干酪乳杆菌种、嗜酸乳杆菌、肠球菌、肠杆菌和真杆菌及其含量。2.根据权利要求1所述的一种人体肠道菌群检测分型及定量试剂盒，其特征在于所述的双歧杆菌、干酪乳杆菌种、嗜酸乳杆菌、肠球菌、肠杆菌和真杆菌6种人类肠道菌的16SrDNA通用引物PCR序列为上游5'-CAGGATTAGATACCCTGGTAGT-3'下游5'-TTGCGCTCGTTGCGGGACTT-3。'3.根据权利要求1所述的一种人体肠道菌群检测分型及定量试剂盒，其特征在于所述的肠球菌的16SrDNA的特异探针序列为LDR探针F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACCACTCTAGAGATAGR:P陽AGCTTCCCCTTCGGGGGCAArnTnTTTTnTTTTTTTT-FAMLCR下游探针F:TTTTTTTTTTTTGCCCCCGAAGGGGAAGCTR:CTATCTCTAGAGTGGTCAAATTTTTTTTTT肠球菌的产物长度80bp。4.根据权利要求1所述的一种人体肠道菌群检测分型及定量试剂盒，其特征在于所述的肠杆菌的16SrDNA的特异探针序列为LDR探针F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGR:P-GCGTGGCTTCCGGAGCTAACTTTnTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMLCR下游探针F:CTCAAGGGCACAACCTCCAATTTTTTTTTTR:TTTTTTTTTTGTTAGCTCCGGAAGCCACGC肠杆菌的产物长度85bp。5.根据权利要求1所述的一种人体肠道菌群检测分型及定量试剂盒，其特征在于所述的真杆菌的16SrDNA的特异探针序列为LDR探针F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACATATGGGTGAAGCGGR:P陽GGGAGACCCCGTGGCCGAGAmTmTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMLCR下游探针F:CCGCTTCACCCATATGTCAATTTTTTTTTTR:TTTTTTTTTTTCTCGGCCACGGGGTCTCCC真杆菌的产物长度90bp。6.根据权利要求1所述的一种人体肠道菌群检测分型及定量试剂盒，其特征在于所述的双歧杆的16SrDNA的特异探针序列为LDR探针F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGATGTGGGGCCCGTTCCAR:P-CGGGTTCCGTGTCGGAGCTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMLCR下游探针F:TTTTTTTTTTTAGCTCCGACACGGAACCCGR:TGGAACGGGCCCCACATCCATTTTTTTTTT双歧杆菌的产物长度95bp。7.根据权利要求1所述的一种人体肠道菌群检测分型及定量试剂盒，其特征在于所述的干酪乳杆菌的16SrDNA的特异探针序列为LDR探针F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGGTCTTGACATCTTTTGALCR下游探针F:TTTTTTTTTTAAACCTGATCTCTCAGGTGAR:TCAAAAGATGTCAAGACCTGTTTTTTTTTT干酪乳杆菌的产物长度100bp。8.根据权利要求1所述的一种人体肠道菌群检测分型及定量试剂盒，其特征在于所述的嗜酸乳杆菌的16SrDNA的特异探针序列为LDR探针LCR下游探针F:TTTTTTTTTTGAACTCCGTATCTCTACGGAR:TTGCACTAGATGTCAAGACCTTTTTTTTTT嗜酸乳杆菌的产物长度105bp。9.根据权利要求1所述的一种人体肠道菌群检测分型及定量试剂盒，其特征在于所述的双歧杆菌、干酪乳杆菌种、嗜酸乳杆菌、肠球菌、肠杆菌和真杆菌6种人类肠道菌的探针混合方案为肠杆菌、真杆菌、双歧杆菌的LDR探针pM100:100:100肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌的LCR探针pM100:100:100。10.根据权利要求1所述的一种人体肠道菌群检测分型及定量试剂盒，其检测步骤包括标准菌双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌的培养和标准菌DNA的抽提，样本的预处理及DNA的抽提；用特异PCR引物扩增双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、肠球菌、肠杆菌、真杆菌的16SrDNA的序列片段；将16SrDNA片段插入T载体，转入DH5a大肠杆菌制得的感受态细胞中，通过蓝白斑筛选挑出含有插入片段的菌体，再通过测序确认插入片段为各菌属特异16srDNA片段；单菌落用于大量培养，再抽提质粒DNA即得到各菌属的标准品DNA。最后通过紫外分光光度仪测定抽得的标准品DNA浓度，再稀释到一个109copieS/uL;将制得的6种菌属标准品按照均匀分布表格设计的方案混合，<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>根据上表中所示的5个模板浓度组合，分别利用16SrDNA通用引物进行扩增，将PCR产物作为模板，根据权利要求9中的探针混合方案同时进行LDR和LCR的分型检测，最后由测序仪获取荧光信号，以模板浓度比为横坐标，信号比为纵坐标，做线性回归分析，得到标准曲线；样本的检测与标准品同时进行，最后对照标准曲线读出或计算出上述菌的相对浓度。全文摘要本发明涉及一种人体肠道菌群检测分型及定量的方法，包括由通用引物PCR扩增和特异探针LDR两部分组成，在PCR扩增中，设计的通用引物同时扩增出所选菌属的16srDNA片段；再经过连接反应，各菌属特异的LDR探针达到分型的目的；LDR信号由ABIPrism377型测序仪检出，测得的荧光值作为定量的依据。本发明的检测方法针对肠道菌的通用引物有效扩增出所有目标肠道菌16SrDNA序列，保证了各目标序列以及其中低拷贝的模板可被检测到，本方法使各菌属的特异探针进一步保证了特异性，使各目标序列完全区分出来，实现多重分型定量。文档编号G01N21/64GK101509034SQ20081020288公开日2009年8月19日申请日期2008年11月18日优先权日2008年11月18日发明者周宇荀,凯李,汤周睿,王勤熙,肖君华申请人:东华大学
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