专利名称：一种提高Bt杀虫蛋白在汉逊酵母中表达量的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及使用一个复合增强子以实现Bt融合蛋白基因在多型汉逊酵母细胞中以组成型方式高效表达的方法，其中包括1)使用一个复合增强子以提高密码子优化后的Bt融合蛋白基因在汉逊酵母中的产量；幻采用毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子调控Bt融合蛋白基因在汉逊酵母中以组成型的方式表达；3)优化后的汉逊酵母发酵培养生长条件；4)利用纳滤及镍柱亲和层析快速提纯该重组外源蛋白的方法。而由此方法制备的Bt重组融合蛋白可作为蛋白质标准物质备选物应用于蛋白质溯源研究等领域。
背景技术：
Bt是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的简称，属革兰氏阳性上壤芽胞杆菌。该细菌产生的Bt杀虫毒蛋白能够破坏昆虫肠道内的细胞渗透压，造成消化紊乱， 最终导致昆虫死亡。Bt基因是第一代抗虫基因的典型代表，它表达的蛋白统称为Cry晶体蛋白。根据杀虫谱及氨基酸序列同源性的不同，Bt基因被分为不同的类型，其中CrylAb和 CrylAc对鳞翅目害虫具有专一性毒性，而其它的Bt基因则对双翅目或鞘翅目等害虫具有专一毒性。Bt基因通过生物技术手段转入作物后，能够表达具有杀虫活性的毒蛋白并使植物具备抗虫性。目前，国内外已经获得转Bt基因的作物有棉花、水稻、玉米、小麦和油菜等。虽然现在市场上有许多可用于Bt转基因蛋白质测定的试剂盒，但不同的厂商可能采用不同的工艺表达、分离纯化原料，以及不同的方法确定参考物质的量值，而蛋白质检测标准物质和量值溯源传递体系的严重缺乏使得不同试剂盒内所带参考物质不能溯源到上一级的计量标准，也就无法保证不同试剂盒所带参考物质量值的准确性与可溯源性，造成测定结果不准确和缺乏可比性，对生物安全监管带来隐患，由此产生一系列法律、贸易等经济和社会问题。因此，在我国范围内，尽快研制Bt蛋白标准物质，建立起灵敏准确的定量测定方法及Bt转基因植物蛋白量值溯源传递体系，对于今后保证测定结果的溯源性、准确性和可比性，显得十分迫切且意义重大。近几年来，随着人们对汉逊酵母(Hansenula polymorpha)生物学特性的深入研究，发现其作为外源基因表达宿主的优势逐渐显现。汉逊酵母也是一种甲醇营养型酵母，与毕赤酵母类似。汉逊酵母中甲醇代谢的主要途径有两种(Lodeboer A.M.，et al. , 1985) 一种是在过氧化物酶体中进行，甲醇在甲醇氧化酶(methanol oxidase, M0X)作用下生成甲醛和H2O2，甲醛再经甲醛脱氢酶(formaldehyde dehydrogenase)和甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase, FMD)作用下生成C02，H2O2在过氧化氢酶(catalase，CAT)的作用下生成 H2O和& ；甲醇的另一个代谢途径发生在过氧化物酶体外，甲醇在细胞质中经过一系列酶的催化作用最后转变为糖类，其中二羟丙酮合成酶(dihydroxyacetone synthase,DHAS)是这一过程的关键酶。甲醇代谢过程中的各种关键酶，包括Μ0Χ、DHAS和CAT等的表达都是在转录水平进行调解的，它们受甲醇、甘油和山梨醇的诱导，受葡萄糖和乙醇的阻遏，但当葡萄糖浓度低于0. 时，阳遏作用即被解除。在甲醇完全诱导条件下，过氧化物酶体可占细胞总体积的80%，M0X和DHAS可占细胞总蛋白的15%，它们的启动子具有极强的启动下游基因表达的功能，目前已被用作外源基因在酵母中表达的常用启动子。诱导型启动子以其强启动功能和严紧的调控机制被广泛的应用于外源基因的表达，已有很多外源蛋白在这些启动子的调控下在汉逊酵母细胞中得到高效的表达。目前用于汉逊酵母外源蛋白表达系统的诱导型启动子都需要在一定剂量甲醇存在的条件下才能发挥作用，但由于甲醇是有毒物质，且易燃易爆，这样就限制了该系统在医药或食品等领域的应用。因此，各种组成型启动子就应运而生，已经成功应用于汉逊酵母外源蛋白表达系统的组成型启动子有质膜AIPase 启动子(pPMAl)和翻译延伸因子Ia启动子(TEFl)等，这些组成型启动子的应用不仅无需在发酵培养基中加入甲醇，而且也简化了发酵工艺和降低了成本等。汉逊酵母作为外源蛋白表达宿主多采用营养缺陷型菌株来进行重组子的初步筛�。壳耙训玫蕉嘀钟毕菪途辏缌涟彼崛毕菪�、甲硫氨酸缺陷型和酪氨酸缺陷型等(Seon AhCheon, et al.，2009)。同时，由于汉逊酵母对氨基糖苷类抗生素敏感，G418、 Zeocin和潮霉素B等抗生素抗性基因也被广泛地用作筛选标记。以汉逊酵母作为外源基因的表达宿主时，外源DNA整合到酵母基因组中主要可分为随机整合和同源重组，其中同源重组需要导入的DNA中必须含有汉逊酵母的同源序列。 同源序列与酵母基因组中某段DNA序列完全或部分一致，从而导致外源DNA在此位置可通过同源交换整合到酵母基因组中。汉逊酵母转化常用的同源序列包括各种强启动子和 rDNA(Klabunde J. , et al. ,2003)序列，而本发明首次采用了汉逊酵母质膜AIPase基因作为同源整合序列。真菌质膜AIPase是上世纪70年代未首次在粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中被发现的，随后分别从粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中得到提纯。质膜 ATPase是酵母质膜中含量最多的蛋白，占总质膜蛋白的15%，占总细胞蛋白的0. 3%，它的主要作用是作为一个跨膜的质子泵，维持细胞内的PH值和电化学梯度，从而使多种营养物质得以运输。汉逊酵母质膜AIPase (Helen Cox, 2000)基因全长^97bp，编码898个氨基酸。本发明中首次将其插入到汉逊酵母表达载体中作为外源基因整合的同源序列。作为外源基因的表达宿主，汉逊酵母具有许多优点1)汉逊酵母的最适生长温度在37 43°C，菌体生长速度快，发酵时间短；2)以rDNA作为整合的同源序列，可以获得高拷贝的转化子，有可能极大地提高外源重组蛋白的表达量；幻多个外源基因能够通过一步法同时被整合到酵母基因组中，并按照一定剂量关系同时或分别表达。上述优点使汉逊酵母表达系统迅速发展成为最具魅力的真核表达系统之一，目前，已经有多种外源蛋白基因在汉逊酵母中获得了表达，见表1 表1在汉逊酵母中表达的部分外源蛋白外源蛋白来源表达呈文献Glucose oxidase (GOD)Aspergillus neger500mg/L (MOX 启动子) 1 85mg/L (PMA1 启动子)I Ielen Cox,2000Human serum albumin (rHA)Human280mg/L (MOX 启动子) 460mg/L (PMA1 启动子)uricaseCandida utilis2.4g/LZhiyu Chen,e/ c /.,2008BFSHa/ScCnel 融合蛋内’牛4.7mg/LWeidong Qian,( i αι., 2009BFSHp/ScCnel融合蛋白牛6.2mg/'Lα-醇腈酶2.015U/ml张冬冬7，2009人血洁闩蛋闩人1.033g/L, ； 凡2006乙肝表面抗原乙肝病毐0.4g/LGellissen G,et ai 1996* =BFSHa 为 Bovine follicle-stimulation homone α M S, ScCnel 为 Sacchromyces cerevisiae calnexin在本发明之前，还没有采用密码子优化后的Bt基因在汉逊酵母中以组成型方式表达该蛋白的的报道，也没有人使用一个复合增强子序列以大大提高Bt在汉逊酵母细胞中的表达量。本发明首次按照酵母所偏爱的密码子，人工合成了一个完整的Bt融合蛋白基因及一个复合增强子序列，并利用克隆的毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GAPDH) 以及汉逊酵母菌株A16的质膜AIPase基因，构建了一个全新的、组成型的和分泌型的汉逊酵母高效表达载体，在将该外源基因导入汉逊酵母细胞后，通过抗性筛选、活性检测等方法，获得了能够高效表达Bt重组融合蛋白酵母工程菌株，再经特定条件的高密度发酵培养、纳滤和亲和层析等一系列操作，最终制备的重组Bt重组融合蛋白可作为蛋白质标准物质备选物应用于蛋白质溯源研究等领域。
发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的之一是要证实一个复合增强子能够大大提高密码子优化后的Bt重组融合蛋白基因在汉逊酵母细胞中的生物表达量。按照一个优先的实施方案，Bt融合蛋白基因首先被按照酵母所偏爱的密码子所优化并人工合成出来，然后它被置于一个毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GAPDH)操纵之下，连同一个复合增强子，一起被整合到汉逊酵母基因组中，随着重组酵母工程菌的生长，Bt融合蛋白基因在复合增强子的作用下能够以组成型方式得到高效表达。本发明的目的之二是提供最适的重组汉逊酵母生长和表达条件以及目标蛋白快速的纯化方法。按照一个优先的实施方案，提供了有关重组汉逊酵母的最适的生长培养条件和外源蛋白表达条件，如培养基的成分、接种量、PH值、溶氧量和培养时间等，由此使该重组酵母工程菌的生长量和重组蛋白的分泌量都尽可能地达到最大化。通过离心除菌、纳滤、 亲和层析等操作从发酵液中得到高纯度的Bt外源重组蛋白，以便其可作为蛋白质标准物质备选物应用于蛋白质溯源研究等领域。(二)技术方案本发明利用汉逊酵母表达系统以组成型方式表达和生产Bt重组融合蛋白，该重组蛋白具有与天然蛋白相类似的结构和组成。按照一个优先的实施方案，本发明提供了使用一个增强子以实现Bt融合蛋白基因在汉逊酵母中以组成型方式高效表达和生产的方法，该重组Bt具有与天然Bt蛋白相类似的结构与组成。同时本发明也提供了 Bt在汉逊酵母中可高密度发酵生产以及该重组蛋白快速分离和纯化的方法。本发明利用汉逊酵母表达系统表达和生产Bt重组融合蛋白，如果将其经过高度纯化，可作为蛋白质标准物质备选物应用于蛋白质溯源研究等领域。本发明所指的Bt重组融合蛋白是在汉逊酵母中以组成型方式表达和生产的，首先是编码Bt蛋白的基因被按照酵母所偏爱的密码子进行优化并人工合成出来；与此同时， 为了以后该目标蛋白的高度纯化，在Bt基因末端添加了一个6组氨酸标签结构(6xHis)编码序列，然后，该融合蛋白基因被插入到一个带有α-因子分泌信号肽核苷酸编码序列的酵母表达载体上以便再形成一个新的融合蛋白基因。α-因子分泌信号肽的作用是操纵外源的重组Bt蛋白向汉逊酵母胞外的分泌。在该质粒载体上，含有一个组成型启动子，该启动子位于α-因子分泌信号肽与Bt形成的融合蛋白基因的上游，它操纵融合基因在汉逊酵母细胞中的表达。在融合基因的下游，含有一个复合增强子，它能够极大地提高Bt重组融合蛋白的表达量。在该质粒载体中还含有汉逊酵母质膜AIPase基因，它在质粒载体整合到酵母基因组内的过程中上起到了同源序列的作用。该载体经线性化处理后，可通过电融合或氯化锂等方法被导入到汉逊酵母细胞中，进而通过同源重组稳定整合到酵母染色体基因组内，此重组酵母在发酵培养过程中表达的Bt重组融合蛋白在α-因子分泌信号肽的引导下得以分泌到胞外的培养基中。本发明提供了极大地提高Bt重组融合蛋白在汉逊酵母中生物产量的方法，按照一个优先的实施方案，本发明提供了使用一个复合增强子以极大地提高Bt基因在汉逊酵母中表达效率的方法，而该重组蛋白与天然蛋白或其它常规表达系统生产的该重组蛋白相类似，可作为蛋白质标准物质备选物应用于蛋白质溯源研究等领域。在汉逊酵母细胞中，Bt融合蛋白基因表达效率的高低，直接关系到以后该重组蛋白的提取、加工利用及所生产相关产品成本的高低，按照一个优先的实施方案，为提高Bt 重组融合蛋白在汉逊酵母中的表达量，编码Bt重组蛋白的基因可按照酵母所偏爱的密码子进行优化，以便使该外源基因在汉逊酵母细胞中更稳定，在转录成mRNA和翻译成蛋白时效率更高。同时，以汉逊酵母质膜AIPase基因作为同源序列，可以将外源基因高效并稳定地整合到酵母基因组中，从而得到能够稳定表达Bt重组蛋白的汉逊酵母工程菌株。发酵产品中Bt重组蛋白的纯度直接关系到该重组蛋白的应用范围，按照一个优先的实施方案，为了快速纯化Bt组蛋白，可以首先使用不同截流分子量的过滤装置对酵母发酵液上清液进行预处理，然后再通过镍柱亲和层析，在纯化过程中的每一个环节，都可使用SDS-PAGE电泳进行检测，通过上述方法最终可获得纯度达到99. 9 %的Bt重组蛋白，可作为蛋白质标准物质备选物应用于蛋白质溯源研究等领域。对本发明所使用的方法和其它相关事项极为重要的是一些质粒载体的构建，它们在获得本发明所指的汉逊酵母细胞及其重组产物的加工应用中起重要作用。用于转化酵母细胞的质粒载体包含有密码子优化后的、编码Bt的基因和操纵该基因或DNA序列在所说的酵母细胞中表达的一个组成型启动子和一个复合增强子组成。在某些具体的实施方案中， 质粒载体还包括一个选择性或标记基因，主要用于重组汉逊酵母细胞的筛选和检测。在某些具体实施方案中，本发明的组成型启动子是酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GAPDH)， 正如上面所述，按照某些具体的实施方案，从毕赤酵母中克隆得到甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子序列，然后将其插入到质粒表达载体PPIC9K中并取代载体原位置上的诱导型启动子-乙醇氧化酶启动子，以便使该质粒表达载体能够以组成型方式表达外源蛋白。按照某些具体的实施方案，本发明的质粒表达载体用于转化汉逊酵母，它所编码的外源蛋白是重组Bt杀虫蛋白，更进一步地说，该质粒表达载体所编码的重组Bt杀虫蛋白与天然蛋白或其它常规表达系统生产的该蛋白类似，可作为蛋白质标准物质备选物应用于蛋白质溯源研究等领域。本发明也提供了汉逊酵母细胞遗传转化以及酵母重组子筛选的方法，它包括以下步骤1)按照酵母所偏爱的密码子，进行Bt融合蛋白基因(蛋白C端添加了 6xHis标签) 的人工合成；2) TYMV-HCMV复合增强子的人工合成；幻毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子的克隆；4)汉逊酵母质膜AIPase基因的克�。�5)构建一个质粒表达载体，其中含有编码Bt重组融合蛋白的基因序列，该融合蛋白基因首先与α -因子分泌信号肽核苷酸编码序列相互拼接形成一个新的融合蛋白基因，然后它们被置于毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子控制之下。在该质粒载体中，含有一个复合增强子序列，它能极大地提高Bt融合蛋白基因的表达效率。与此同时，该质粒表达载体中还包含有用于外源基因整合到酵母基因组的同源序列，该序列可以是PMAl或其它同源序列；6)通过电融合法或其他转化方法，将上述线性化后的质粒表达载体DNA导入到酵母细胞中，并将转化后的毕赤酵母细胞涂布于 RDB固体平板选择培养基上，能够在此培养基上生长的酵母单菌落就是含有外源基因的酵母重组子；7)挑选再生出的酵母细胞单菌落，逐一接种到含有不同浓度G418(浓度依次为 0. 5,1. 0,1. 5,2. Omg/mL)的YPD固体平板培养基上，那些能够在高浓度G418平板上生长的酵母单菌落具有较高的外源基因拷贝数，有可能具有较高的外源蛋白表达水平。按照一个优先的实施方案，本发明提供了经过优化的重组汉逊酵母培养生长条件以及Bt重组融合蛋白的快速纯化方法，它包括以下二个阶段1)菌体培养和蛋白大量表达阶段。以10%的接种量(占基础发酵培养基体积的比例)接种酵母工程菌，经过M 72 小时的培养，酵母菌体的湿重将达到180 190g/L左右，在此培养过程中不断补加碳源，并维持一定的PH值和溶氧量，使菌体高密度发酵，在酵母菌体生长的同时，重组Bt杀虫蛋白基因得到高效表达；幻蛋白快速纯化。发酵液经过离心和两次不同规格的滤膜过滤处理， 最后再经过一次镍柱亲和层析处理，Bt重组蛋白的纯度可达99. 9%以上。本发明在详细介绍酵母表达系统时仅提到汉逊酵母A16菌株，然而，如本领域专家所早已熟知的酵母表达系统那样，许多种酵母表达系统都可以利用本发明所提供的方法进行遗传转化、表达和生产。因此，所有这些酵母表达系统都应包括在本发明的权利要求范围之内。就像下面实例中所要详细描述的那样，本发明描述的酵母转化方法中所用的质粒载体是一个整合型的质粒表达系统，按照一个优先的实施方案，本发明所使用的质粒表达载体是一个得到改造后的PPIC9K，其原先的AOXl诱导型启动子被毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成型启动子所取代，此外，还添加了一个复合增强子序列以极大地提高外源基因在汉逊酵母中的表达效率。同时在该质粒表达载体中还包含有用于外源基因整合到酵母基因组内的同源序列，该序列可以是PMAl或其他同源序列。本发明包括以下几个组成部分1)按照酵母所偏爱的密码子，Bt融合蛋白基因的被人工合成出来，将该DNA序列插入到pEASY-Tl质粒的T位点内，用得到的中间质粒载体 DNA转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，使中间载体得到复制，然后进行DNA测序，分析所插入外源基因的正确性和完整性；幻根据已知序列，TYMV+HCMV复合增强子序列被合成出来， 该DNA序列插入到pEASY-Tl质粒的T位点内，用得到的中间质粒载体DNA转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞，使中间载体得到复制，然后进行DNA测序，分析所插入DNA片段的正确性和完整性；3)根据已知序列(GenBank :U62648. 1)，合成两端的引物，以毕赤酵母基因组DNA 为模板，经PCR扩增，可获得毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，将该DNA序列插入到 pEASY-Tl质粒的T位点内，用得到的中间质粒载体DNA转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞， 使中间载体得到复制，然后进行DNA测序，分析所插入外源DNA片段的正确性和完整性；4) 利用常规的分子生物学技术(内切酶和连接酶处理)，将毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子插入到上述的PPIC9K中并取代载体原位置上的诱导型启动子-乙醇氧化酶启动子， 以便使该表达载体能够以组成型方式表达外源蛋白基因；5)根据已知的PMAl基因序列，合成两端的引物，以汉逊酵母基因组DNA为模板，经PCR扩增，得到PMAl DNA序列，将其插入到pEASY-Tl质粒的T位点内，用得到的载体转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，使载体得到复制，然后测序分析PMAl基因的正确性和完整性；6)利用常规的分子生物学技术(内切酶和连接酶处理)，将Bt融合蛋白基因、TYMV-HCMV复合增强子序列、PMAl基因和毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子分别定向插入到pPIC9K质粒中的相应酶切位点内，由此形成一个全新的、组成型和分泌型酵母质粒表达载体；7)高表达酵母重组子的筛�。缛诤匣蚱渌糯椒ǎ鲜鲋刈楹蟮慕湍钢柿１泶镌靥�(已线性化)导入酵母受体细胞，在RDB固体平板选择培养基上培养，待酵母单菌落出现后，再将其逐一转接到含不同浓度G418的YPD固体平板培养基上，能够抵抗高浓度G418的酵母重组子由于具有较高的Bt 外源基因拷贝数，因而有可能具有较高的外源蛋白表达量，因此，挑选能够在最高浓度G418 的YPD固体平板培养基上生长的酵母重组子进行后续的操作；8)提供重组汉逊酵母最适生长培养和表达的条件；9)发酵上清液分别经离心、过滤和镍柱亲和层析等步骤后，可得到纯度达99. 9%以上的Bt重组融合蛋白。(三)有益效果采用本发明所述方法，可有效地将密码子优化后的Bt外源基因通过PMAl基因序列以同源重组的方式整合到汉逊酵母基因组中，获得的酵母工程菌株能够以组成型方式稳定和高效地表达Bt重组融合蛋白，同时提供了该重组蛋白的发酵和纯化工艺，适用于规模化生产Bt重组蛋白。
为了详细描述本发明的某些优先实施方案，并以相应的绘图作参考图1TYMV-HCMV复合增强子组成示意图曲线部分为EcoR I酶切位点；第9 113 核苷酸碱基源自TYMV的3’端非编码区(单画线部分)；第119 609核苷酸碱基源自HCMV 早基因增强子的第201 690部分(双画线部分)；虚线部分为Not I酶切位点。图2Bt毒蛋白基因密码子优化和改造前后对比N代表密码子优化和改造前的基因序列；M代表密码子优化和改造后的基因序列；图3组成型酵母高效表达载体EBt-ATP-GPIC9K和WBt_ATP_GPIC9K的构建全过程；图4SDS-PAGE电泳检测Bt重组融合蛋白表达情况M为标准分子量蛋白(BluePlus Proteinmarker 16 94KDa，北京 TransGen Biotech 公司产品)；CK_ 为阴性对照， GPIC9K转化的重组酵母菌株培养72小时发酵液上清；1 4分别源自WBt-ATP-GPIC9K转化酵母不同重组子培养72小时发酵上清液；5 8分别源自EBt-ATP-GPIC9K转化酵母重组子培养72小时发酵上清液，Bt重组融合蛋白的分子量约为68. 5kD ；图5不同培养时间下的Bt重组蛋白的表达情况及亲和层析后的Bt重组融合蛋白检测M为标准分子量蛋白(Blue Plus Protein marker 16 94KDa，北京TransGen Biotech公司产品)；1 4泳道培养时间分别为iai、24h、4 !和7 的发酵上清液；5为镍柱亲和层析后的Bt重组蛋白。图6使用ELISA方法检测不同酵母重组子Bt重组蛋白表达情况A1 3、Bl 3 为EBt-ATP-GPIC9K转化酵母重组子发酵上清液；Cl 3和Dl 3为WBt-ATP-GPIC9K转化酵母重组子上清液；El为阳性对照；E2 3为阴性对照。
具体实施例方式下面以汉逊酵母组成型表达Bt重组融合蛋白为例，描述一些优先的实施方案，但本发明的应用不仅限于此。本发明的进一步描述只是一些特别的优先实施方案，是按照专利申请要求以及为了解释和说明本专利的内容。很显然，在不背离本发明的精神和范围之内，可在此基础上，做进一步的改进和变化。实施例1 :TYMV-HCMV复合增强子的人工合成根据业已公布的Turnip yellowmosaic virus (TYMV)(见 GenBank，登录号 X07441)，和 Human cytomegalovirus (HCMV)(见 GenBank，登录号K03104)的 DNA 序列， 按照酵母所偏爱的密码子(Siarp P M，et al.，1986)，人工设计和合成了一个新的复合增强子序列(见SEQ ID NO :1)，在该序列中，有105个核苷酸碱基为TYMV的3’端非编码区 (TYMV基因组的第6214 6318核苷酸碱基)(见附图1中单画线部分)，有490个核苷酸碱基源自HCMV的早期基因增强子的核心部分(第201 690的核苷酸碱基)(见附图1的双画线部分，与此同时，为便于此后酵母表达载体的构建，在人工合成该复合增强子序列的过程中，在该DNA序列的5’端合成和添加了限制性酶切位点EcoR I ；在该DNA序列的3’端添加了限制性酶切位点Not I (上述DNA的合成和拼接工作由上海博亚生物技术公司代为完成)O实施例2 密码子优化后的Bt基因的人工合成Bt基因最初源于苏云金芽孢杆菌，其密码子为原核生物所偏好，而汉逊酵母属于真核生物，故它们在基因密码子偏好方面存在着一定的差异，而这种差异很可能会影响到 Bt基因及其转录产物在汉逊酵母细胞中的稳定性和表达效率。为提高Bt的生物产量，根据业已公布的Bt基因的DNA序列(原为植物偏好的密码子)和氨基酸序列(见GenBank， 登录号AR110596)，在不改变其氨基酸序列的前提下(见SEQ ID NO :2)，按照酵母所偏爱的密码子(Siarp P M，et al.，1986)，人工设计和合成了新的Bt成熟蛋白的DNA编码序列，密码子优化和改造后的Bt基因与改造前相比，改变了其中的422个核苷酸碱基，总共涉及到340个密码子，而G+C含量由原来的48 %变为现在的35 %，基因改造前后对比见附图2。与此同时，为了便于此后酵母表达载体的构建及重组蛋白的纯化，在人工合成该 Bt核苷酸编码序列的过程中，在该基因的5’端第一个翻译起始密码子ATG前合成和添加了限制性酶切位点》10 I以及酵母Kex2基因表达产物切割识别序列ΟΙΟαΔΟΔΔΔΔ Δ (见SEQ ID NO 3)；在该基因的3，端终止密码子TAA前增加了 6xHis标签结构编码序列 CMCATCAIGAT_C4IC:M，在TAA后增加了两个限制性酶切位点EcoR I和Not I (上述基因合成和拼接工作由上海博亚生物技术公司代为完成)。实施例3 :TYMV-HCMV复合增强子和Bt基因的克隆将上述人工合成的TYMV-HCMV复合增强子序列及Bt融合蛋白基因DNA片段分别直接插入到pEASY-Tl (购自北京TransGenic公司)质粒中的T位点内，按照该公司所提供的方法，得到含有中间质粒载体TYMV-HCMV-T和Bt-T的细菌克隆(见附图幻，然后，通过 DNA测序，确定其所含的TYMV-HCMV-T复合增强子和Bt-T基因序列是正确和完整的(DNA测序由北京标凯科技有限公司完成)。实施例4 毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子的克隆根据已知的毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子序列(GenBank :U62648. 1)，分别合成位于启动子两端的引物F和R，其中F为5 ‘ -ATGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGT C-C-3 ‘(划线部分为 BamH I 切点)，R 为 5 ‘ -ATGAGCTCTGTGTTTTGATAGTTGTTCAATTGATTG-3 ‘(划线部分为Mc I切点)，以毕赤酵母基因组DNA为模板(基因组提取方法参见《分子克隆实验指南第三版》485页)，以F和R为引物，通过PCR，扩增获得甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子序列(GAPDH)，将扩增片段直接插入到pEASY-Tl质粒中的T位点内，按照该公司所提供的方法，得到含有中间质粒载体GAPDH-T的细菌克隆(见附图3)，然后，通过核苷酸测序分析，确定GAPDH是正确和完整的，见SEQ ID NO :4。实施例5 汉逊酵母质膜ATP酶基因的克隆根据已知的汉逊酵母质膜ATP酶基因核苷酸序列(见GeneBank :AF109913)，分别设计和合成引物 primer 1 和 primer2，其中 Primerl 序列为5-ATCATATGATGCTGCAACTG AACCAACCAAGGAG-3，，Primer2 序列为5’ -ATGCATGCTCAGTTGGACTTCTCGTGCTGAGTAGAG-3’。 Primerl和primer2分别添加有Nde I (CATATG)和Sph I (GCATGC)限制性内切酶切位点， 用于后续的酵母表达载体的构建。以汉逊酵母基因组DNA为模板，PCR扩增汉逊酵母质膜 ATP酶基因，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切割目的条带并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的DNA片段，然后直接连接到pEASY-Tl质粒中的T位点内(购自TransGenic 公司)，按照该公司所提供的方法，得到含有质膜ATP酶基因的细菌克隆ATP-T(见附图3)， 然后，通过核苷酸测序分析，确定质膜ATP酶基因是正确的，见SEQ ID NO :5。实施例6 表达载体 EBt-ATP-GPIC9K 和 WBt_ATP_GPIC9K 的构建用限制性内切酶BamH I和Mc I进行双酶切，将连接在中间质粒载体GAPDH-T中的GAPDH DNA片段切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收该DNA片段。用同样的限制性内切酶处理质粒PPIC9K(美国hvitrogen公司产品)，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收线性化后的PPIC9K质粒DNA，然后将上述两个DNA片段混合后并用连接酶连接在一起便得到中间质粒载体GPIC9K (见附图幻，然后用上述质粒载体转化大肠杆菌细胞DH5 α (购自美国 GIBCO公司)以方便进行该质粒的复制和保存。用限制性内切酶Nde I和Sph I进行双酶切，将连接在中间质粒载体ATP-T中的汉逊酵母质膜ATP酶基因DNA片段切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收该DNA片段。用同样的限制性内切酶处理质粒GPIC9K，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收线性化后的GPIC9K质粒DNA，然后将上述两个DNA片段混合后并用连接酶连接在一起便得到中间质粒载体ATP-GPIC9K(见附图幻，然后用上述质粒载体转化大肠杆菌细胞DH5 α以方便进行该质粒的复制和保存。用限制性内切酶Β ο I和Not I进行双酶切，将插入在中间质粒载体Bt-T中的Bt基因DNA片段切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收该DNA片段。用同样的限制性内切酶处理质粒ATP-GPIC9K，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收线性化后的ATP-GPIC9K 质粒DNA，将上述两个DNA片段混合后并用连接酶连接在一起便得到汉逊酵母表达载体 WBt-ATP-GPIC9K(见附图3)，在该表达载体中不含有TYMV-HCMV复合增强子序列，主要作为阴性对照以说明TYMV-HCMV复合增强子对Bt外源基因表达的增强作用。用上述质粒载体转化大肠杆菌细胞DH5 α (购自美国GIBCO公司)以方便进行该质粒的复制和保存。用限制性内切酶Β ο I和EcoR I进行双酶切，将插入在中间质粒载体Bt-T中的 Bt基因DNA片段切下来；用EcoR I和Not I进行双酶切，将TYMV-HCMV复合增强子DNA序列自中间质粒载体TYMV-HCMV-T上切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分别分离和回收上述DNA 片段。用同样的限制性内切酶处理质粒ATP-GPIC9K，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收线性化后的ATP-GPIC9K质粒DNA，将上述三个DNA片段混合后并用连接酶连接在一起便得到汉逊酵母表达载体EBt-ATP-GPIC9K(见附图幻，在该表达载体中含有TYMV-HCMV复合增强子序列，然后用上述质粒载体转化大肠杆菌细胞DH5 α (购自美国GIBCO公司)以方便进行该质粒的复制和保存。质粒载体pPIC9K购自美国^ivitrogen公司，它是一个甲醇诱导型表达质粒载体， 含有一个诱导型启动子-醇氧化酶启动子(AOXl)，在甲醇的诱导下，可调控下游插入外源基因的高效表达。在该表达载体多克隆位点前含有α-因子分泌信号肽核苷酸编码序列， 在与外源基因融合表达后，可引导外源重组蛋白向酵母细胞外分泌。在分泌到胞外的过程中，该信号肽可以被酵母Kex2基因表达产物切割下来，从而不改变重组蛋白的N端序列。实施例7 线性化质粒表达载体DNA的制备首先用碱裂解法(参见分子克隆试验指南)，从上述的大肠杆菌DH5 α细胞中小分别制备提取EBt-ATP-GPIC9K和WBt-ATP-GPIC9K质粒DNA，然后用1 2倍过量的限制性内切酶)(ba I进行酶切，使之完全线性化，可利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全。然后用酚和氯仿分别抽提上述酶切产物，乙醇沉淀，弃上清，收集沉淀，经冷冻干燥后，将沉淀重新溶解在无菌的去离子水中，-20°C保存备用。实施例8 酵母细胞的遗传转化将_72°C保存的汉逊酵母菌液(菌株A16由中国农业大学李颖教授惠赠)接种到 5mL YPD中(1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖)，37°C震荡培养1天左右，将培养好的菌液以接种量重新接种于IOOmL YPD中，37°C震荡过夜培养(8h)至OD6tltl = 1. 3 1. 5,4000转/分离心5分钟，倒掉上清，将沉淀的酵母细胞重悬在40mL溶液a (50mM磷酸钾缓冲液，pH7. 5,25mM DTT)中，37°C温浴15min，4000转/分离心5分钟，倒掉上清，将沉淀的酵母细胞重悬在200mL冰预冷的溶液b (270mM蔗糖，IOmMTris-HCl，pH7. 5，ImM MgCl2) 中，4000转/分离心5分钟，倒掉上清，将沉淀的酵母细胞重悬在IOOmL预冷的溶液b中， 4000转/分离心5分钟，倒掉上清，将沉淀的酵母细胞重悬在ImL预冷的溶液b中，吸取 80uL于1. 5mL离心管中，与上述线性化表达载体EBt-ATP-GPIC9K和WBt-ATP-GPIC9K质粒DNAG 5ug)分别充分混勻，然后转移到冰浴后的0. 2cm无菌电击杯中，利用电击仪 ft~eCiSi0nPulSeTM(BTX公司产品)将线性化的表达载体质粒DNA导入酵母感受态细胞中，使用的电击参数为电压1. 5kV,电容50uF，电阻125 Ω。电击完成后，立即向电击杯中加入ImL 室温的YPD培养基(1%酵母提取物，2%酪蛋白胨，2%葡萄糖)，充分混勻后，37°C静置1小时，然后涂布于固体YPD培养基(液体培养基中加入了 2%琼脂粉，0.2mg/mL G418)上，平板倒置于37°C恒温培养箱中2 3天，至转化重组子出现。实施例9 高表达酵母菌株的筛选将在YPD培养基(0. 2mg/mL G418)上生长的酵母单菌落(转化子)用无菌牙签逐一挑取到含有梯度G418的YPD培养基(分别含有0. 5mg/mL、lmg/mL、l. 5mg/mL、2mg/mL G418)上，平板倒置于37°C恒温培养箱中1 2天。随着携带有G418抗性基因的外源质粒整合到酵母基因组中的拷贝数的增加，转化子对G418的抗性增强。挑取能够在含有ang/mL G418的YPD平板上生长的转化子，接种于IOOmL BMGY培养基[1 %酵母提取物，2%酪蛋白胨，IOOmM 磷酸钾缓冲液(ρΗ7· 0)，1. 34% ΥΝΒ，0· 00004% Biotin，甘油(ν/ν)]中，37°C 震荡培养4天，发酵液10000转/分离心5分钟，收集可能含有重组CP4-EPSPS蛋白的上清液，进行SDS-PAGE电泳检测。从附图4可知，在经表达载体EBt-ATP_GPIC9K转化所获得的重组酵母菌株培养上清液泳道中含有Bt目标蛋白带，而在经表达载体WBt-ATP-GPIC9K转化所获得的重组酵母菌株培养上清液泳道中则没有Bt目标蛋白带(培养7 后检测)。该结果表明TYMV-HCMV 复合增强子对提高Bt融合蛋白基因在汉逊酵母中的表达量方面起到了关键作用。随机挑取部分能够在ang/mL G418的YPD平板上生长的酵母转化子，发酵培养，取发酵液上清进行ELISA检测。Bt ELISA检测试剂盒购自美国Agdia公司，按照试剂盒所提供的方法，分别取100微升发酵上清液添加到酶链反应板的各小孔中，后依次冲洗、添加酶标抗体、TMB显色底物，在650nm的波长下测定吸光度。测定结果发现所有能够在ang/mL G418的YPD平板上生长的6个EBt-ATP-GPIC9K转化重组子都能产生阳性反应，且差别不明显。从中随机挑选出一株作为工程菌加以保存，并将其命名为HP-Bt。而在经表达载体 WBt-ATP-GPIC9K转化的6个酵母重组子与阴性对照一样均不能产生阳性反应(见附图5)。实施例10 重组酵母菌的高密度发酵1、种子液的制备挑取单菌落，将重组酵母菌株HP-Bt接种于IOmL BMGY培养基中，37°C震荡培养过夜，以10%的接种量转接于IOOmL BMGY培养基，37°C震荡培养过夜，再以10%的接种量转接于IL BMGY培养基，28°C震荡培养过夜，将其转接到3L BMGY培养基中，37°C震荡培养2 天，作为高密度发酵的种子液。2、重组酵母在50L发酵罐中的高密度发酵本发酵过程可以分为两个阶段1)初培养阶段在50L发酵罐(镇江东方生物工程设备技术有限责任公司)中盛放了 30L基础发酵培养基[lOXBasal Salts :2. 67%磷酸、0. 093%硫酸钙、1. 82%硫酸钾、1. 49%硫酸镁、0. 413%氢氧化钾+4%甘油]，在接种前先加入氨水使该培养基的PH值维持在4. 0左右(研究发现，低pH可防止目标蛋白的酶降解，在PH高于5时，目标蛋白的表达量降低)，再按照下述比例，在每升基础发酵培养基中加入4. 37mL微量盐溶液PTMl (0. 6%硫酸铜，0. 008%碘化钠，0. 3%硫酸锰，0. 02%钼酸钠，0. 002%硼酸，0. 05%氯化钴，2%氯化锌，6. 5%硫酸亚铁，0. 025%生物素，0. 5%硫酸)。按 10%的比例(与基础发酵培养基的体积之比)接种此前制备好的种子液，37°c通气搅拌 (转速为375转/分)培养M小时左右。在该阶段的进行过程中，随着酵母菌体的生长， 培养基中的溶氧量将由100%逐渐降低，当培养基中的碳源消耗完后，溶氧量将再度升高至 80%以上，此时菌体的湿重将达85 95g/L。2)蛋白大量表达阶段( 72h)从接种后的第二天，通过蠕动泵流加补料液，补料液为50%甘油(其中含有12mL PTM1/L)，流加量为 18mL/L/天。37°C通气搅拌培养，4 后菌体的湿重将达170 180g/L。随着菌体的生长， PH值逐渐降低，用氨水维持pH值在4. 0左右，同时调整通气量使此阶段的溶氧量始终维持在20%以上。每隔M小时取数毫升发酵液经5000rpm 4°C下离心10分钟，取30uL发酵液上清液进行SDS-PAGE检测，发现有肉眼可观察到的一条蛋白带，分子量约为68. 5kDa，与推测中的Bt重组蛋白分子量基本吻合。此外，从电泳图中发现，在培养72小时后，Bt重组蛋白表达量达到最高峰(见附图6)。实施例10 重组蛋白的纯化待一个发酵周期全部结束之后，留取500mL发酵液作为种子液(接种量为5% ) 直接进行下一轮的发酵过程。类似的操作累计进行3轮，在每轮发酵过程中，均对菌体的生长量和Bt重组蛋白的表达量进行了测定。另外，在每轮发酵过程完全结束后，还取少许菌液涂布于YPD固体平板上，并从中任意挑取10个酵母单菌落，快速提取其基因组(蔡传奇等，2001) DNA，进行PCR检测，结果发现，菌体的生物量、生长速度以及重组蛋白的表达量在各轮发酵过程中基本保持稳定，另外，PCR的检测结果也证实重组汉逊酵母菌株具有很好的遗传稳定性(见表2)。表2. HP-Bt菌株的遗传稳定性和外源蛋白表达稳定性的测定
PCR阳性生长对小时的菌体湿重(g/L)诱导72小时财表达量(mg/L)100%8941100%9143100%9041在一个发酵周期结束之后，除留下500mL发酵液作为种子液外，其余的发酵液用于Bt重组蛋白的纯化。发酵液经5000rpm 4°C离心10分钟，留取上清。发酵液上清用截流分子量为IOKDa的纳滤膜(上海朗极化工科技有限公司，产品编号』似6538，使用方法见该公司说明)处理，保留回流液，终体积约为700mL。将此回流液进行脱盐处理，向700mL回流液中加入6. 3L蒸馏水，即将回流液稀释10倍，然后将稀释液再次通过上述IOKDa的纳滤膜处理，此时得到的回流液中盐离子浓度也相应稀释10倍，如此重复操作5次，即回流液中盐离子浓度稀释IO5倍，最终得到700mL回流液，将此回流液冷冻干燥后，可得到初步提纯的重组蛋白冻干粉(纯度大约为13%左右)。将上述蛋白冻干粉重新悬浮于50mL的20mM Tris-HCl缓冲液中(pH7. 9，含5mM咪 P坐，0. 5M NaCl)。准备20mL的镍柱，首先用无菌水洗柱(10倍柱床体积)，流速lmL/mim，然后用上样缓冲液I (IOmM Tris-HCl，pH7. 9，含0. 25M NaCl)进行平衡(10倍柱床体积)，流速为lmL/min。将50mL的上述蛋白样品液以lmL/min的速度加入到柱子中。用上样缓冲液I 继续平衡(10个柱床体积)，然后分别用含有50mM、IOOmM及400mM咪唑的IOmMTris-HCl缓冲液(pH7. 9，含0. 25M NaCl)进行洗脱，流速为2mL/min，收集各阶段的洗脱峰，在SDS-PAGE 电泳后，用UVP凝胶成像仪检测Bt重组蛋白回收纯度。在上述纯化流程中，每个操作步骤之后都留取少量样品以便进行总蛋白量、纯度和回收率的测定(见表幻。用Bradford法检测蛋白的浓度。最终制得的重组蛋白纯品进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色和脱色后，电泳图经LabWork软件(美国UVP公司产品)分析，结果显示Bt重组蛋白浓度达到99. 9%以上 (见附图6)，重组蛋白的表达量约为41mg/L。表3. Bt重组蛋白的纯化
权利要求
1.一种使用复合增强子以提高Bt融合蛋白在汉逊酵母表达量的方法。
2.如权利要求1中的方法，其中所说的复合增强子具有序列表中的1所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1中的方法，编码Bt融合蛋白的DNA序列，其特征在于具有序列表3中所示的核苷酸序列。
4.如权利要求1中的方法，需构建一种表达质粒载体，其特征在于它含有权利要求2所述的复合增强子序列及权利要求3中所述的编码Bt融合蛋白的DNA序列。
5.如权利4中所述的表达载体，其特征在于，在构建表达载体时，采用的起始载体为 PPIC9K或其他能够组成型表达并分泌重组蛋白到胞外的质粒载体。
6.如权利要求1中的方法，需要一种酵母宿主细胞，其特征在于它包含权利要求4和5 中所述的表达载体。
7.如权利要求6中所述的宿主细胞，它是指汉逊酵母菌株A16或其他能够表达外源基因的酵母菌株。
8.利用权利要求7所述的汉逊酵母菌株A16高效表达和生产Bt重组融合蛋白的方法， 其中包括了四个阶段1)种子液制备挑取酵母单菌落，接种于IOmLYPD液体培养基中，37°C振荡培养过夜后，将该培养物转接于IOOmL YPD培养基中，37°C振荡培养M小时后，该培养物转接于3L BMGY培养基中，37°C振荡培养48小时，然后将其作为种子液；2)初培养阶段在20L发酵罐中盛放了IOL基础发酵培养基[lOXBasal Salts 2. 67%磷酸、0. 093%硫酸钙、1. 82%硫酸钾、1. 49%硫酸镁、0. 413%氢氧化钾+4%甘油]， 在接种前先加入氨水使该培养基的PH值维持在4. 0左右，再按照下述比例，在每升基础发酵培养基中加入4. 37mL微量盐溶液PTM1(0. 6%硫酸铜，0. 008%碘化钠，0. 3%硫酸锰， 0. 02 %钼酸钠，0. 002 %硼酸，0. 05 %氯化钴，2 %氯化锌，6. 5 %硫酸亚铁，0. 025 %生物素， 0. 5%硫酸)。按占基础发酵培养基体积10%的比例接种此前制备好的种子液，37°C通气搅拌(转速自始至终维持在375转/分)培养M小时左右；3)蛋白大量表达阶段从接种后的第二天，通过蠕动泵流加补料液，补料液为50%甘油(其中含有12mL PTM1/L)，流加量为18mL/L/天。37°C通气搅拌培养至72h，用氨水维持 PH值在4. 0左右，同时调整通气量使此阶段的溶氧量始终维持在20%以上。4)发酵液经5000rpm4°C离心10分钟，留取上清。用截流分子量为IOKDa的纳滤膜处理上清液，保留回流液。用蒸馏水将回流液稀释10倍，然后再通过IOKDa的纳滤膜处理，如此重复操作5次。将回流液冷冻干燥后，可得到初步提纯的Bt重组蛋白冻干粉。将其重新悬浮于50mL的20mMTris-HCl缓冲液中(pH7. 9，含5mM咪唑，0. 5M NaCl)。准备20mL的镍柱， 首先用无菌水洗柱(10倍柱床体积)，流速lmL/mim，然后用上样缓冲液I (IOmM Tris-HCl, PH7.9，含0.25M NaCl)进行平衡(10倍柱床体积)，流速为lmL/min。将上述蛋白样品液以 lmL/min的速度加入到柱子中。用上样缓冲液I继续平衡(10个柱床体积)，然后分别用含有 50mM、100mM 及 400mM 咪唑的 IOmM Tris-HCl 缓冲液(pH7. 9，含 0. 25MNaCl)进行洗脱，流速为2mL/min，收集含Bt目标蛋白阶段的洗脱液，汇合后冻干。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述的Bt重组融合蛋白经高度纯化后可作为蛋白质标准物质备选物应用于蛋白质溯源研究等领域。
全文摘要
一种提高Bt杀虫蛋白在汉逊酵母中表达量的方法，本发明涉及基因工程领域，具体涉及使用一个复合增强子以实现Bt融合蛋白基因在多型汉逊酵母细胞中以组成型方式高效表达的方法，其中包括1)使用一个复合增强子以提高密码子优化后的Bt融合蛋白基因在汉逊酵母中的产量；2)采用毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子调控Bt融合蛋白基因在汉逊酵母中以组成型的方式表达；3)优化后的汉逊酵母发酵培养生长条件；4)利用纳滤及镍柱亲和层析快速提纯该重组外源蛋白的方法。而由此方法制备的Bt重组融合蛋白可作为蛋白质标准物质备选物应用于蛋白质溯源研究等领域。
文档编号G01N33/68GK102533841SQ201210030218
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月13日 优先权日2012年2月13日
发明者刘德虎, 刘树鹏, 李刚强, 王楠 申请人:中国农业科学院生物技术研究所
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