专利名称：用于蛋白标记的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及在分离和分析样品中的蛋白之前对其进行染料标记。本发明亦涉及由标记缓冲液、染料、分子量标志物与凝胶上样缓冲液组成的标记试剂盒。
背景技术：
用荧光染料标记蛋白已成为用于追踪和定量蛋白的选择方法。荧光标记得到好的灵敏度和宽的线性检测范围。它亦提供对蛋白染色方法的合宜备选并为比放射性标记更安全的选择。染料与标记条件的选择取决于应用。对于免疫学应用，例如抗体标记，获得高信号强度是重要的并因此优化染料/蛋白比。对于电泳，使用合适的染料/蛋白比亦是必要的，在这种情况下以获得高信号强度和窄电泳条带。此外，对于等电聚焦(IEF)电泳，使用电荷匹配的染料以不改变蛋白的等电点是必要的。用于电泳的预标记是公知的(参见例如“Electrophoresis，，，Anthony T. Andrews, Clarendon Press, Oxford, 1986)。标记蛋白中的胺(赖氨酸e -NH2基团与a -NH2 N末端基团)是常见的。使用胺反应性荧光染料来标记蛋白通常在不含伯胺的缓冲液中进行。然而，伯胺2-氨基-2-(羟甲基)-1，3_丙二醇(Tris)具有一些有吸引力的特性，例如低价格、无毒性和最优标记pH下的缓冲能力好，并因此已以低浓度在标记缓冲液中使用。例如，对于2D差异凝胶电泳(DIGE)，用10-40 mM和在某些情况下多达50mM的Tris中的染料标记已为制造商所推荐。然而，虽然使用DIGE CyDye N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯进行蛋白胺的荧光预标记已成为用于在2D电泳中定量分析蛋白的黄金标准，但是传统的考马斯染色与银染色仍被广泛用于ID电泳凝胶的分析。不存在用于ID平板凝胶的市售预标记试剂盒部分是由于现有标记方法的技术限制。一个主要的技术限制是，所有现有标记方案是耗时的，具有许多手动步骤，例如预测量蛋白的总蛋白浓度、将染料溶解于二甲基甲酰胺(DMF)或二甲亚砜(DMSO)中、改变或稀释样品以获得低缓冲强度、将样品与标记缓冲液混合以获得最优pH、调节染料与蛋白的体积至所需的蛋白/染料比、在冰上标记30分钟和标记后混合终止液。使标记所需的时间最小化是非�：弦獾�。另一个主要限制是，使用荧光来定量需要将目标蛋白的荧光信号与已知量的参照蛋白的信号比较。然而，在许多情况下标记反应高度依赖于样品内容，例如样品pH、盐、变性齐U、还原剂与洗涤剂。在反应性与扩散系数方面不同的蛋白竞争有限量的染料也是可能的。在这样的样品中，蛋白的信号反应取决于样品中不合意的其他蛋白。因此，稳健(robust)标记(即不受样品组成影响)是关键的。为了获得稳健方案，通常加入耗时的步骤，例如为了交换缓冲液或增加蛋白的浓度、为了保证标记在相同条件下进行。使由pH、温度的不同与移液误差引起的样品间偏差最小化亦是合意的。总之，强烈需要快速和稳健的标记方案以及指示标记功效的内部反应标准。发明概述
本发明提供解决上文所述的技术问题的方法和组合物。本发明人已发现，标记反应可在消耗荧光染料的化合物(称为染料反应物)的存在下进行。通过以合适染料/染料反应物比来包含具有合适反应性的染料反应物，在标记反应中控制标记反应以获得适用于例如电泳的低蛋白修饰水平是可能的。样品可为包含蛋白的任何混合物。标记反应的孵育时间可为小于5分钟且不需要预测量蛋白浓度。本发明提供用于标记、分离和定量分析蛋白的方法和组合物。尤其，本发明提供快速且允许蛋白分离后精确定量分析的标记方法。当需要高的速度和灵敏度时，该方法在分析应用中特别有用。因此，在第一方面，本发明涉及一种用于在分离样品中的蛋白之前使用包括胺反应性、硫醇反应性或羰基反应性染料在内的蛋白反应性染料来标记样品中的蛋白的方法，其包括下述步骤a)将蛋白溶解于包含染料反应物(与蛋白反应性染料反应)的标记缓冲液中、或用该标记缓冲液稀释蛋白、或用该标记缓冲液交换现有的蛋白缓冲液以形成混合物，b)将蛋白反应性染料加入所述混合物中，c)孵育所述混合物，其中所述染料对所述蛋白的标记可在10分钟内完成，其中蛋白与染料反应物两者都与所述染料形成可测量的反应产物，和d)分离所述反应产物。在一个实施方案中，与样品蛋白上的反应性基团(例如胺基、硫醇基或羰基)相比过量提供染料反应物。 测量反应产物的方式取决于所选择的蛋白反应性染料，例如如果使用荧光染料，那么测量所得到的反应产物的荧光。根据本发明的一个优选实施方案，在蛋白分离后测量染料与染料反应物的反应产物的量，并用于关联不同标记反应中标记的蛋白的蛋白信号。优选地，染料反应物是胺并选自以下胺，例如Tris、4_氨基-1-丁醇、3-氨基_1_丙醇、2_氨基-1-丙醇、2-氨基-2-乙基-1，3-丙二醇、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、2-氨基乙醇、甘氨酸、赖氨酸、丙氨酸、吗啉和咪唑。标记缓冲液的染料反应物可包含50-5000 mM Tris，优选 200-2000 mM Tris0在一个备选的实施方案中，染料反应物是包含胺的聚合物，例如多聚赖氨酸、白蛋白、抑肽酶或免疫球蛋白(IgG)。蛋白反应性染料优选为荧光染料，例如胺反应性染料。一种优选的荧光染料是花青染料。在一个十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的实施方案中，花青染料包含一个或多个使染料可溶于水的磺酸基。在一个SDS-PAGE的备选实施方案中，染料在缀合时是电荷匹配的以不改变蛋白P〗。对于IEF电泳，染料优选在缀合时是电荷匹配的以不改变蛋白Pl。染料可在DMF或DMSO中预分配。染料反应物亦可包含使得能够在分离标记的蛋白之前分离染料反应物的官能团。标记反应之后可将标记的样品与被设计用于进一步处理样品(例如电泳)的第二缓冲液混合。这样的缓冲液的一个实例是125 mM Tris-Cl pH 6. 8、4% (w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)、17% (v/v)甘油、0.1 mg/ml 溴酚蓝(BFB)和 200 mM 二硫苏糖醇(DTT)。标记缓冲液亦可包含洗涤剂并选自以下洗涤剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂(LDS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)和壬基酚聚氧乙烯醚(nonylphenol ethoxylate)(例如NP-40)。如果标记缓冲液包含阴离子洗漆剂,那么洗涤剂的浓度优选低于临界胶束浓度(cmc)。
标记缓冲液亦可包含浓度多达2 M的盐，例如NaCl。标记缓冲液亦可包含浓度多达9 M的变性剂，例如脲和硫脲。可将样品在标记之前用还原剂(例如DTT或三(2-羧乙基)膦(TCEP))和任选烷基化试剂(例如碘乙酰胺(IAA))预处理以断开蛋白二硫桥。在第二方面，本发明亦涉及用于标记蛋白的试剂盒，其包括标记缓冲液、染料、分子量标志物和凝胶上样缓冲液。标记缓冲液可包含胺(例如Tris)和任选盐(例如NaCl)和任选洗涤剂(例如SDS)和任选变性剂(例如脲)。标志物用于电泳后的分子量测定。上样缓冲液可包含Tris-Cl、SDS、甘油、示踪染料和任选还原剂(例如DTT)。本发明提供用于在分离样品中的蛋白之前标记样品中的蛋白的储存稳定试剂盒，其包括标记缓冲液、在无水有机溶剂(例如DMF或DMS0)中预分配的荧光染料、分子量标志物和凝胶上样缓冲液。试剂盒具有至少6个月的储存期。除了快速标记外，本发明的新方法具有多个优势。第一，选择染料反应物的反应性和染料/染料反应物比以获得所需水平的蛋白修饰。在低蛋白浓度，染料/染料反应物比控制蛋白修饰的水平。这允许 基于将固定量的染料与低到亚ng/W浓度水平的不同浓度的蛋白样品混合的稳健方法。尽管在标记反应中染料/蛋白比高，染料反应物的竞争反应还是得到蛋白的受控修饰，我们获得不具有条带变宽或条带移位的窄蛋白条带和荧光信号对蛋白量的线性反应曲线。因此，如果制作了用于定量的校正曲线，那么在标记之前预测量蛋白浓度不是必要的。第二，选择染料反应物的反应性和染料/染料反应物比以使蛋白对染料竞争最小化。第三，染料反应物具有允许分离并随后测量染料-染料反应物复合物的荧光信号的物化特性。该信号充当标记反应的内部对照，并与目标蛋白的荧光信号比较。因此，该方法对温度和PH的微小差异不灵敏。染料反应物可为在用于标记的最优pH下具有高缓冲能力的化合物。这允许较宽范围的样品组成。较高的缓冲能力在大多数情况下允许标记之前用标记缓冲液直接稀释样品。如上所述，可将蛋白样品用包含使蛋白溶解和变性的洗涤剂、胺缓冲液和任选盐(例如NaCl)的标记缓冲液稀释。标记缓冲液亦可包含变性剂，例如脲和/或硫脲。任选地，将样品蛋白缓冲液交换为标记缓冲液。将染料加入标记缓冲液的蛋白中，标记反应可在室温在5分钟内完成。加入用于电泳的上样缓冲液以还原蛋白，上样缓冲液由SDS、甘油、示踪染料、Tris-Cl缓冲液和任选DTT组成。该上样缓冲液可用于水平和垂直凝胶电泳两者。将混合物任选加热3-5分钟以使蛋白完全变性。然后将样品装载于凝胶上。很少的步骤和快速的方案使得该方法与染色后技术相比为较快的备选。附图简述
图1显示用Cy 5标记的低分子量(LMW)标志蛋白的扫描图像，使用100 mM碳酸氢盐缓冲液(A, C) pH 8. 5或300 mM Tris-Cl pH 8.5 (B，D)标记缓冲液。标记在5分钟(A,B)和30分钟(C，D)内完成。两种标记缓冲液都包含0. 1% SDS (w/v) 0图2显示使用每50 Mg蛋白325 pmol的固定染料/蛋白比的标记方案⑷或变化染料/蛋白比的方案(B)的比较。样品是用Cy5标记的LMW蛋白。标记在具有0. 1% SDS(w/v)的 120 mM Tris-Cl, pH 8. 5 中进行。图3显示Tris缓冲液如何在标记反应中降低蛋白对染料的竞争。这通过以下步骤来观察使用标记缓冲液中的30或300 mM Tris，将乳球蛋白(LG)加入牛血清白蛋白(BSA)样品中并测量标记后BSA Cy5信号的下降。图4显示在12% Tris-甘氨酸凝胶上运行的Cy5预标记的HeLa UV辐射的细胞裂解物(约 24 吒)(A)。将细胞裂解物在 300 mM Tris-Cl pH 8. 5,0. 2 M NaCl 和 0. 1% SDS(w/v)中标记。然后将样品转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜并进行蛋白质印迹分析。在探测期间，应用来自小鼠的第一抗体P-ERK单克隆Ab，然后应用Cy 3山羊抗小鼠抗体(第二Ab)。将PVDF膜在Cy5 (B)和Cy3 (C)中扫描。在Cy5图像中看到细胞裂解物并在Cy3图像中检测到探测的磷酸化蛋白。图5 和图 6 显示 DMSO 和 DMF 中的 Cy5 NHS 酯(PA15101 GE Healthcare)在 8 个月的时间段内对于冷冻储存和冷藏储存均是稳定的。在DMSO中新鲜制备参照样品，并在标记反应中使用相同量的染料和蛋白来评价标记功效。在300 mM Tris-Cl pH 8. 5,0. 2 MNaCl和0. 1% SDS (w/v)中标记LMW标志物。对于低分子量标志物中的各蛋白，一式三份的平均Cy5信号强度(图6中)显示，与参照样品相比，冷藏储存(4°C -8°C )的标记功效轻微降低但冷冻(_20°C )储存的功效未降低。发明详述
一些标记方法需要在标记之前测定总蛋白浓度。该步骤的理由是太低的蛋白和染料浓度导致差的标记和低信噪比。应该选择染料/蛋白比，使得为了灵敏度尽可能最高，在不引起条带变宽或额外的条带的情况下，与荧光染料反应的蛋白残基部分应该尽可能高。然而，预测定蛋白浓度不仅耗时费力，而且目前使用的用于测定蛋白浓度的方法(2D Quant试剂盒，Bradford，基于UV和双缩脲的方法)不关联样品的胺含量。样品的氨基酸组成可在宽范围内不同，取决于样品 中存在的主要蛋白的组成。基于SwissProt统计，平均蛋白包含5. 2%的赖氨酸残基，但是高迁移率蛋白I和4 (HMG-1和HMG-4)包含20. 1%的赖氨酸，而胃蛋白酶A和胃蛋白酶原C的赖氨酸含量为零或接近零。基于用UV、Bradford或双缩脲的方法测定的蛋白浓度来定量给予CyDye NHS酯的量将不引起可结合染料的氨基残基部分的合理控制。根据不同的样品组成，由特定蛋白产生的信号强度可在宽范围内变化。结果是，样品的胺含量与加入的CyDye NHS酯的量之间经常不是最优关系。因此，移除标记之前的蛋白浓度的测量是合意的。本发明的方法除去标记之前测定蛋白浓度的需要，并使蛋白对染料的竞争最小化，与只基于固定染料/蛋白比的标记方法相比，其得到更稳健和可重现的方法。当应该比较不同组成的样品中存在的类似或相同的蛋白浓度时，该方法构成理想的方法。在另一实施方案中，在标记之前测定用于标记的可得赖氨酸的浓度，例如使用荧光胺或TNBS (2，4，6-三硝基苯磺酸)测定，并视需要调整染料的量。标记后，使用包括但不限于电泳、层析、免疫测定和质谱的技术来分离标记的蛋白和/或蛋白片段。通过提供多达IO5的宽动态范围的荧光扫描仪或成像仪(例如GEHealthcare的Typhoon 扫描仪)来检测突光信号。另一实施方案提供显著降低从标记至装载样品到用于电泳的凝胶上的时间的试剂盒和方法。这部分通过将标记反应时间从冰上30分钟减少至室温30秒来实现。染料反应物的加入除去使用传统终止液的需要。反而在标记后将标记的样品与上样缓冲液直接混合。试剂盒亦为使用者提供预分配的染料以与标记缓冲液中的蛋白样品直接混合。传统上包装和出售干的荧光染料，使用者在标记之前加入有机溶剂。然而，我们发现染料可在无水DMSO或DMF中冷储存，储存长时间具有全部标记活性。这省去标记之前必须将染料在DMSO或DMF中复溶的步骤。优选使用DMS0，因为它是无毒的有机溶剂。在另一实施方案中，在过量的消耗主要部分的染料的含胺化合物存在下蛋白样品与CyDye NHS酯的反应亦可用于样品蛋白含量的非�？焖俸土槊舻牟舛āＫ枰氖且恢挚焖俸图虻サ慕佑蠧yDye标签的蛋白与得自加入的胺和染料NHS酯的反应的化合物分离的方法。一种简单的解决方案是使用包含可用于在柱上俘获或类似的官能团的伯胺。该方法应该对DIGE实验之前的蛋白测定理想，因为它测量样品中的反应性赖氨酸的含量。在另一实施方案中，将蛋白用胺反应性荧光染料标记。将具有反应性氨基的染料反应物加入标记混合物中。随后从蛋白中分离反应物并检测染料-反应物复合物。将荧光信号强度与蛋白信号比较。染料反应物可为但不限于蛋白(例如抑肽酶)或胺(例如Tris)。在一个实施方案中，用于SDS-PAGE的标记可用水溶性磺化染料完成。因此，染料可以干形式或在有机溶剂中定量给予，顾客不需要在标记之前加入DMF或DMSO以使染料复溶。在另一实施方案中，将电荷匹配的染料用于标记蛋白而不改变用于IEF电泳和SDS-PAGE两者的蛋白的pi。在另一实施方案中，将蛋白用胺反应性荧光染料标记。将具有反应性氨基的染料反应物加入标记混合物中。反应物是缓冲化合物并维持标记混合物的pH在7-11之间。在又一实施方案中，反应物维持PH在8-9之间。在SDS电泳的另一实施方案中，除了具有合适反应性的氨基外，染料反应物还具有带正电荷的基团，以便确保反应物以及反应物与染料之间的反应所形成的产物在样品施用后被运送至阴极。该组合物在其中使用碱性施用物(basic application)的IEF应用之前应该亦是合适的。在SDS电泳的另一实施方案中，包含磺酸基的染料将得到带负电荷的反应产物，染料-反应物产物将朝着阳极在前面被运送，这允许在扫描之前测量染料-反应物信号或使染料-反应物能够离开凝胶。在IEF电泳的另一实施方案中，将电荷匹配的染料用于标记蛋白而不改变蛋白的Pl0将样品施用在阳极侧以避免干扰，染料-反应物产物应该朝着阳极被运送。为了确保这点，染料反应物需要包含反应性氨基和最少两个酸基。两个可能的实例是天冬氨酸和谷氨酸。 在一个实施方案中，标记缓冲液包含NaCl以使样品盐对标记反应的作用最小化。我们已发现盐离子可影响标记反应。例如，使用磺化、带负电荷、单反应性的Cy5 NHS酯时，向标记缓冲液中加入NaCl对于一些蛋白增加每克的Cy5信号。我们亦发现可在标记缓冲液中加入多达0.5 M的NaCl而不影响随后的电泳。标记缓冲液中包含NaCl将在一些情况下使得标记更稳�。丛谟帽昙腔撼逡合∈褪倍匝返淖畛跹闻ǘ炔涣槊�。本文使用的术语“染料反应物”指能够与荧光染料形成共价键的化合物。选择使用的化学品使得消耗CyDye NHS酯的过量反应物和反应物与NHS酯之间的反应得到的产物两者都不干扰电泳分离。
实验部分
材料
Cy5 :通过将单反应性 Cy5 NHS 酯(PA15101 GE Healthcare)或 Cy5-DIGE NHS 酯(258010-85 GE Healthcare)以 0. 1-1 mg/ml 的浓度溶解于无水 DMF (227056 Sigma)或无水DMSO (276855 Sigma)中来制备Cy5原液。样品将低分子量(LMW)标志蛋白试剂盒(17-0446-01 GE Healthcare)、乳白蛋白(L5385 Sigma Aldrich)和牛血清白蛋白(A7638 Sigma-Aldrich)溶解于憐酸缓冲盐水(PBS)缓冲液中或直接溶解于标记缓冲液中。HeLa裂解物和p-ERK (SC 7383)来自SantaCruz Biotechnology。2x 上样缓冲液使用 0. 125 M Tris-Cl pH 6. 8,4% (w/v) SDSU7. 4% (v/v)甘油、0.1 mg/ml BFB和0.2 M DIT的溶液。化学品tris、甘油、SDS、BFB和DIT来自GEHealthcare。电泳根据说明书，将SDS-PAGE 凝胶 PhastGel 、ExcelGel 和 Genegel 在Multiphor TM、PhastSystem 和GenePhor电泳装置上运行。根据说明书，将12% tris-甘氨酸凝胶(EC60055Box,来自 Invitrogen, Life Technologies)在MiniVE 垂直电泳系统上运行。使用Typhoon 扫描仪来扫描凝胶并在一些情况下随后用考马斯后染色用于比较。蛋白质印迹根据说明书，将TE 22 Mini tank transfer unit 和 Amersham Hybond 印迹纸用于蛋白质印迹。标记方案1.将蛋白溶解于标记缓冲液中，或将蛋白用标记缓冲液稀释。2.将染料加入蛋白混合物中。孵育30秒-10分钟的时间。当平行标记若干个样品时，使用5-10分钟的时间间隔。3.将样品与2x上样缓冲液以等体积混合。4.在95°C将样品加热3-5分钟(任选)。5.将样品施用到电泳凝胶上。若需要，可在标记之前将蛋白样品的缓冲液交换为标记缓冲液，例如使用凝胶过滤或透析。将样品在步骤4后任选用碘乙酰胺(IAA)处理以使电泳之前或期间的蛋白再氧化所引起的条带变宽最小化。实施例1 :Tris作为染料反应物
本发明人已发现Tris可在标记缓冲液中以高浓度使用，参见图1-6。与不含胺的缓冲液例如碳酸氢盐比较，在标记缓冲液中使用Tris引起蛋白Cy5信号下降和靠近电泳前端的Cy5-Tris复合物的可测量信号(由图1中的箭头所示)。因此可将无蛋白结合的Cy5信号用作标记反应的内部标准。将低分子量标志蛋白在100 mM碳酸氢盐缓冲液(A，C) pH 8.5和300 mM Tris-Cl pH 8. 5缓冲液(B，D)中标记5分钟(A, B)和30分钟(C，D)。两种缓冲液都包含0.1% SDS (w/v) 将蛋白随后与上样缓冲液混合并在电泳凝胶上分离。Cy5扫描图像显示，两种缓冲液的条带模式是非常相似的。5分钟与30分钟的Cy5信号模式相比没有不同，说明标记反应在5分钟内完成。图2显示两种标记方案的比较使用每50呢蛋白325 pmol的固定染料/蛋白比的方案(A)和变化染料/蛋白比的方案(B)。使用5分钟标记时间，标记在具有0.1% (w/V) SDS的120 mM Tris-Cl pH 8. 5中进行。对于B系列，标记反应中的蛋白浓度变化于0.1ng/W-2. 0 |ag/|al，在10 W的反应体积中使用固定量的325 pmol染料。尽管高的染料/蛋白比，但用控制的蛋白修饰水平来标记蛋白还是可能的。这由以下事实所证明尽管高的理论染料/蛋白比，但凝胶上的位置中还是没有条带变宽或可检测的移位，这说明染料的水解和/或Tris与染料的副反应与蛋白标记反应竞争。此外，标记方案允许使用校正曲线来精确定量。图2显示线性乳白蛋白Cy5信号对标记反应中的总蛋白浓度。乳白蛋白的量与总蛋白量(以重量计)的比是常数，大约1/5。因此，本方案除去预测定蛋白浓度的需要。使用12. 5%聚丙烯酰胺凝胶和凝胶上6 W的上样体积，检测限为亚ng。在标记反应中蛋白竞争染料是可能的。然而，高的Tris浓度减少蛋白对染料的竞争。图3显示通过将乳球蛋白(LG)加入牛血清白蛋白(BSA)样品中并测量标记后BSA Cy5信号的下降来观察蛋白对染料的竞争。在标记系列中保持Cy5与BSA的量不变，并向BSA中过量(9倍的重量)加入LG。图1 (左)显示在300 mM (泳道A和B)和30 mM (泳道C和D) Tris-Cl pH 8.5中标记的4个样品的Cy5扫描图像。300 mM Tris标记缓冲液显著降低蛋白竞争并得到更精确的LG/BSA比(约10)。在PhastGels 8-25%和GeneGels 12. 5%两者上运行一式三份的样品，来自BSA的考马斯信号的相对标准偏差(N=24)是8%。本实验显示，如果使用高浓度的Tris，那么蛋白对Cy5染料的竞争减少。在标记反应中使用0. 1-1呢/耵的蛋白浓度和0. 5-5 nmol范围的Cy5量且反应体积为80 W，观察到蛋白竞争减少。当标记复杂的样品(例如细胞裂解物)时，标记缓冲液中的高Tris浓度亦是理想的。标记缓冲液(300 mM Tris-Cl pH 8. 5,0. 2 M NaCl和0. 1% w/v SDS)的高缓冲能力允许标记之前容易混合样品与标记缓冲液。图4显示HeLa裂解物的有效且快速标记的结果，其允许使用荧光扫描仪来定量检测膜上的靶蛋白P-ERK和总蛋白含量。实施例2 3~氨基-1-丙醇作为染料反应物
在本实施例中，在标记反应中将3-氨基-1-丙醇以1-300 mM浓度用作染料反应物。标记的蛋白￠-乳球蛋白、牛血清白蛋白和牛碳酸酐酶都被检测到具有好的信噪比。染料反应物胺与CyDye NHS酯 之间的反应产物为带负电荷的，并在SDS-PAGE期间朝着阳极被运送。此外，在标记反应中测试了许多不同的小胺，包括2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、
2-氨基-2-乙基-1，3-丙二醇、2-氨基乙醇和吗啉，其引起来自蛋白以及染料与胺的反应产物两者的可检测信号。
_4] 实施例3 :淀粉酶蛋白作为染料反应物
在本实施例中，与革巴LMW蛋白相比,蛋白淀粉酶在标记反应中过量存在。保持标记反应中的淀粉酶和Cy5的量不变，变化LMW蛋白的量。可容易检测到LMW蛋白与淀粉酶两者，且LMW蛋白没有干扰性条带变宽。淀粉酶蛋白的信号可用于关联不同标记反应中标记的靶蛋白的信号。实施例4 :在DMSO中预分配染料的预标记试剂盒
本发明人已发现，当在无水有机溶剂(例如DMS0)中溶解并在冷冻机中冷储存时，Cy5NHS酯是非常稳定的。图5和图6显示，Cy5 NHS酯可在冷冻机(_20°C )中储存超过8个月并仍显示全部标记功效。该发现允许蛋白标记试剂盒中的新的染料制剂。这些实施例显示，在标记缓冲液中使用高浓度的染料反应物(在这些实施例中为反应性胺)可进行快速标记。在标记缓冲液中使用高浓度的胺可获得若干个重要优点，包括
由于更好的缓冲能力，容易稀释样品以获得用于标记的最优PH 由于蛋白对染料的较少竞争，精确定量蛋白 标记反应后没必要使用具有染料反应物的分离终止液
由于匹配凝胶缓冲液(通常为375 mM Tris)的导电性较好,标记后不需要改变缓冲液。此外，发明人发现一种除去标记之前预测量总蛋白浓度的需要的标记方案。使用固定量的染料/反应和染料反应物以控制可用于蛋白标记的染料的量，获得窄条带和不移位的条带位置以及针对样品的宽范围蛋白浓度(亚ng/W-呢/耵)的线性反应曲线(信号对蛋白量)是可能的。
本发明亦涉及一种用于在电泳之前预标记蛋白的新的试剂盒，其包含具有染料反应物的标记缓冲液、储存稳定的染料、分子量标志物和凝胶上样缓冲液。
权利要求
1.用于在分离样品中的蛋白之前使用蛋白反应性染料来标记样品中的蛋白的方法，其包括下述步骤a)将蛋白溶解于在包含染料反应物(与蛋白反应性染料反应)的标记缓冲液中、或用该标记缓冲液稀释蛋白、或用该标记缓冲液交换现有的蛋白缓冲液以形成混合物，b)将蛋白反应性染料加入所述混合物中，c)孵育所述混合物，其中所述染料对所述蛋白的标记可在10分钟内完成，且其中蛋白与染料反应物两者都与所述染料形成可测量的反应产物，和d)分离所述反应产物。
2.权利要求1的方法，其中所述蛋白的标记在5分钟内完成。
3.权利要求1或2的方法，其中所述蛋白的标记在30秒内完成。
4.上述权利要求中一项或多项的方法，其中与样品蛋白上的反应性基团相比过量提供染料反应物，所述反应性基团例如胺基、硫醇基或羰基。
5.上述权利要求中一项或多项的方法，其中在蛋白分离后测量染料与染料反应物的反应产物的量并用于关联不同标记反应中标记的蛋白的蛋白信号。
6.上述权利要求中一项或多项的方法，其中所述染料反应物是胺并选自以下胺，例如Tris、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、2-氨基-1-丙醇、2-氨基-2-乙基_1，3-丙二醇、4-氨基-1- 丁醇、3-氨基-1-丙醇、2-氨基乙醇、甘氨酸、赖氨酸、多聚赖氨酸、丙氨酸、吗啉和咪唑。
7.上述权利要求中一项或多项的方法，其中所述染料反应物是Tris且所述标记缓冲液包含 50-5000 mM Tris，优选 200-2000 mM Tris0
8.上述权利要求中一项或多项的方法，其中所述蛋白反应性染料是荧光染料，例如花青染料。
9.权利要求8的方法，其中所述染料是包含使染料可溶于水的磺酸基的花青染料。
10.权利要求8的方法，其中所述染料在缀合时是电荷匹配的以不改变蛋白pi。
11.上述权利要求中一项或多项的方法，其中所述染料被分配于DMF或DMSO中，且每个标记反应使用固定量的染料。
12.上述权利要求中一项或多项的方法，其中所述染料反应物是不同于样品中的蛋白的包含胺的蛋白，例如白蛋白、抑肽酶或I gG。
13.上述权利要求中一项或多项的方法，其中所述染料反应物亦具有使得能够在分离标记的蛋白之前分离染料反应物的官能团。
14.上述权利要求中一项或多项的方法，其中所述标记反应之后是将标记的样品与被设计用于进一步处理样品例如电泳的第二缓冲液混合。
15.上述权利要求中一项或多项的方法，其中所述标记缓冲液亦包含洗涤剂并选自以下洗涤剂，例如SDS、十二烷基硫酸锂(LDS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)和壬基酚聚氧乙烯醚。
16.上述权利要求中一项或多项的方法，其中所述标记缓冲液亦包含亚cmc浓度的阴离子洗涤剂例如洗涤剂SDS和LDS和/或浓度多达2 M的盐例如NaCl。
17.上述权利要求中一项或多项的方法，其中所述标记缓冲液亦包含变性剂，例如浓度多达9 M的脲和硫脲。
18.上述权利要求中一项或多项的方法，其中将所述样品在标记之前用还原剂例如DTT或三(2-羧乙基)膦(TCEP)和任选烷基化试剂例如IAA预处理以断开蛋白二硫桥。
19.用于在分离样品中的蛋白之前标记样品中的蛋白的试剂盒，其包括具有染料反应物的标记缓冲液、蛋白反应性染料、分子量标志物和凝胶上样缓冲液。
20.权利要求19的试剂盒，其中所述染料是在无水有机溶剂例如DMF或DMSO中预分配的储存稳定的荧光染料。
21.权利要求19的试剂盒，其中所述染料是水溶性的并以干形式预分配。
22.权利要求19-21中一项或多项的试剂盒，其中所述染料在标记时不改变蛋白的pi。
23.权利要求19-22中一项或多项的试剂盒，其中所述标记缓冲液包含高浓度的染料反应物，例如浓度为200-2000 mM的Tris。
24.权利要求19-23中一项或多项的试剂盒，其中所述标记缓冲液包含与待标记的蛋白不同的蛋白染料反应物，例如白蛋白或抑肽酶。
25.权利要求19-24中一项或多项的试剂盒，其中标记后标记缓冲液与上样缓冲液代替分离终止液。
全文摘要
本发明涉及一种用于在分离样品中的蛋白之前使用蛋白反应性染料来标记样品中的蛋白的方法，其包括下述步骤a)将蛋白溶解于包含染料反应物(与蛋白反应性染料反应)的标记缓冲液中、或用该标记缓冲液稀释蛋白、或用该标记缓冲液交换现有的蛋白缓冲液以形成混合物，b)将蛋白反应性染料加入所述混合物中，c)孵育所述混合物，其中所述染料对所述蛋白的标记可在5分钟内完成，且其中蛋白与染料反应物两者都与所述染料形成可测量的反应产物，和d)分离所述反应产物。本发明亦涉及一种用于预标记蛋白的试剂盒，其包括标记缓冲液、染料、分子量标志物和凝胶上样缓冲液。
文档编号G01N33/68GK103038246SQ201180025870
公开日2013年4月10日 申请日期2011年5月24日 优先权日2010年5月27日
发明者B.毕尔奎斯特, E.毕内尔德, R.帕尔姆格伦 申请人:通用电气健康护理生物科学股份公司
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