专利名称：特异结合蓖麻毒素的肽、其编码核酸以及检测和抑制蓖麻毒素的方法
技术领域：
本发明主要涉及特异结合蓖麻毒素的肽、编码它们的核酸以及检测和抑制蓖麻毒素的方法。
背景技术：
蓖麻毒素(ricin，RC)是从大戟科植物蓖麻种子中提取出的一种植物蛋白。它是植物凝集素王国中的一员，而大多数凝集素能与碳水化合物结合，并具有毒性。这些凝集素可分为两类，一类为RIP I型(ribosome-inactivating protein type I)，是单链蛋白，包括有天花粉蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白等；另一类为RIP II型，包括有相思豆毒素、蓖麻毒素、槲寄生毒素等。RIP II型的A链与RIP I型结构、作用相似，序列分析两者均有高度保守区域。蓖麻毒素属于RIP II型，由A、B两条链组成。A链有263个氨基酸，具有N-糖苷酶活性，能水解真核细胞28S rRNA第4323位上的腺嘌呤，使真核细胞60S核糖体失活而抑制蛋白质合成。B链有259个氨基酸，能与半乳糖残基相结合。A、B两条链靠二硫键连接从而形成完整的蓖麻毒素。
蓖麻毒素是最强的植物毒素之一，一分子A链一分钟之内就可使几千个核糖体失活，小鼠的LD50为约1μg/kg。由于蓖麻毒素在抑制蛋白质合成的同时，还能引起炎症反应，释放细胞因子如白介素、TNFα，以及诱导肝癌细胞合成一氧化氮合酶等，所以，蓖麻毒素还能用作药物，特别是癌症的治疗。但由于其毒性过强，限制了它的广泛应用，为此，对蓖麻毒素修饰物的研究也在不断进行，以期降低毒性作用，而保留它的抗肿瘤活性。
蓖麻毒素毒性强，难于检测，至今未发现其天然拮抗剂，因此中毒后很难救治。为此科研人员通过不同的方法对它的拮抗剂进行了研究，其中一种方法是借助计算机进行的。从蓖麻毒素的晶体衍射证明，A链形成的与核糖体RNA结合的活性部位具有一定的刚性，且只与腺嘌呤环状底物类似物如喋呤酸、间型霉素等结合，活性部位中的重要基团有Tyr80，Val81，Tyr123，Glu177，Arg180，这样为寻找蓖麻毒素的拮抗剂提供了思路。
总之，本领域需要检测和拮抗蓖麻毒素的物质和方法。因此，本发明的目的是要提供新的用于检测和拮抗蓖麻毒素的肽、编码它们的核酸、以及检测和抑制蓖麻毒素的方法。
发明内容
发明人通过噬菌体展示随机肽库技术筛选到一些新的特异结合蓖麻毒素的肽，由此完成本发明。
因此，一方面，本发明涉及一种分离的肽，其含有选自下列组的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1-12任何一个所示的氨基酸序列；(b)(a)序列的变体序列，它含有一个或多个插入、缺失、添加、或替代，并具有特异结合蓖麻毒素的活性；和(c)与(a)或(b)序列有至少90％同源性、并能特异结合蓖麻毒素的序列。
另一方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其含有选自下列组的序列(a)编码本发明的肽的核苷酸序列；(b)在中度严紧或高严紧条件下可与(a)序列杂交、并基本保持(a)序列的活性的序列；(c)(a)或(b)序列的变体序列，它含有一个或多个插入、缺失、添加、或替代，并基本保持(a)或(b)序列的活性；(d)与(a)或(b)的序列有至少约90％同源性的序列；和(e)以上序列的互补序列。
优选地，所述多核苷酸具有SEQ ID NO13-24任何一个的核苷酸序列。
本发明还涉及含有上述多核苷酸的序列的载体。优选地，本发明载体是能够表达本发明多核苷酸的表达载体。
本发明还涉及转化或转染了本发明载体的宿主细胞，例如真核细胞，如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞，和原核细胞，如大肠杆菌细胞。
本发明进一步涉及含有上述肽的融合蛋白。
本发明还涉及用于检测蓖麻毒素或抑制蓖麻毒素毒性的组合物，其含有至少一种本发明的肽。
另一方面，本发明还涉及检测蓖麻毒素的方法，包括将本发明的肽、本发明的融合蛋白和/或本发明的组合物与待测样品接触；测定本发明的肽、本发明的融合蛋白和/或本发明的组合物结合蓖麻毒素形成的复合物的量；并将该量与标准曲线进行比较，以检测待测样品中蓖麻毒素的量。
另一方面，本发明还涉及抑制蓖麻毒素毒性的方法，包括给予对象(例如，含有蓖麻毒素的样品、细胞等)有效抑制蓖麻毒素毒性量的本发明的肽(优选SEQ ID NO3、5、8、12)、本发明的融合蛋白和/或本发明的组合物。
本发明还涉及本发明的肽、本发明的融合蛋白或本发明的组合物用于检测蓖麻毒素或抑制蓖麻毒素毒性的用途。
在参考下列详述和附图后，本发明的这些和其它方面将是显然的。此处公开的所有参考文献在此均完整引用作为参考。
图1显示的是各噬菌体克隆的ELISA检测结果。图中“P/N比”表示包有蓖麻毒素孔的OD450(P)与空白对照孔的OD450(N)的比值。
具体实施例方式
这里所用术语具有本领域所公知的通用的含义。
本领域技术人员将明了，多核苷酸可以是单链的(编码链或反义链)或双链的，而且可以是DNA(基因组DNA、cDNA或合成的DNA)或RNA分子。
多核苷酸可以含有天然序列(即编码本发明肽或其部分的内源性序列)或可以含有该序列的变体、或生物学或抗原功能等同物。正如以下进一步描述的，多核苷酸变体可以含有一或多个替代、添加、缺失和/或插入，优选地，以致所编码的肽的免疫原性相对于天然肽不减少。一般可以按本文所述方法评价对该编码肽的免疫原性的影响。术语“变体”也包括异种来源的同源基因。
为了序列比较，可以采用Lasergene生物信息软件包中的Megalign程序(DNASTAR公司，Madison，WI)，利用默认参数进行序列的最佳比对。
或者，为了序列比较，可以利用以下方法进行序列的最佳比对Smith和Waterman的局部同源性算法((1982)Add.APL.Math2482)；Needleman和Wunsch的同源性比对算法((1970)J.Mol.Biol.48443)；Pearson和Lipman的相似性搜索方法((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444)；这些算法的计算机执行程序(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)；或目测。
适合于确定序列同源性和序列相似性百分数的算法的一个优选例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.253389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410。采用例如本文所述参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的多核苷酸和肽的序列同源性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。
因此，本发明包括与本文所公开序列基本同源的多核苷酸和肽序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析，描述如下)时，与本发明多核苷酸或肽序列相比含有至少50％序列同源性、优选至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同源性的那些序列。本领域技术人员将明了，考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读框的定位等，可以对这些值进行适当调整以确定两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同源性。
在其它实施方案中，本发明指向在中等严紧条件下与本文提供的多核苷酸、或其片段、或其互补序列能够杂交的多核苷酸。在分子生物学领域中杂交技术是熟知的。
“杂交”包括任何能使核酸的一条链通过碱基配对与一条互补核酸链结合的程序。因此，严格地说，该术语是指靶序列的互补序列与测试序列结合的能力，反之亦然。
典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严格同源或近严格同源的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同源性的核酸序列。
对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克�。笛槭沂植幔珻old Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。
本分明的多核苷酸一般可以通过本领域已知的任何方法制备，这些方法包括化学合成，例如固相化学合成，例如磷酸二酯法、磷酸三酯法。
在一个优选实施方案中，本发明涉及以下多核苷酸序列SEQ IDNO13-24，它们分别编码氨基酸序列SEQ ID NO1-12。
克隆号 核苷酸或氨基酸序列 序列号1CGCCGAATACTCATAAAGAGGCTGATTCGCCAGCCA (SEQ ID NO13)R R I L I K R L I R Q P(SEQ ID NO1)7AAACGGCGTCTACGAAGGAATAGGATGAGTCCCAGC (SEQ ID NO14)L R R L R R N R M S P S(SEQ ID NO2)8ACTCCAAGACACATTATTCGGAAACCGCACCAGCGC (SEQ ID NO15)T P R H I I R K P H Q R(SEQ ID NO3)9ATAAACAGACAGCGCAGTCACCTTCTTCTACATATC (SEQ ID NO16)I N R Q R S H L L L H L(SEQ ID NO4)10 AAGAGGAACCGCAGTCCAAATATTCGGATGAAGCGT (SEQ ID NO17)K K N R S P N I R M K R(SEQ ID NO5)16 AGTCGCCAGCGGCATCTTCGGCTTCTGCATAATCGA (SEQ ID NO18)S R Q R H L R L L H N R(SEQ ID NO6)17 CAGACCCATATGATACGAACTCGGCAACTGCAACGT (SEQ ID NO19)Q T H M I R T R Q L Q R(SEQ ID NO7)22 CGGAACAGGCGTCATATGAGTAGTCTACGTAGGAAG (SEQ ID NO20)R N R R H M S S L T R K(SEQ ID NO8)23 AGCACCCAGCTGAGACGTCCCCCGCAGCGGAGAAAC (SEQ ID NO21)R T Q L R R P P Q R R N(SEQ ID NO9)26 GTCCACGCATTCGGAGGACCCCAATCCGGCGTAAA(SEQ ID NO22)R P R I R R I P I R R K(SEQ ID NO10)28 AGGATTATGACTAATAGAACGCTGCAGAAGCGTACC (SEQ ID NO23)
R I M T N R T L Q K R T (SEQ ID NO11)29 AAGAAGATGCCCATTAAGCAGAGTCCACTGATGCTG (SEQ ID NO24)L L M P I L Q S P L M L (SEQ ID NO12)在本发明的其它实施方案中，可以将编码本发明肽、或其融合蛋白或其功能性等同物的多核苷酸序列或其片段用于重组DNA分子中，以指导肽在适合宿主细胞中的表达。由于遗传密码固有的简并性，可以制备编码基本上相同或功能上等同的氨基酸序列的其它DNA序列，并且可以采用这些序列克隆和表达指定的肽。
在本发明的另一实施方案中，可以将天然、修饰的、或重组的核酸序列与异源序列连接在一起以编码融合蛋白。例如，为了在肽文库中筛选肽活性的抑制剂，编码能够被商业可获得抗体识别的嵌合蛋白质可能是有用的。还可以对融合蛋白质进行改造使其在该肽编码序列和异源蛋白质序列之间含有切割位点，以便使该肽可以通过切割和纯化与该异源部分分离开。
为了表达期望的肽，可以将编码该肽或其功能性等同物的核苷酸序列插入适合的表达载体中，即该载体含有该插入编码序列转录和翻译所必要的元件。可以采用本领域技术熟知的方法构建含有编码目的肽的序列和适合的转录及翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、和体内遗传重组。这些技术描述于Sambrook，J.等(1989)分子克�。笛槭沂植幔珻old Spring HarborPress，Plainview，N.Y.；和Ausubel，F.M.等(1989)当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，纽约，N.Y.。
多种表达载体/宿主系统可以用于包含和表达多核苷酸序列。这些包括但不限于重组噬菌体、质粒、或粘粒DNA表达载体转化的细菌等微生物；酵母表达载体转化的酵母；病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
存在于表达载体中的“控制元件”或“调节序列”是指该载体的那些非翻译区域-增强子、启动子、5’和3’非翻译区-它们与宿主细胞的蛋白质相互作用以实施转录和翻译。这些元件可以在其强度和特异性方面变化。依赖于所用的载体系统和宿主，可以采用任何数量的适合转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，当克隆在细菌系统中时，可以采用诱导型启动子，例如PBLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene，La Jolla，Calif.)或PSPORT1质粒(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)的杂合lacZ启动子等。在哺乳动物细胞系统中，一般优选来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。如果需要制备含有多拷贝的肽编码序列的细胞系时，有利的是采用具有适合选择标志的基于SV40或EBV的载体。
可以在适合于表达和从细胞培养物中回收该蛋白质的条件下，培养目的多核苷酸序列转化的宿主细胞。根据该序列和/或所用的载体，重组细胞产生的蛋白质可以是分泌的或包含在细胞内。本领域技术人员将明了，可以对含有本发明多核苷酸的表达载体进行设计以含有指导该编码肽分泌通过原核或真核细胞膜的信号序列。可以采用其它的重组结构，将编码目的肽的序列与编码利于可溶性蛋白质纯化的肽域的核苷酸序列连接在一起。这些利于纯化的域包括，但不限于，允许在固定化金属上进行纯化的金属螯合肽如组氨酸-色氨酸组件、允许在固定化免疫球蛋白上纯化的A蛋白域、和用于FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp.，Seattle，Wash.)的域。
本发明在其它方面提供与编码毒素特异结合的肽、肽片断、肽变体。
本文中，肽的活性片段包括通过常规技术例如诱变、或通过添加、缺失或替代而被修饰的肽的全部或部分，但活性片段仍表现出与本文所述肽具有基本上相同的结构功能。
属于本发明的肽变体包括那些表现出与本文所公开肽有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、或更高同一性的肽。
优选地，变体含有保守替代。“保守替代”是指一个氨基酸替代具有相似性质的另一个氨基酸，以致肽化学领域的技术人员将预期该肽的二级结构和亲水性质基本上不发生改变。一般可以基于残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或双亲性质的相似性，进行氨基酸替代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；带有非荷电极性头部基团、具有相似亲水值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
肽的制备可以采用多种熟知技术中的任意一种。采用本领域普通技术人员已知的多种表达载体中的任何载体，可以容易地从上述DNA序列制备这些序列编码的重组肽。表达可以在任何一种用含有编码重组肽的DNA分子的表达载体转化或转染的适合宿主细胞中得到实现。适合的宿主细胞包括原核细胞、酵母、高等真核细胞如哺乳动物细胞和植物细胞。优选地，所用宿主细胞是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞系例如COS或CHO。首先可以采用可商业购买获得的滤器，浓缩来自将重组蛋白或肽分泌至培养基中的适合宿主/载体系统的上清液。浓缩后，可以将该浓缩物施加到适合的纯化基质例如亲和基质或离子交换树脂上。最后，可以采用一或多个反相HPLC步骤进一步纯化重组肽。
还可以通过合成手段，采用本领域普通技术人员熟知的技术，制备具有少于约100个氨基酸、一般少于约50个氨基酸的本发明肽、肽变体、融合蛋白。例如，可以采用任何一种商业可获得的固相技术，例如Merrifield固相合成法，通过将氨基酸顺序地添加到生长的氨基酸链上，合成这些肽。见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2146，1963。用于自动合成肽的仪器可从供应商例如Perkin Elmer/AppliedBioSystems Division(Foster City，CA)处购买获得，并可以按厂家说明书进行操作。
本发明还涉及用于检测蓖麻毒素或抑制蓖麻毒素毒性的组合物，其含有至少一种本发明的肽。所述组合物的其它成分一般没有特别限制，只要它们不影响蓖麻毒素的检测或抑制即可。
本发明还提供检测蓖麻毒素的方法，包括将本发明的肽、本发明的融合蛋白和/或本发明的组合物与待测样品接触；测定本发明的肽、本发明的融合蛋白和/或本发明的组合物结合蓖麻毒素形成的复合物的量；并将该量与标准曲线进行比较，以确定待测样品中蓖麻毒素的量。
例如，可将小肽标记，例如酶标，作成试剂盒，检测蓖麻毒素，同时可根据酶与底物作用显色的深浅测定蓖麻毒素的含量。
另一方面，本发明还涉及抑制蓖麻毒素毒性的方法，包括给予对象(例如，含有蓖麻毒素的样品、细胞等)有效抑制蓖麻毒素毒性量的本发明的肽、本发明的融合蛋白和/或本发明的组合物。
例如，可将小肽按照药物学的一般方法加工、配制后施用给动物，尤其是哺乳动物，例如人，防治蓖麻毒素中毒。
由于许多植物凝集素的结构、作用机理与蓖麻毒素相似，蓖麻毒素的拮抗剂也可对其他植物毒素产生拮抗。另外，许多细菌毒素如白喉毒素，假单孢杆菌毒素，霍乱毒素，志贺痢疾杆菌毒素以及炭疽毒素，它们与蓖麻毒素的结构、作用机理也非常相似，蓖麻毒素的拮抗剂的研究也为这些疾病的治疗提供了新的方法。
下面结合实施例对本发明进一步举例描述，这些实施例是非限制性的。
实施例实施例1蓖麻毒素特异性结合肽的筛选方法a.包被蓖麻毒素(RC)(由军事医学科学院六所五室提供)以10μg/100μl/孔用pH＝8.0的碳酸盐缓冲液包被于酶联板中，4℃过夜；b.封闭移去孔中的包被液，用1％明胶封闭包被孔与空白对照孔，300μl/孔，室温1h以上；c.清洗移去封闭液，用TBS-T(0.1％Tween-20)洗6次；d.结合用TBS-T(0.1％Tween-20)稀释噬菌体，每孔加入100μl(含2×1011pfu)，室温轻轻摇动孵育，时间第一循环为90min，第二循环为60min，第三循环为45min；e.清洗移去未结合的噬菌体(噬菌体表面衣壳蛋白III展示的随机十二肽库(ph.D.-12phage Peptide Library)，购自美国NewEngland Biolabs公司。肽库的滴度为1.5×1013pfu/ml，随机多样性1.9×109)，用TBS-T清洗第一循环用TBS-T(0.1％Tween-20)洗8次；第二循环先用TBS-T(0.1％Tween-20)洗5次，后用TBS-T(0.5％Tween-20)洗5次第三循环先用TBS-T(0.1％Tween-20)洗2次，后用TBS-T(0.5％Tween-20)洗10次；f.洗脱每孔加入100μl 0.2mol/L Gly-HCl(pH2.2)，室温洗脱15min；g.滴度测定和噬菌体的扩增收集洗脱液，用5μl进行噬菌体滴度的测定，剩余的扩增、纯化后重复步骤a-f进行下一轮筛选。
结果经过结合、洗涤、洗脱、扩增进行生物淘洗，每一轮筛选均以未包被RC的孔作为阴性对照，每轮筛选结束均测定噬菌体滴度，计算样品孔滴度(P)与对照孔滴度(N)的比值。这一比值可以反应出每轮筛选后与靶蛋白结合的噬菌体的富集程度。结果发现，随筛选轮次的增加，P/N值逐步增大，显示噬菌体的富集。
实施例2 ELISA检测特异性结合肽a.包板RC用碳酸盐缓冲液(pH＝8.0)稀释，包被于酶联板中，1μg/100μl/孔，4℃过夜；
b.封闭10％脱脂奶粉(PBS稀释)加入实验孔与空白对照孔200μl/孔，37℃孵育1.5h；c.清洗PBS-0.3％T清洗5次，甩干；d.结合加入噬菌体(筛选三轮后的噬菌体在含有宿主菌的培养板中培养过夜后，挑取噬菌斑、扩增所得)1μg/孔，用PBS稀释，室温轻轻振摇1h；e.清洗PBS-0.3％T清洗5次，甩干；f.加入一抗将抗M13多抗兔血清(由军事医学院三所八室制备)1:5000稀释，100μl/孔，室温孵育1h；g.清洗PBS-0.3％T清洗5次，甩干；h.加入二抗将酶标羊抗兔血清(购自中山公司)1:10000稀释，100μl/孔，室温孵育40min；i.清洗PBS-0.3％T清洗5次，甩干；j.显色加入底物显色系统A+B(现用现配)等比例混合，100μl/孔，暗室反应10-15min；ELISA显色A液NaAc 13.6g柠檬酸 1.6g30％H2O20.3ml 定容至500mlELISA显色B液EDTA 0.2g柠檬酸 0.8g甘油 50mlTMB0.2g在配置B液时，待溶质充分溶解后，按上述次序依次加入，定容至500ml。
k.终止加入H2SO4(2N)50μl/孔；l.测定OD450值。
结果(见图1)如图1所示，P为包有蓖麻毒素孔的OD450，N为空白对照孔的OD450，根据P/N的大�。〕鲇氡吐槎舅靥匾旖岷系氖删蹇寺。訮/N比大于3为阳性标准，得到阳性克隆有6，8，9，10，15，18，22，24，26，29＞5；2，3，19，20，23，27，28＞4；1，4，5，7，16，17＞3。
实施例3特异性结合肽的测序结果特异结合肽由上海博亚和上海申友生物技术公司测序。序列如下。
1 L L I R Q P(SEQ ID NO1)7L R M S P S(SEQ ID NO2)8 T P R H I I H Q R(SEQ ID NO3)10 R S P N I R (SEQ ID NO5)17 Q I I R Q S N N M(SEQ ID NO7)22 R N M S S L (SEQ ID NO8)23 R T Q I P Q (SEQ ID NO9)26 R P R I P K (SEQ ID NO10)27 R I M T N R T L T (SEQ ID NO11)9I N R Q R S H I (SEQ ID NO4)16S R Q R H L R N R (SEQ ID NO6)29 I L Q S (SEQ ID NO12)氨基酸K与R，M与L结构和性质有一定的相似型。我们可以得到两组保守序列，一组为RRX，一组为LLX或LLLX(X表示为任意氨基酸)。推测这些保守序列在结合肽与RC的结合过程中起着重要的作用。
实施例4特异性结合噬菌体克隆的细胞毒抑制实验方法a. 将不同浓度的噬菌体克隆与一定量的RC在PBS体系中共孵育，总体积20μl(RC稀释至0.0064mg/ml，1μl/管)，37℃1h；b.将Hela细胞稀释至104个/ml，50μl/孔接种于96孔板上培育2h；
c.在噬菌体克隆与RC的孵育体系中加入青链霉素(终浓度为100u/ml)后，加入酶联板上的Hela细胞中，37℃共孵育18h；d.加入MTT(噻唑蓝，市售)(5mg/ml)20μl/孔，37℃共孵育3h；e.加入10％SDS 100μl/孔，37℃孵育过夜；f.测定OD595值。
结果存活率(％)克隆号噬菌体个数 108109阴性 39.7±4.55c40.4±1.02c8 46.1±8.60c71.0±6.00a10 69.7±3.45a78.4±7.37a22 74.7±9.90a67.9±11.50b29 51.4±5.42c78.2±19.80b24 55.2±4.80b65.4±10.77b结果表示为X±S，n＝3，与对照组比较，aP＜0.01，bP＜0.05，cP＞0.05，其中对照组(只加RC)的细胞存活率为43.7±1.77实施例5GST融合蛋白10、29的细胞毒抑制实验方法a.将不同浓度的融合蛋白与一定量的RC在PBS体系中共孵育，总体积20μl(RC稀释至0.0064mg/ml，1μl/管)，37℃ 1h。
其中，融合蛋白按如下构建所采用的载体为市售的pGEX-KG，上面有编码GST的基因，将目的基因连接入GST基因的下游，融合表达于GST的C端。为了将小片段目的DNA准确连入载体中，在目的DNA的两端分别加上EcoRI和HindIII接头，并在正义链的末端加上终止密码子。将载体在EcoRI和HindIII酶切位点切开，并将复性后的双链DNA插入，形成闭环。
b.将Hela细胞稀释至104个细胞/ml，50μl/孔接种于96孔板上培育2h；c.在融合蛋白与RC的孵育体系中加入青链霉素(终浓度为100u/ml)后，加入酶联板上的Hela细胞中，37℃共孵育18h；d.加入MTT(5mg/ml)20μl/孔，37℃共孵育3h；e.加入10％SDS 100μl/孔，37℃孵育过夜；f.测定OD595。
结果存活率(％)蛋白蛋白起始量(μg) 0.01 0.1 1GST 52.5±5.70c49.2±4.12c45.9±2.34c蛋白1054.1±5.17b56.4±0.35a50.4±3.47c蛋白2954.4±3.68b62.1±0.98a63.9±5.16a结果以X±S表示，n＝3，与对照组比较，aP＜0.01，bP＜0.05，cP＞0.05对照组(只加RC)的细胞存活率为45.5±1.77
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所<120>特异结合蓖麻毒素的肽、其编码核酸以及检测和抑制蓖麻毒素的方法<130>no<160>24<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>12<212>PRT<213>合成序列<400>1Arg Arg Ile Leu Ile Lys Arg Leu Ile Arg Gln Pro
15 10<210>2<211>12<212>PRT<213>合成序列<400>2Leu Arg Arg Leu Arg Arg Asn Arg Met Ser Pro Ser1 5 10<210> 3<211>12<212>PRT<213>合成序列<400>3Thr Pro Arg His Ile Ile Arg Lys Pro His Gln Arg1 5 10<210>4
<211>12<212>PRT<213>合成序列<400>4Ile Asn Arg Gln Arg Ser Hi s Leu Leu Leu His Leu1 510<210>5<211>12<212>PRT<213>合成序列<400>5Lys Lys Asn Arg Ser Pro Asn Ile Arg Met Lys Arg1 5 10<210>6<211>12<212>PRT<213>合成序列
<400>6Ser Arg Gln Arg His Leu Arg Leu Leu His Asn Arg1 5 10<210>7<211>12<212>PRT<213>合成序列<400>7Gln Thr His Met Ile Arg Thr Arg Gln Leu Gln Arg1 5 10<210>8<211>12<212>PRT<213>合成序列<400>8
Arg Asn Arg Arg His Met Ser Ser Leu Thr Arg Lys1 5 10<210>9<211>12<212>PRT<213>合成序列<400>9Arg Thr Gln Leu Arg Arg Pro Pro Gln Arg Arg Ash1 5 10<210>10<211>12<212>PRT<213>合成序列<400>10Arg Pro Arg Ile Arg Arg Ile Pro Ile Arg Arg Lys1 5 10<210>11
<211>12<212>PRT<213>合成序列<400>11Arg Ile Met Thr Asn Arg Thr Leu Gln Lys Arg Thr1 5 10<210>12<211>12<212>PRT<213>合成序列<400>12Leu Leu Met Pro Ile Leu Gln Ser Pro Leu Met Leu1 5 10<210>13<211>36<212>DNA
<213>合成序列<400>13cgccgaatac tcataaagag gctgattcgc cagcca 36<210>14<211>36<212>DNA<213>合成序列<400>14aaacggcgtc tacgaaggaa taggatgagt cccagc 36<210>15<211>36<212>DNA<213>合成序列<400>15actccaagac acattattcg gaaaccgcac cagcgc 36<210>16
<211>36<212>DNA<213>合成序列<400>16ataaacagac agcgcagtca ccttcttcta catatc36<210>17<211>36<212>DNA<213>合成序列<400>17aagaggaacc gcagtccaaa tattcggatg aagcgt36<210>18<211>36<212>DNA<213>合成序列
<400>18agtcgccagc ggcatcttcg gcttctgcat aatcga 36<210>19<211>36<212>DNA<213>合成序列<400>19cagacccata tgatacgaac tcggcaactg caacgt 36<210>20<211>36<212>DNA<213>合成序列<400>20cggaacaggc gtcatatgag tagtctacgt aggaag 36<210>21<211>36<212>DNA
<213>合成序列<400>21agcacccagc tgagacgtcc cccgcagcgg agaaac36<210>22<211>36<212>DNA<213>合成序列<400>22cgtccacgca ttcggaggac cccaatccgg cgtaaa36<210>23<211>36<212>DNA<213>合成序列<400>23aggattatga ctaatagaac gctgcagaag cgtacc36
<210>24<211>36<212>DNA<213>合成序列<400>24aagaagatgc ccattaagca gagtccactg atgctg3权利要求
1.一种分离的肽，其含有选自下列组的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1-12任何一个所示的氨基酸序列；(b)(a)序列的变体序列，它含有一个或多个插入、缺失、添加、或替代，并具有特异结合蓖麻毒素的活性；和(c)与(a)或(b)序列有至少90％同源性、并能特异结合蓖麻毒素的序列。
2.一种分离的多核苷酸，其含有选自下列组的序列(a)编码权利要求1的肽的核苷酸序列；(b)在中度严紧或高严紧条件下可与(a)序列杂交、并基本保持(a)序列的活性的序列；(c)(a)或(b)序列的变体序列，它含有一个或多个插入、缺失、添加、或替代，并基本保持(a)或(b)序列的活性；(d)与(a)或(b)的序列有至少约90％同源性的序列；和(e)以上序列的互补序列。
3.权利要求2的多核苷酸，其具有SEQ ID NO13-24任何一个的核苷酸序列。
4.含有权利要求2的多核苷酸的序列的载体。
5.权利要求4的载体，其是表达载体。
6.转化或转染了权利要求5的载体的宿主细胞，例如真核细胞，如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞，和原核细胞，如大肠杆菌细胞。
7.含有权利要求1的肽的融合蛋白。
8.用于检测蓖麻毒素或抑制蓖麻毒素毒性的组合物，其含有至少一种权利要求1的肽。
9.检测蓖麻毒素的方法，包括将权利要求1的肽、权利要求7的融合蛋白和/或权利要求8的组合物与待测样品接触，测定权利要求1的肽、权利要求7的融合蛋白和/或权利要求8的组合物与蓖麻毒素结合形成的复合物的量，并将该量与标准曲线进行比较，以确定待测样品中蓖麻毒素的量。
10.抑制蓖麻毒素毒性的方法，包括给予对象(例如，含有蓖麻毒素的样品、细胞等)有效抑制蓖麻毒素毒性量的权利要求1的肽(优选SEQ ID NO3、5、8、12)、权利要求7的融合蛋白和/或权利要求8的组合物。
11.权利要求1的肽、权利要求7的融合蛋白或权利要求7的组合物用于检测蓖麻毒素或抑制蓖麻毒素毒性的用途。
全文摘要
本发明公开了特异结合蓖麻毒素的肽、编码它们的核酸以及检测和抑制蓖麻毒素的方法。优选地，本发明的肽具有SEQ ID NO1－12任何一个所示的氨基酸序列。
文档编号G01N33/68GK1590406SQ20041005492
公开日2005年3月9日 申请日期2004年7月8日 优先权日2003年7月8日
发明者王亚丽, 李前, 王玉霞, 邵宁生 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所
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