专利名称：钾离子浓度检测试剂盒和系统的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体而言涉及一种钾离子浓度检测试剂盒和系统。
背景技术：
人体内的钾是维持细胞生理活动的主要阳离子，是保持机体的正常渗透压及酸碱平衡，参与糖及蛋白质代谢，保证神经肌肉的正常功能所必需，其含量是人体生理活动的重要指标。尿液、血清中钾离子的含量水平在临床上可用了诊断一些肾脏、心脏等方面的疾 病。正常情况下，人体的钾离子浓度有一个合理的参考范围，如血清中3.5
5.5mmol/L ;尿液中25 125mmol/24h。当钾离子高于参考值，表现出高钾症，其原因主要有急性肾功能衰竭、严重溶血或组织损伤、急性酸中毒或组织缺氧、肾上腺皮质功能减退、醛固酮缺乏、长期应用利尿剂、家族性高血钾等。血清钾高还可引起严重的肌肉、心肌和呼吸功能的抑制性应激紊乱，以及特异的心电图改变。血清钾高于7mmol/L时，就有这些现象出现，超过lOmmol/L时，即可发生心室纤颤，心脏停搏而导致死亡。反之当钾的摄入量不足、钾丢失严重、肾脏疾病转入多尿期等情况时则会出现低钾症。现有技术中测定钾离子浓度的方法主要有中子活化法、同位素稀释质谱法、化学测定法、火焰光度法、离子选择电极法、酶动力学法、原子分光光度法等。目前，临床上经常使用的方法是火焰光度法和离子选择电极法。(I)火焰光度法火焰光度法是一种发射光谱分析法，利用火焰中激发态原子回降至基态时发射的光谱强度进行含量分析，可检测血清、尿液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+，该方法属于经典的标准参考法，优点是结果准确可靠，广为临床采用。通常采用的定量方法有外标准法和内标准法。外标准法一般操作误差较大，不常采用。内标法是标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素进行测定，一般是加入锂内标，测定的是锂/钾电流的比值，而不是单独钾的电流，这样，可减小燃气和火焰温度波动等因素引起的误差，因而有较好的准确性。(2)离子选择电极法(ISE法):在专用仪器上进行血清和尿液的钾、钠离子测定。因其具有标本用量少，快速准确，操作简便等优点，是目前所有方法中最为简便准确的方法，几乎有取代其他方法的趋势。其原理是离子选择电极是一种电化学传感器，其结构中有一个对特定离子具有选择性响应的敏感膜电极，将离子活度转换成电位信号，在一定范围内，其电位与溶液中特定离子活度的对数呈线性关系，通过与已知离子浓度的溶液比较可求得未知溶液的离子活度，按其测定过程又分为直接测定法和间接测定法，目前大部分采用间接测定法，由于间接测定法将待测样本稀释后测定，所测离子活度更接近离子浓度。目前主要的电极种类有玻璃膜电极，感应材料为玻璃膜；固相电极，由难溶金属物质加压成型；液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙烯作为感应膜；缬氨霉素膜制成的K+电极。这些电极都具有一定寿命，使用一段时问后，电极会老化，且价格昂贵。(3)化学测定法目前K+的化学测定主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为冠醚，均为离子载体进行测定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧原子有未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大�。裳≡裥越岷喜煌本兜慕鹗衾胱樱佣纱锏讲獬隼胱优ǘ鹊哪康�。(4)酶法酶法测定钾的原理是利用对丙酮酸激酶的激活作用，后者催化磷酸烯醇式丙酮酸变为乳酸同时伴有还原型辅酶I的消耗，在波长340nm处测NADH的吸光度下降。(5)原子分光光度法也可用于检测血清中钾、钠离子，但操作复杂，误差较大，不及火焰光度法简便。
发明内容
本发明的目的提供一种利用菁染料超分子与鸟嘌呤四链体(G-四链体)作用体系检测钾离子浓度的新方法，以及应用该方法配制而成的钾离子浓度检测试剂盒。利用该试剂盒中的试剂，可利用紫外吸收光谱或荧光光谱仪器定量分析血清或尿液中钾离子的浓度，测定过程不受钠离子或其他微量元素的影响，精确度高。同时，由于该试剂灵敏度很高，对不同钾离子浓度表现出颜色上的变化，肉眼可见，可实现可视化检测。本发明的总体技术路线为通过加入钾离子来调控G-四链体结构的形成或构象转变，随之菁染料识别G-四链体结构的变化，从而反映出钾离子的浓度水平。具体为在没有钠离子及其他金属阳离子存在的环境下，钾离子促使单链的DNA序列转变为G-四链体结构，随着G-四链体结构的生成，菁染料的聚集形态发生变化，从而在颜色上发生改变，达到肉眼观测，同时在紫外吸收光谱及荧光光谱上也发生明显的变化，吸光度及荧光强度的变化程度与钾离子浓度成正比，从而实现定量反映钾离子水平；或者在钠离子存在的环境下，DNA序列形成反平行结构G-四链体，加入钾离子反平行G-四链体则发生构象转变，随着G-四链体构象转变，菁染料的聚集形态发生变化，从而在颜色上及紫外吸收光谱及荧光光谱上也发生明显的变化，吸光度及荧光强度的变化程度与钾离子浓度成正比，可定量反映钾离子水平。本发明的第一方面提供一种检测液体样品中钾离子浓度的方法，所述方法包括以下步骤(I)用pH6. 2 8. 2的缓冲溶液配制钾离子浓度不同的多个溶液样本，其中每个所述溶液样本中含有相同浓度的能够形成G-四链体的DNA分子以及相同浓度的菁染料；(2)将所述多个溶液样本置于紫外可见光吸收光谱仪或分光光度计下，检测第一波长处的吸光度值及第二波长处的吸光度值，或者将所述多个溶液样本置于荧光光谱仪下，采用560nm的激发波长，检测波长在第三波长处的荧光强度值，其中所述第一波长在560nm至590nm范围，所述第二波长在500nm至540nm范围，所述第三波长在580nm至640nm范围；(3)以各个所述溶液样本的钾离子浓度作为横坐标或纵坐标，以步骤(2)中测得的第一波长处的吸光度值或第二波长处的吸光度值或者第一波长处的吸光度值与第二波长处的吸光度值的比值或者第三波长处的荧光强度值为纵坐标或横坐标作图，从而获得钾离子浓度的标准曲线；(4)在待测液体样品中加入能够形成G-四链体的DNA分子、式I的化合物以及缓冲液，以使待测液体样品中的能够形成G-四链体的DNA分子的浓度、式I的化合物的浓度、以及pH值与步骤(I)中的溶液样本一致，从而得到测试溶液；(5)将步骤(4)中获得的测试溶液置于紫外可见光吸收光谱仪或分光光度计下，检测测试溶液在第一波长及第二波长处吸光度值，或者将所述测试溶液置于荧光光谱仪下，采用560nm的激发波长，检测第三波长处的荧光强度值；(6)利用步骤(5)中测得的第一波长处的吸光度值或第二波长处的吸光度值或者第一波长处的吸光度值与第二波长处的吸光度值的比值或者第三波长处的荧光强度值在步骤(3)中获得的钾离子浓度标准曲线中找到对应的测试溶液的钾离子浓度值，然后通过待测样品被的稀释倍数计算出待测样品的钾离子浓度。 本发明的方法可以方便地用于检测各种溶液样品中的钾离子浓度，例如，可以检测人或动物血液、尿液或其他体液中的钾离子浓度。
由于在人体或动物体中，除了钾离子之外还存在许多其他金属离子，特别是钠离子的存在对本发明的方法的精确性会产生一定的影响。因此，本发明的第二方面提供一种在钠离子背景下检测液体样品中钾离子浓度的方法，所述方法包括以下步骤(I)用pH6. 2 8. 2的缓冲溶液配制钾离子浓度不同的多个溶液样本，其中每个所述溶液样本中含有相同浓度的能够形成G-四链体的DNA分子、相同浓度的钠离子以及相同浓度的菁染料；(2)将所述多个溶液样本置于紫外可见光吸收光谱仪或分光光度计下，检测所述溶液样本在第一波长及第四波长处的吸光度值，或者将所述多个溶液样本置于荧光光谱仪下，采用560nm的激发波长，检测波长在第三波长处的荧光强度值，其中所述第一波长在560nm至590nm范围,所述第四波长在6 IOnm至670nm范围,所述第三波长在580nm至640nm范围；(3)以各个所述溶液样本的钾离子浓度作为横坐标或纵坐标，以步骤(2)中测得的各溶液样本在第一波长处的吸光度值或第四波长处的吸光度值或者第一波长处的吸光度值与第四波长处的吸光度值的比值或者第三波长处的荧光强度值为纵坐标或横坐标作图，从而获得钾离子浓度的标准曲线；(4)在待测液体样品中加入能够形成G-四链体的DNA分子、式I的化合物以及缓冲液，以使待测液体样品中的能够形成G-四链体的DNA分子的浓度、式I的化合物的浓度以及PH值与步骤(I)中的溶液样本一致，从而得到测试溶液；(5)将步骤(4)中获得的测试溶液置于紫外可见光吸收光谱仪或分光光度计下，检测所述测试溶液在所述第一波长及所述第四波长处的吸光度值，或者将所述测试溶液置于荧光光谱仪下，采用560nm的激发波长，检测波长在所述第三波长处的荧光强度值；(6)利用步骤(5)中测得的第一波长处的吸光度值或第四波长处的吸光度值或者第一波长处的吸光度值与第四波长处的吸光度值的比值或者第三波长处的荧光强度值在步骤(3)中获得的钾离子浓度标准曲线中找到对应的测试溶液的钾离子浓度值，然后通过待测样品被的稀释倍数计算出待测样品的钾离子浓度。根据本发明第一方面的方法，其中所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液或2-氨基-2-甲基-I-丙醇缓冲液。
根据本发明第二方面的方法，其中所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-I-丙醇缓冲液、磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液或磷酸钠缓冲液。在本发明的实施方案中，对缓冲液中缓冲剂的浓度并不做特别的限定，但是优选的浓度范围为10 50mmol/L。根据本发明第一方面或第二方面的方法，其中所述菁染料为下式I的化合物
权利要求
1.一种检测液体样品中钾离子浓度的试剂盒，其包括pH6. 2^8. 2的缓冲液、可溶性钾盐、能够形成G-四链体的DNA分子和菁染料。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其还包括可溶性钠盐。
3.如权利要求I或2所述的试剂盒，其中所述菁染料为式I的化合物，
4.如权利要求3所述的试剂盒，其中所述C1-CJ烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其中R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基、异己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基；R2、R3> R4和R5独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其中所述5元至7元环结构为含有或不含有N或S原子的饱和或不饱和环结构。
7.如权利要求3所述的试剂盒，其中Y选自氟、氯、溴、碘阴离子或三乙胺阳离子。
8.权利要求I所述的试剂盒，其中所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液或2-氨基-2-甲基-I-丙醇缓冲液。
9.权利要求2所述的试剂盒，其中所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-I-丙醇缓冲液、磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液或磷酸钠缓冲液。
10.一种检测液体样品中钾离子浓度的系统，所述系统包括如权利要求I至9中任一项所述的试剂盒和紫外可见光吸收光谱仪或分光光度计或荧光光谱仪。
全文摘要
本发明涉及检测钾离子浓度的试剂盒和系统。该试剂盒和系统利用钾离子调控可形成G-四链体DNA结构转变的特性以及菁染料超分子聚集体识别G-四链体结构转变的特性，特异性高，不受样品中钠离子的影响。试剂成分简单，反应过程简单，可有效减少操作产生的误差，测试精确度高。通过该试剂盒和系统可实现快速检测，不需要特殊或额外仪器，检测成本低廉，便于行业内推广应用。
文档编号G01N21/64GK102735623SQ20121020772
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月18日 优先权日2012年6月18日
发明者向俊锋, 唐亚林, 姜薇, 孙红霞, 尚倩, 杨千帆, 盖伟 申请人:中国科学院化学研究所
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
